啮齿动物的中枢神经系统药物直接脑室交货

以下实验的总体目标是通过侧脑室将反义寡核苷酸等药物直接施用到啮齿动物中枢神经系统中，如本方案所示。这是通过两种不同的方法实现的。第一种涉及通过手术将连接到 zet 渗透泵的金属导管植入小鼠的右侧脑室。

一旦泵完成药物输送，泵可以完全移除，这样可以停止治疗，也可以更换泵，这样可以继续积极治疗。第二种给药方法依赖于向右心室单次推注。使用这种方法可以将一定量的药物快速冲洗到整个中枢神经系统中，以证明反义寡核苷酸成功递送到整个啮齿动物中枢神经系统。

如该方案所示，应测量输注寡核苷酸后几个不同大脑区域的 mRNA 和蛋白质水平。尽管这种方法可以深入了解如何直接将反义寡核苷酸施用于中枢神经系统。它也可以应用于其他药物，包括抗体、基因治疗、载体和小分子。

所有外科手术都必须在无菌条件下使用无菌设备和溶液进行，并按照机构和政府的指导方针进行。详细信息可以在文本协议和机构 iacuc 指南中找到。在用 isof 氟的感应室中麻醉鼠标后，取出鼠标并进行脚趾捏合，以确保鼠标完全无意识工作。

快速剃掉从肩膀顶部到眼睛之间的头发。然后小心轻柔地将麻醉的鼠标放在立体声攻击上。将鼻锥推到鼻上，并将气流引导到立体声起音。

为了保持鼠标麻醉状态，请用耳杆固定头部。这里使用调平耳杆，尽管为了瞄准侧心室，但由于心室的尺寸很大，因此不需要完全水平的颅骨。将 isof 氟水平降低至 2% 以维持麻醉轻拍眼膏。

用蘸有 95% 乙醇的棉签擦拭每只眼睛的头部和颈部顶部，然后用蘸有碘酒的棉签擦拭手术区域。此外，在鼠标上放置无菌窗帘。确保鼠标的体温保持在 37 摄氏度。

这里使用直肠探头反馈、温控加热系统。然后继续植入 zat 泵。根据所需的输注天数选择合适的泵，并根据方案文本部分的说明准备泵。

从脖子底部切开到眼睛之间的区域后，将钝剪刀顺利插入颈部底部的皮肤下方，曲线朝上。将剪刀滑回左后肢并稍微打开它们以形成皮下袋。用无菌棉签将颅骨擦干净，然后用棉签蘸过氢。

为了增强 bgma，请使用弯曲的止血钳小心地从锥形管中取出泵，确保泵不会接触锥形管的侧面。用镊子握住泵的底部，然后将流量调制器推入其余部分。使用弯曲的止血器，使用弯曲的止血器将泵固定在流量调节器和管道的交汇处。

将泵插入颈部底部的皮肤下，小心地将其推回左后肢，使其尽可能无阻力地移动。小心不要让导管接触弯曲止血钳的任何东西。抓住顶部与基座相交的凹槽处的套管。

将套管驱动器移动到位并固定到位。然后在套管底部滴一滴强力胶，将套管的顶部推入驱动器并定位，使管子笔直指向后方。快速工作，将导管尖端接触 bgma，并将数字显示屏上的坐标归零，同时将皮肤放在一边。

使用弯曲的止血器，抬起导管并将其横向向右移动 1.1 毫米，向后移动 0.5 毫米。如图所示，将导管快速穿过颅骨，直到套管底部牢固地压在颅骨上。由于头骨相对较薄，导管可以直接穿过颅骨和小鼠。

将任何有胶水的皮肤从头骨上拉开。然后让插管司机将插管固定到位，等待一到两分钟，让胶水完全干燥。接下来，在抬起驱动器的同时，用弯曲的止血钳将套管固定到位。

慢慢松开止血钳，以确保套管正确固定在颅骨上。使用棉签按压套管顶部。将无菌大鼠骨头剪插入套管顶部和底部之间的凹槽中，并使剪子与理发器齐平。

为避免从颅骨上拆下套管，请夹住套管顶部，同时仍用棉签向下按压。使用五根尼龙缝合线，常规止血钳和镊子沿着完全开口缝合，特别注意套管上方的区域。在头部和颈部涂抹少许抗生素软膏。

