微流控芯片的制备及流感检测方法
2013年3月26日
已开发出一种用于分子诊断的集成化微流控热塑芯片。该芯片可进行核酸提取、逆转录和聚合酶链式反应（PCR）。文中描述了该芯片的制备与运行方法。
以下实验的总体目标是利用微流控芯片检测甲型流感病毒。首先，将含有裂解缓冲液的样本通入固相萃取（SPE）通道，以裂解病毒并提取RNA；然后将提取的RNA与逆转录-聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）试剂混合，并通入逆转录通道，将病毒RNA转化为cDNA。接着，将混合物通入PCR通道，以扩增DNA。最终通过毛细管电泳的荧光信号获得结果，显示扩增产物的大小和浓度。
该技术的主要优势在于其可直接接受原始患者样本，并将核酸提取、纯化、逆转录和扩增集成于单一芯片中。要制备两个样块，需将约九克XN X颗粒均匀分布在金属板中央，置于198摄氏度的加热压机中加热五分钟，然后缓慢加压至2,500 PSI，持续五分钟。接着，将一个样块置于环氧模具中，在157摄氏度下预热十分钟，再缓慢加压至1000 PSI，持续十分钟。
接下来，戴上隔热手套，从热压机中取出载片和模具，并在冷却前将载片从模具中取出。在压印好的芯片上钻三个孔，分别位于微流控通道的入口、废液口和出口处。然后用异丙醇清洗芯片，随后用RNase去除水和去离子水清洗。
将芯片用空气吹干后进行键合，先在131摄氏度下预热10分钟，然后在350 PSI压力下压合10分钟。使用JB Weld环氧树脂分别在进样废液口和出样口安装纳米接口，固化15至24小时。按照制造商说明，用50 µL RNAs away冲洗SPE通道，随后用100 µL无核酸酶水冲洗。
现在将4微升新配制的接枝溶液加入SPE通道中，在紫外烘箱中交联甲基丙烯酸酯孵育10分钟，然后用真空泵除去残留的接枝溶液。将管盖关闭后轻敲管壁，使干燥的微球沉淀破碎。随后加入100微升新配制的SPE柱溶液，涡旋混匀。
将4微升SPE溶液加入同一通道中，每侧进行2.5分钟的紫外照射交联，形成不透明的白色聚合SPE柱。用500微升100%甲醇冲洗通道，以洗去多余的反应物和聚合物内部的热解溶剂。使用导热胶带将两个薄膜加热器固定在芯片底部。
请注意，加热器的两侧需与宽通道的边缘对齐，以确保 Dene 持续时间。分别将五个热电偶通过每个芯片胶带的封闭式开放侧通道插入芯片中。为固定热电偶的位置，取一支试管加入 4 微升 25 XRNA Secure 与 96 微升 70% 乙醇混合，另取一支试管加入 100% 乙醇。同时，准备 300 微升通道缓冲液和 316 微升裂解缓冲液。
将溶液在 60 摄氏度下加热 15 分钟。激活 RNA secure，然后平衡微流控通道。以 0.8 毫升/小时的流速将通道缓冲液通过固相萃取（SPE）通道。
现在将 VTM 中的快速蚕豆试验样品置于 37 摄氏度下解冻。样品一旦完全融化，立即取出。以 13,000 转/分钟离心 10 分钟。
将100微升上清液转移至300微升裂解缓冲液中，加入6微升浓度为每微升1微克的载体RNA，涡旋混匀。然后离心5秒，将全部裂解液加入一个Lure Lock 1 mL注射器中。以每小时0.8毫升的流速使裂解液通过SPE通道。
然后以每小时1毫升的流速，用100微升70%乙醇洗涤SPE通道，接着用100微升100%乙醇洗涤。将一个空的注射器置于0.5毫升刻度位置，以每小时1毫升的流速推动空气通过通道，使通道干燥。现在以每小时0.5毫升的流速通过通道注入67.5微升无核酸酶水，洗脱结合的核酸，并从废液端口的纳米端口收集13.5微升洗脱液。
加入36.5 µL的R-T-P-C-R预混液。在废液端口的纳米进样口处与模板RNA混合，配制总体积为50 µL的R-T-P-C-R反应体系。随后通过轻柔抽真空将R-T-P-C-R混合物加载至RT通道中。
使用封闭接头密封纳米端口。对加热器一施加 35 伏电压。待加热器一在 50 摄氏度达到平衡后，将试剂在室温通道中保持 30 分钟。
当第一个加热器在95摄氏度下平衡后，将试剂保持在室温通道中15分钟。接着，对加热器一施加27伏电压，对加热器二施加50伏电压，使加热器一平衡在60摄氏度，加热器二平衡在95摄氏度。以每分钟0.5微升的速度将试剂推入PCR通道。
约20分钟后，当试剂接近蛇形通道末端时，使用适合Agilent高灵敏度DNA检测的移液器及吸头，在出口处收集PCR产物。检测前30分钟，将Agilent高灵敏度DNA试剂盒从冰箱中取出。打开生物分析仪，并启动2100 Expert软件。
