Name: 微流控芯片的制备及方法检测甲型流感 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 学习微流控芯片制备及甲型流感病毒检测方法，掌握核酸提取、逆转录和PCR扩增的集成操作流程。该技术可直接处理原始患者样本，实现快速高效的分子诊断。

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本研究获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目R01 EB008268的资助。

1. 芯片制备12
<ol>
 <li>使用Zeonex 690R颗粒制备两块板材：将8–9克Zeonex颗粒均匀分布在金属板中央，置于加热压机中于198 °C预热5分钟，然后缓慢加压至2,500 psi，持续5分钟。本步骤使用Carver热压机完成。</li>
 <li>使用环氧树脂模具在板材上压印微流控通道。模具制备细节见其他文献12（通道设计见图2b）：将一块板材置于环氧模具上，在加热压机中于157 °C预热10分钟，然后缓慢加压至1,000 psi，持续10分钟。在板材冷却前用手或镊子将其从模具中取出。（注意：此步骤需佩戴耐热手套。）</li>
 <li>在压印后的芯片上钻孔，位置分别为微流控通道的入口、废液口和出口。我们使用直径为1.25 mm的钻头钻出这三个孔。</li>
 <li>将压印后的芯片与另一块板材（上层）键合：依次用异丙醇（IPA）、RNAse Away和去离子水清洗芯片；风干后在加热压机中于131 °C预热10分钟，然后在350 psi压力下压合10分钟。</li>
 <li>使用J-B Weld环氧树脂将Nanoport分别安装在入口、废液口和出口端口；根据制造商说明固化15至24小时。</li>
 <li>用50 μl RNAse Away冲洗SPE通道，随后用100 μl无核酸酶水冲洗。</li>
 <li>向SPE通道中加载4 μl接枝溶液（含3% w/v苯甲酮的甲基丙烯酸甲酯），然后在365 nm紫外光、2,000 mJ/cm2条件下于紫外烘箱中孵育10分钟，使甲基丙烯酸酯交联。用真空泵去除残留的接枝溶液。我们使用壁式真空泵。为获得最佳效果，应使用新鲜配制的溶液。然而，通常可将配制好的溶液在4 °C保存最多一周。</li>
 <li>配制SPE柱溶液（均为体积百分比v/v %）：16% 二甲基丙烯酸乙二醇酯、24% 丁基丙烯酸甲酯、42% 1-十二醇、18% 环己醇，并加入1% 2-二甲氨基-4-(甲基-苯基氨基)-苯酚作为光引发剂。</li>
 <li>取与SPE柱溶液体积相等的二氧化硅微球溶液（以形成1:1混合物），在真空烘箱中70 °C下过夜完全干燥。盖紧管盖后轻敲管壁使颗粒松散。将SPE柱溶液加入干燥的二氧化硅微球管中，涡旋混匀。</li>
 <li>将4 μl SPE溶液加载至同一通道中，然后在紫外光下照射2.5分钟进行交联。随后将芯片翻转，再照射2.5分钟。聚合后的SPE柱应呈不透明白色固体。</li>
 <li>用500 μl 100%甲醇冲洗通道，以去除过量反应物。该冲洗步骤还可去除聚合物内部的致孔溶剂，从而使SPE柱在常温干燥后形成开放的孔隙结构。</li>
 <li>使用导热胶带将两个薄膜加热器固定在芯片底部。加热器的两侧需分别与用于变性和退火的宽通道边缘对齐（见图1）。</li>
 <li>通过每个芯片末端封闭的侧通道插入五根热电偶（见图2b）。热电偶通过过盈配合固定在这些通道中，并使用胶带进一步固定其位置。</li>
</ol>
2. 固相萃取方法
<ol>
 <li>使用经DEPC处理并高压灭菌的水（去离子水或Millipore过滤水）配制96 μl的70%乙醇。</li>
 <li>在一个离心管中，将4 μl的25X RNA Secure加入96 μl的70%乙醇中；在另一个离心管中，用100%乙醇配制相同的混合液。</li>
 <li>通过混合以下组分配制300 μl通道缓冲液：75 μl的6 M硫氰酸胍（GuSCN）、150 μl的2-丙醇、63 μl无核酸酶水以及12 μl的25X RNA Secure。</li>