拧下耳杆并松开鼻锥。将鼠标从立体声攻击中取出并放在加热垫上进行恢复。手术后每天监测小鼠以检查疼痛或不适和感染，并根据批准的方案根据需要使用镇痛药（如卡洛芬）进行治疗。

要卸下用过的泵，请小心地将泵从垂直于鼠标背面泵连接处的 1.5 厘米切口中拉出，不要明显拉扯或推挤管道。接下来，将管路夹在流量调制器上方约 0.5 厘米处，并将强力胶触碰到管路上以将其密封。等待 1 到 2 分钟，让胶水干燥。

将管子放回切口中，将切口闭合的轻拍抗生素软膏缝合到缝合的皮肤上，然后将鼠标放在加热的恢复垫上。如果更换泵，请准备好新的泵以及一个装满 95% 乙醇的 10 厘米培养皿。使用镊子抓住新泵。

然后将另一只手的手指浸入 95% 乙醇中并握住泵。丢弃新的泵流量调制器，小心地将旧泵从流量调制器中拉出。连接到管道和套管旧泵关闭后，慢慢滑动新泵，确保流量调制器永远不会接触鼠标的外部。

切口将新泵重新插入皮下袋，像以前一样缝合皮肤后缝合皮肤，将抗生素软膏涂抹在伤口上，然后将鼠标放在恢复垫上。同样，手术后每天监测小鼠以检查疼痛或不适和感染，并根据需要施用镇痛药以施用脑室内脑室推注。像以前一样做一个头皮切口，将动物的头骨擦干净并用过氧化氢处理。

然后将装有药物的注射器移动到位。将针头的斜面部分朝向后部并固定到位。放下针头，直到它接触到 bgma。

将所有坐标归零，然后将指针横向向右移动 1.0 毫米和向前 0.3 毫米。慢慢地将针头穿过颅骨，直到针斜面的顶部与颅骨顶部齐平。同样，这可以通过鼠标零头骨的薄来实现。

Z 坐标，并以每秒 1 毫米的速率将指针降低到负 3.0 毫米。等待 2 到 3 分钟，让大脑密封针头周围。以每秒 1 μL 的速率输送全部 10 μL 反义寡核苷酸。

等待 2 到 3 分钟。每秒 1 微升的输注速率用于将寡核苷酸注入心室。尽管不同药物的速率可能不同，但请将棉签抵住针头底部的颅骨。

以每秒 1 毫米的速度抬起针头。针头从颅骨中出来后，将棉签滚动到针孔上并保持一分钟，以防止任何药物泄漏。缝合皮肤并涂抹抗生素软膏后，将鼠标放在加热的恢复垫上。

根据寡核苷酸浓度，可能需要 20 分钟到几个小时才能完全恢复。同样，手术后每天监测小鼠以检查疼痛或不适和感染，并根据需要服用镇痛药。该图像显示了在施用固绿染料后立即灌注的大脑，以测试 zet 渗透泵插入坐标以施用到心室。

如本视频所示，如果导管成功放置在心室中，染料将分布在整个小鼠心室系统中，如图所示。该图像显示了在施用快速绿色染料以测试脑室内脑室推注坐标和程序后不久灌注的大脑。如果针头成功放置在心室中，染料将再次分布在整个小鼠心室系统中。

下图显示了减少大鼠的反义寡核苷酸实验的结果，因此 D 在体内反义。因此，将 D 1 寡核苷酸以每天 100 μg 的剂量输注到正常大鼠的右侧脑室中 28 天。该图显示来自大脑和脊髓的内源性 OD one mRNA 水平降低。

通过 Q-R-T-P-C-R 测量 OD one 寡核苷酸输注后，该图像显示 SOD one 蛋白水平也降低。在这里输注 OD one 反义寡核苷酸后，输注后大脑不同区域的微管蛋白和 OD one 的蛋白质水平被量化，表明 so D one oligo 对 so D one 敲低具有特异性。此外，将针对早老素 1 或 GSK 3 β 的寡核苷酸输注到非转基因小鼠的右侧心室中两周，并评估 mRNA 水平。

该结果展示了可以使用反义寡核苷酸调节的多种靶标。一旦掌握了这些技术，如果作得当，泵和种植园以及推注注射都可以在 10 分钟内完成。