Name: 啮齿动物的中枢神经系统药物直接脑室交货 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: 了解通过导管植入和单次推注注射两种方法，将反义寡核苷酸等药物直接递送至啮齿动物侧脑室的中枢神经系统给药技术。该方案适用于神经科学和药物递送研究。

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我们感谢 Isis Pharmaceuticals 的 Curt Mazer 在脑室内推注手术方面提供的建议，同时也感谢 Isis Pharmaceuticals 为我们的实验室提供了反义寡核苷酸（ASOs）。此外，我们感谢 Carey Shaner 对本文的审阅。TMM 和 SLD 得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金 P50AG005681、K08NS074194 和 R01NS078398 的资助。

以下方案已获得圣路易斯华盛顿大学机构动物护理和使用委员会的批准，并符合美国国立卫生研究院关于实验动物使用指南的规定。如果您是首次进行手术操作，建议在开始之前先阅读 JoVE 关于啮齿类动物手术的文章作为入门参考14。
ASO 可通过渗透泵输注和单次脑室内推注两种方式递送至小鼠中枢神经系统。因此，下述实验步骤分为两个部分。每种方法的优缺点将在讨论部分中提及。本方案中使用的坐标适用于成年 C57BL6 和 B6C3 小鼠。相应的大鼠坐标见表 1。
ALZET 渗透压泵
1. Alzet 渗透泵的制备
<ol>
	<li>铺上无菌巾，小心地将以下物品放置其上，注意不要直接触碰任何物品以保持无菌状态：渗透泵、流速调节器、1 ml 无菌注射器、手术刀片以及导管节段（1 段导管 = 5 个泵）。对于小鼠，泵有三种选择：14 天、28 天和 42 天（图 2A）。</li>
	<li>打开盖子，向无菌的 50 ml 锥形管中加入 15–20 ml 生理盐水溶液。每根锥形管最多可放入 6 个组装好的泵。</li>
	<li>向 p60 培养皿中加入 100% 乙醇，并将适量的导管放入乙醇中。对于小鼠，导管长度为 2.5 mm。</li>
	<li>将每种反义寡核苷酸（ASO）过滤至所需数量的 1.5 ml Eppendorf 管中。另准备一个装有无菌 0.9% 生理盐水的 Eppendorf 管，用于填充导管。</li>
	<li>所有物品准备就绪后，戴上无菌手套。确保不触碰任何非无菌物品。必要时及时更换手套。</li>
	<li>针对每种待使用的 ASO，用 1 ml 注射器吸取后，将针头插入泵顶部的孔中，缓慢注入直至有液体溢出，完成加样。重复此操作直至所有泵均被填满。</li>
	<li>打开流速调节器的盖子，将其插入泵中。将流速调节器几乎完全插入，保留 3–5 mm 的间隙。</li>
	<li>使用手术刀片将每段导管切成 5 个等长部分。取一段导管，用 1 ml 注射器注入无菌生理盐水，然后将流速调节器的顶端插入导管一端。再从乙醇中取出一根套管，连接到导管的另一端。此时泵已完全组装完毕。</li>
	<li>将完全组装好的泵放入含生理盐水的无菌 50 ml 锥形管中进行预启动（priming）。预启动过程使泵吸收液体以启动药物递送，并达到适宜温度。预启动时间：14 天泵为 4–6 小时，28 天泵为 40 小时，42 天泵为 60 小时。泵组装完成后，盖上锥形管盖子，置于洁净的 37 °C 水浴中，直至手术使用。</li>