取1 µL测试用PCR产物上样，并按照Agilent操作流程进行。在此工作流程中分析并记录数据。将患者的鼻咽样本与裂解缓冲液混合后加样至芯片上。
使用商用毛细管电泳芯片进行检测，流感病毒的PCR产物呈红色。由于每位患者样本中流感病毒的含量不同，PCR产物的最终浓度也会有所差异。理想的结果应具有较低的背景噪音，在35和10、380个碱基对处出现清晰的阶梯状峰，并在阳性样本的设计产物大小107个碱基对处出现单一的产物峰。
观看本视频后，您应能充分了解如何制备和运行用于检测甲型流感病毒的微流控芯片。
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概述
本研究介绍了一种用于分子诊断的集成化微流控热塑芯片，特别用于检测甲型流感病毒。该芯片可在一个简化的流程中实现核酸提取、逆转录和PCR扩增。
关键研究组成部分
科学领域
- 微流控
- 分子诊断
- 病毒学
背景
- 微流控设备有望彻底改变诊断流程。
- 高效的核酸提取与扩增对于准确检测病毒至关重要。
- 将多个步骤集成到单一芯片上可提高易用性并降低污染风险。
- 该技术允许直接使用患者原始样本，从而简化操作流程。
研究目的
- 开发一种集成核酸提取、纯化、逆转录和扩增功能的微流控芯片。
- 验证该芯片在检测甲型流感病毒中的有效性。
- 提供芯片制备与操作的详细方法学。
使用的方法
- 使用缓冲液裂解样本，以提取病毒中的RNA。
- 将提取的RNA与逆转录PCR（R-T-P-C-R）试剂混合上样。
- 运行逆转录通道，将病毒RNA反转录为cDNA。
- 在PCR通道中扩增DNA，并通过毛细管电泳分析结果。
主要结果
- 该芯片可成功从患者原始样本中检测出甲型流感病毒。
- 检测结果根据荧光信号反映扩增产物的大小和浓度。
- 整合式方法减少了对多个独立步骤的需求。
- 荧光分析证实了扩增过程的有效性。
结论
- 微流控芯片在分子诊断领域代表了一项重大进步。
- 它简化了甲型流感病毒的检测流程。
- 未来，该技术可被改造用于其他病毒性病原体的检测。
常见问题
行业重要性概述
集成式微流控诊断技术通过将核酸提取、扩增和分析整合到单一平台，简化了传染病的检测流程。该方法在样本获取与分子检测结果输出的关键环节，提高了检测的预测准确性和操作效率。该技术可支持快速、可扩展的部署，适用于全系列病原体监测和早期靶点验证。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可直接检测临床样本中的病原体存在情况及核酸特征。
- 通过在封闭系统中整合裂解、纯化和扩增步骤，支持生物学风险降低。
- 利用患者来源材料，促进针对传染病靶标的快速假设验证。
筛选与检测方法开发
- 为下游分子检测和筛选工作流程制备经过验证的核酸样本。
- 标准化样本处理流程，以提高实验可重复性和定量结果的一致性。
- 通过减少人工干预和污染风险，实现高通量检测方法的开发。
转化与临床前研究
- 将诊断结果与传染病项目的转化生物标志物策略相统一。
- 实现从临床样本获取到临床前模型验证的全程衔接。
- 通过提供可靠、定量的分子数据，支持基于风险评估的推进决策。
流程与工作流整合
该微流控平台通过实现对患者样本中病毒核酸的直接、定量分析，架起了早期发现与转化研究之间的桥梁。
- Discovery Biology： 将基于假设的病原体检测与机制性风险消除整合于单一工作流程中。
- Screening： 提供可重复、定量的核酸输出结果，适用于检测方法的标准化。
- Analytics： 基于毛细管电泳的检测读数，实现扩增子大小和浓度的精确测量。
- Translational Research： 促进诊断结果与临床生物标志物需求的对接。
- Enterprise Reuse： 提供模块化平台，通过调整试剂设计即可适应新病原体的检测。
运营与企业影响
- 科学价值：提高病原体检测流程中结果的可预测性，降低检测结果的不确定性。
- 操作价值：简化从样本到结果的全流程，减少人工操作时间和出错风险。
- 战略价值：加快传染病项目中“推进/终止”决策的速度，并支持规模化部署。
- 组合影响：实现针对多种病原体的诊断和治疗候选方案的风险调整优先排序。
实施注意事项
- 需要具备微流控芯片制备和分子检测优化方面的专业知识。
- 需要配备温控系统、注射泵和毛细管电泳仪器。
- 芯片制备和分析流程需在不同团队间进行严格的标准化。
- 针对新病原体的适应性取决于试剂的重新设计与验证。
- 通量和可扩展性受芯片制造及外围设备集成的影响。