 <li>通过混合以下组分配制312 μl裂解缓冲液：100 μl的6 M硫氰酸胍（GuSCN）、200 μl的2-丙醇以及12 μl的25X RNA Secure。</li>
 <li>将70%乙醇、100%乙醇、通道缓冲液和裂解缓冲液在60 °C下加热10–20分钟，以激活RNA Secure。</li>
 <li>为平衡微流控通道，以0.8 ml/hr的流速将通道缓冲液通过固相萃取（SPE）通道。</li>
 <li>将VTM中的待测样本在37 °C水浴中快速解冻，一旦完全解冻立即从水浴中取出样本。</li>
 <li>以13,000 rpm离心样本10分钟，转移100 μl上清液至300 μl裂解缓冲液中，并加入6 μl浓度为1 μg/μl的载体RNA，混匀。</li>
 <li>涡旋混匀后，短暂离心5秒，将全部裂解物加载至一支Luer-lok 1 cc注射器中。</li>
 <li>以0.8 ml/hr的流速将裂解物通过SPE通道。</li>
 <li>以1 ml/hr的流速先用100 μl的70%乙醇洗涤SPE通道，再用100 μl的100%乙醇洗涤。（由于注射器尖端存在50 μl的死体积，无法完全推出液体，因此实际通过通道的液体仅为50 μl。）</li>
 <li>将一个空注射器置于0.5 ml刻度位置，以1 ml/hr的流速向通道中推入空气，以干燥通道。</li>
 <li>以0.5 ml/hr的流速将67.5 μl无核酸酶水通过通道，以洗脱结合的核酸，并从废液端的nanoport处收集13.5 μl洗脱液。（液体损失是由于注射器尖端和SPE通道中共有54 μl的死体积所致。）</li>
</ol>
3. 逆转录 PCR
<ol>
 <li>在空气干燥步骤（2.12）期间，使用Qiagen OneStep RT-PCR试剂盒中的试剂配制36.5 μl的RT-PCR预混液。</li>
 <li>将RT-PCR试剂加载至废液端口的nanoport中，并与RNA混合，配制成以下50 μl RT-PCR反应体系：13.5 μl无核酸酶水中的洗脱RNA，4 μl RT-PCR酶混合液，10 μl Q溶液，10 μl 1X OneStep缓冲液，2 μl 25 mM MgCl2，1 μl 50 μM 正向引物 5'-GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C-3'，1 μl 50 μM 反向引物 5'-AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3'，2 μl dNTP，0.75 μl 1.0% w/v BSA，0.73 μl PEG8000，以及5.02 μl无核酸酶水。</li>
 <li>通过轻柔抽吸（我们使用壁式真空泵）将RT-PCR混合液加载至RT通道中，并用封闭接头密封Nanoport。</li>
 <li>向加热器1施加35 V电压。当加热器1在50 °C达到平衡后，使试剂在RT通道中保持30分钟。当加热器1在95 °C达到平衡后，使试剂在RT通道中再保持15分钟。</li>
 <li>向加热器1施加27 V电压，向加热器2施加50 V电压，等待约三分钟，或直至加热器1在60 °C达到平衡且加热器2在95 °C达到平衡。</li>
 <li>以0.5 μl/min的流速将试剂推入PCR通道。试剂流经蛇形通道约需20分钟。</li>
 <li>当样品到达蛇形通道末端时，使用适当规格的移液器和吸头从出口处收集PCR产物。</li>
</ol>
4. PCR 产物检测
<ol>
 <li>我们使用安捷伦高灵敏度DNA检测试剂盒检测产物。进行检测前30分钟，从冰箱中取出安捷伦高灵敏度DNA试剂盒。</li>
 <li>打开生物分析仪并启动2100 Expert软件。</li>
 <li>将1 μl的PCR产物加入检测卡中，并按照安捷伦操作指南（<a href="http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent%20Manual.pdf" target="_blank">http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent%20Manual.pdf</a>）进行操作。</li>
 <li>分析并记录数据。</li>
</ol>

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<li>Andreasen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+microRNA+quantification+in+total+RNA+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples.</a> Methods. 50, S6-S9 (2010).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

本文介绍的诊断方法展示了集成式微流控塑料芯片能够以高特异性和低检测限从患者样本中扩增甲型流感病毒RNA。13 我们设计该芯片旨在用于潜在的即时检测：（a）简化了温度与流体控制，（b）芯片成本低，适用于通过注塑成型进行高通量制造，（c）芯片为一次性使用，可弃置，从而降低样本交叉污染的风险。
尽管我们目前的芯片运行时间为3小时，但我们的提取平台在流程优化方面仍有很大空间。例如，可在洗脱前通过提高流速和减少洗涤体积相结合的方式，缩短洗涤和干燥时间。此外，通过简化芯片制造工艺，并用一次性注射泵和小型电池组等替代品取代昂贵或笨重的外设（如注射泵和电源），可进一步降低成本。扩大固相萃取柱的几何结构和孔隙率，将显著降低对泵送设备的要求。同时，一旦芯片设计标准化并适用于大规模生产，设备研发过程中使用的许多热电偶也将被取消。
与其他因素相比，芯片上流感检测模块的稳健性更依赖于良好的温度控制和适当的样本处理。芯片上温度轻微偏离设定值，以及流感样本意外经历多次冻融循环，均可能导致最终PCR扩增产量降低。除上述因素外，不同患者样...

20世纪的三次流感大流行已报告数百万例死亡1。此外，世界卫生组织（WHO）于2009年宣布了最近一次流感大流行2，截至2010年8月1日，世界卫生组织报告了18,449例死亡3。此次大流行再次表明传染病带来的沉重负担，以及快速、准确检测流感以实现疾病快速确诊、采取适当的公共卫生应对措施和有效治疗的必要性4。
目前有多种方法被广泛用于流感的诊断，包括快速免疫检测、直接荧光抗原检测（DFA）和病毒培养法。快速免疫检测的灵敏度明显不足5-8，而另外两种方法则费时且劳动强度大9。分子检测具有多项优势，包括检测周期短、灵敏度高以及特异性更强。多家商业机构正在致力于开发针对传染病的快速分子检测方法（也称为核酸检测试剂或NATs），其中多家公司已有流感检测试剂处于研发管线中。然而，其中大多数方法仍需要在芯片外进行样本前处理。目前尚无任何获得临床实验室改进修正案（CLIA）豁免的分子检测方法将样本前处理步骤整合到检测试剂盒或检测模块中。
芯片实验室技术在即时检测设备的发展中起着重要作用。自从1993年首次提出PCR芯片以来10，人们已投入大量努力用于开发核酸检测试芯片。然而，其中仅有少数实现了将粗制样本的前处理与下游扩增过程整合于一体。
我们此前已展示了将固相萃取柱（SPE）微型化并集成到塑料微流控芯片中的方法11，以及连续流动PCR芯片的开发与优化12。在此，我们在前期工作基础上进一步将SPE与逆转录（RT）和PCR步骤集成于单一芯片中，用于临床诊断，并验证其从患者鼻咽（NP）拭子和抽吸物中扩增核酸的能力。

<table><tbody><tr><td>1-十二醇</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>443816-500G</td><td></td></tr><tr><td>2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>196118-50G</td><td></td></tr><tr><td>2100 生物分析仪</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td>G2943CA</td><td></td></tr><tr><td>2-丙醇</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>19516</td><td></td></tr><tr><td>二苯甲酮</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>239852-50G</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>A7979-50ML</td><td></td></tr><tr><td>甲基丙烯酸丁酯</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>235865-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>载体RNA</td><td>Qiagen, Valencia, CA</td><td>1017647</td><td></td></tr><tr><td>环己醇</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>105899-1L</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>乙烯二甲基丙烯酸酯</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>335861</td><td></td></tr><tr><td>乙二醇二甲基丙烯酸酯</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>335681-100ML</td><td></td></tr><tr><td>玻璃注射器 250 &amp;mu;l</td><td>Hamilton, Reno, NV</td><td>81127</td><td></td></tr><tr><td>硫氰酸胍</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>50981</td><td></td></tr><tr><td>高灵敏度DNA检测试剂盒</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>热压机</td><td>Carver, Wabash, IN</td><td>4386</td><td></td></tr><tr><td>J-B Weld环氧树脂</td><td>McMaster-Carr, Elmhurst, IL</td><td>7605A11</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔锁式注射器</td><td>BD-Medical, Franklin Lakes, NJ</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>AB-0359</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>494437</td><td></td></tr><tr><td>甲基丙烯酸甲酯</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>M55909</td><td></td></tr><tr><td>Nanoport</td><td>Upchurch Scientific</td><td>N-333-01</td><td></td></tr><tr><td>Nanoport接头</td><td>Upchurch Scientific</td><td>F-120x</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>PR-P1193</td><td></td></tr><tr><td>OneStep RT-PCR试剂盒</td><td>Qiagen, Valencia, CA</td><td>210210</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>41009</td><td></td></tr><tr><td>电源</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>300V</td><td></td></tr><tr><td>RNA酶清除剂</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>83931-250ML</td><td></td></tr><tr><td>RNASecure</td><td>Applied Biosystems, Foster City, CA</td><td>AM7005</td><td></td></tr><tr><td>二氧化硅微球</td><td>Polysciences, Warrington, PA</td><td>24324-15</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA</td><td>HA2000P/10</td><td></td></tr><tr><td>导热胶带</td><td>McMaster-Carr, Elmhurst, IL</td><td>6838A11</td><td></td></tr><tr><td>热电偶</td><td>Omega Engineering, Stamford, CT</td><td>5SRTC-TT-J-40-36</td><td></td></tr><tr><td>薄膜加热器</td><td>Minco, Minneapolis, MN</td><td>HK5166R529L12A</td><td></td></tr><tr><td>紫外交联仪</td><td>UPV, Upland, CA</td><td>CL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Zeonex</td><td>Zeon Chemicals, Louisville, KY</td><td>690R</td><td></td></tr></tbody></table>

微流控芯片的制备及流感检测方法

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

快速且有效的诊断在控制传染病方面发挥着重要作用，能够实现对患者的高效管理和治疗。在此，我们介绍一种集成化的微流控热塑性芯片，可对患者鼻咽（NP）拭子和吸出物中的甲型流感病毒进行扩增。在加载患者样本后，该微流控装置依次在固相萃取（SPE）单元中完成细胞裂解、RNA纯化与富集，随后在逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）腔室中进行逆转录（RT）和聚合酶链式反应（PCR）。终点检测通过芯片外的生物分析仪（Bioanalyzer，Agilent Technologies，Santa Clara，CA）完成。在外围设备方面，我们使用单个注射泵驱动试剂和样本，同时采用两个薄膜加热器分别为RT和PCR腔室提供热源。该芯片设计为单层结构，适用于高通量制造，可缩短 fabrication 时间并降低成本。该微流控芯片为多种病毒和细菌的分析提供了平台，其应用范围仅受限于为检测新病原体所需调整的试剂设计。

一个典型结果如图所示 图3 用于流感病毒A型感染的鼻咽冲洗样本。由于不同患者的样本中流感病毒含量存在差异，PCR产物的最终浓度也会有所不同。理想结果应表现为背景噪音低，出现两个清晰的阶梯峰（35 bp和10380 bp），阳性样本在预期产物大小（107 bp）处出现单一产物峰。理论上阴性对照不应出现产物峰，但在部分样本中，由于引物二聚体的形成，我们在流感特异性位点附近观察到非特异性PCR峰。多个产物峰可能提示检测过程中存在污染。若出现该情况，应重新取样并使用另一 aliquot 样本进行复检。凝胶电泳可用于进一步验证检测结果。13.
<img src="/files/ftp_upload/50325/50325fig1.jpg" alt="静态平衡；ΣFx=0；示意图；加热器与热电偶装置；热分析实验。" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50325/50325fig1highres.j...

已开发出一种用于分子诊断的集成化微流控热塑芯片。该芯片可进行核酸提取、逆转录和聚合酶链式反应（PCR）。文中描述了该芯片的制备与运行方法。

快速且有效的诊断在控制传染病方面发挥着重要作用，通过实现有效的患者管理和治疗得以控制疾病传播。这里，我们……

以下实验的总体目标是利用微流控芯片检测甲型流感病毒。首先，将含有裂解缓冲液的样本通入固相萃取（SPE）通道，以裂解病毒并提取RNA；然后将提取的RNA与逆转录-聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）试剂混合，并通入逆转录通道，将病毒RNA转化为cDNA。接着，将混合物通入PCR通道，以扩增DNA。最终通过毛细管电泳的荧光信号获得结果，显示扩增产物的大小和浓度。该技术的主要优势在于其可直接接受原始患者样本，并将核酸提取、纯化、逆转录和扩增集成于单一芯片中。要制备两个样块，需将约九克XN X颗粒均匀分布在金属板中央，置于198摄氏度的加热压机中加热五分钟，然后缓慢加压至2,500 PSI，持续五分钟。接着，将一个样块置于环氧模具中，在157摄氏度下预热十分钟，再缓慢加压至1000 PSI，持续十分钟。接下来，戴上隔热手套，从热压机中取出载片和模具，并在冷却前将载片从模具中取出。在压印好的芯片上钻三个孔，分别位于微流控通道的入口、废液口和出口处。然后用异丙醇清洗芯片，随后用RNase去除水和去离子水清洗。将芯片用空气吹干后进行键合，先在131摄氏度下预热10分钟，然后在350 PSI压力下压合10分钟。使用JB Weld环氧树脂分别在进样废液口和出样口安装纳米接口，固化15至24小时。按照制造商说明，用50 µL RNAs away冲洗SPE通道，随后用100 µL无核酸酶水冲洗。现在将4微升新配制的接枝溶液加入SPE通道中，在紫外烘箱中交联甲基丙烯酸酯孵育10分钟，然后用真空泵除去残留的接枝溶液。将管盖关闭后轻敲管壁，使干燥的微球沉淀破碎。随后加入100微升新配制的SPE柱溶液，涡旋混匀。将4微升SPE溶液加入同一通道中，每侧进行2.5分钟的紫外照射交联，形成不透明的白色聚合SPE柱。用500微升100%甲醇冲洗通道，以洗去多余的反应物和聚合物内部的热解溶剂。使用导热胶带将两个薄膜加热器固定在芯片底部。请注意，加热器的两侧需与宽通道的边缘对齐，以确保 Dene 持续时间。分别将五个热电偶通过每个芯片胶带的封闭式开放侧通道插入芯片中。为固定热电偶的位置，取一支试管加入 4 微升 25 XRNA Secure 与 96 微升 70% 乙醇混合，另取一支试管加入 100% 乙醇。同时，准备 300 微升通道缓冲液和 316 微升裂解缓冲液。将溶液在 60 摄氏度下加热 15 分钟。激活 RNA secure，然后平衡微流控通道。以 0.8 毫升/小时的流速将通道缓冲液通过固相萃取（SPE）通道。现在将 VTM 中的快速蚕豆试验样品置于 37 摄氏度下解冻。样品一旦完全融化，立即取出。以 13,000 转/分钟离心 10 分钟。将100微升上清液转移至300微升裂解缓冲液中，加入6微升浓度为每微升1微克的载体RNA，涡旋混匀。然后离心5秒，将全部裂解液加入一个Lure Lock 1 mL注射器中。以每小时0.8毫升的流速使裂解液通过SPE通道。然后以每小时1毫升的流速，用100微升70%乙醇洗涤SPE通道，接着用100微升100%乙醇洗涤。将一个空的注射器置于0.5毫升刻度位置，以每小时1毫升的流速推动空气通过通道，使通道干燥。现在以每小时0.5毫升的流速通过通道注入67.5微升无核酸酶水，洗脱结合的核酸，并从废液端口的纳米端口收集13.5微升洗脱液。加入36.5 µL的R-T-P-C-R预混液。在废液端口的纳米进样口处与模板RNA混合，配制总体积为50 µL的R-T-P-C-R反应体系。随后通过轻柔抽真空将R-T-P-C-R混合物加载至RT通道中。使用封闭接头密封纳米端口。对加热器一施加 35 伏电压。待加热器一在 50 摄氏度达到平衡后，将试剂在室温通道中保持 30 分钟。当第一个加热器在95摄氏度下平衡后，将试剂保持在室温通道中15分钟。接着，对加热器一施加27伏电压，对加热器二施加50伏电压，使加热器一平衡在60摄氏度，加热器二平衡在95摄氏度。以每分钟0.5微升的速度将试剂推入PCR通道。约20分钟后，当试剂接近蛇形通道末端时，使用适合Agilent高灵敏度DNA检测的移液器及吸头，在出口处收集PCR产物。检测前30分钟，将Agilent高灵敏度DNA试剂盒从冰箱中取出。打开生物分析仪，并启动2100 Expert软件。取1 µL测试用PCR产物上样，并按照Agilent操作流程进行。在此工作流程中分析并记录数据。将患者的鼻咽样本与裂解缓冲液混合后加样至芯片上。使用商用毛细管电泳芯片进行检测，流感病毒的PCR产物呈红色。由于每位患者样本中流感病毒的含量不同，PCR产物的最终浓度也会有所差异。理想的结果应具有较低的背景噪音，在35和10、380个碱基对处出现清晰的阶梯状峰，并在阳性样本的设计产物大小107个碱基对处出现单一的产物峰。观看本视频后，您应能充分了解如何制备和运行用于检测甲型流感病毒的微流控芯片。

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微流控芯片的制备及方法检测甲型流感

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学习微流控芯片制备及甲型流感病毒检测方法，掌握核酸提取、逆转录和PCR扩增的集成操作流程。该技术可直接处理原始患者样本，实现快速高效的分子诊断。

微流控芯片的制备及流感检测方法

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