</ol>
2. 术前准备
<ol>
	<li>用70%乙醇彻底擦拭所有物品以消毒操作区域，并在手术台和立体定位仪表面铺上无菌巾，以建立无菌区域。在整个手术过程中，必须始终注意维持无菌环境。开启以下设备：玻璃珠灭菌器、加热垫、照明灯、数字显示装置以及氧气/异氟烷系统。图1).</li>
	<li>以下物品在进行单次手术或批量手术（如我们常规操作）时均需准备：镊子1把、弯止血钳1把、小剪刀1对、小弯钝头剪刀1对、大鼠骨剪1把、直止血钳1把、5-0尼龙缝线、70%乙醇锥形管1个、95%乙醇锥形管1个、碘液锥形管1个、过氧化氢锥形管1个、无菌棉签一包、速干胶1瓶、抗生素软膏1管、眼用润滑软膏1管，以及电动剃毛器1台。</li>
	<li>将两把剪刀、镊子和弯止血钳的尖端放入珠式灭菌器中灭菌15秒。取出后置于70%乙醇中。若进行多台手术，在每只动物之间需对器械尖端重新灭菌。</li>
	<li>将异氟烷调至4%并调节氧气2 将气体流速调节至0.4 L/min，并将气流导入麻醉舱。我们的异氟烷/氧气系统每年至少校准一次，以确保麻醉剂输送剂量准确。将小鼠放入麻醉舱，待其呼吸显著减慢后取出，进行足趾夹捏测试，确认小鼠已完全失去意识。</li>
	<li>从肩部上方开始剃毛，直至两眼之间。若小鼠开始苏醒，将其放回麻醉舱内，直至小鼠完全失去意识，通过脚趾夹捏测试确认麻醉深度。将麻醉后的小鼠固定于立体定位仪上，将鼻罩轻轻罩住鼻部。操作需轻柔，因其牙齿和骨骼较为脆弱。</li>
	<li>将气流导向立体定位仪以维持小鼠麻醉状态。手术过程中需定期通过夹捏脚趾检查小鼠是否完全无意识。使用耳杆固定头部。我们倾向于使用可调平耳杆，但由于脑室体积较大，靶向侧脑室时并不要求颅骨绝对水平。</li>
	<li>将异氟烷浓度下调至2.0%以维持麻醉。在每只眼睛上涂抹眼膏。如视频所示，将无菌手术巾覆盖在小鼠身上，仅暴露颈部基部和头部。随后对手术区域进行消毒：先用浸有95%乙醇的棉签以剃毛区域中心为起点向外做环形擦拭，再用浸有碘液的棉签重复环形擦拭。</li>
	<li>建议使用带有直肠探针反馈温度控制的加热系统，以确保小鼠体温维持在稳定的 37 °C。若手术过程中小鼠体温下降，术后恢复时间可能延长，且由此引起的低体温可导致蛋白质活性异常，包括微管相关蛋白 Tau 的过度磷酸化。15设置好加热系统后，即可开始手术。</li>
</ol>
3. Alzet 渗透压泵的植入
<ol>
	<li>手术开始前，戴上一副新的无菌手套。然后使用镊子和一把小剪刀，从动物头骨上方颈部基部至两眼之间做一皮肤切口。</li>
	<li>将钝头剪刀弯曲面朝上，从颈部基部皮下向左后肢方向钝性分离。操作时应无明显阻力；若有阻力，应取出剪刀重新尝试。此步骤用于形成皮下渗透泵植入腔。</li>
	<li>先用无菌棉签擦拭颅骨表面，再用蘸有双氧水的棉签擦拭以清晰显露前囟点（bregma）。</li>
	<li>用棉签擦拭盛有渗透泵的50 ml锥形管外壁以维持泵的无菌状态。使用弯头止血钳小心从锥形管中取出一个泵，注意避免泵体接触管壁。用镊子夹住泵体底部，再用弯头止血钳将流速调节器完全推入到位。</li>
	<li>用弯头止血钳夹住泵体的流速调节器与导管连接处，将泵从颈部基部皮下插入，并向左后肢方向推送至无阻力为止。注意避免导管接触任何物体。</li>
	<li>用弯头止血钳夹住套管（cannula）顶部与基座连接处的凹槽。将套管固定器移至适当位置并固定。</li>
	<li>在套管基部滴一滴速干胶。将套管顶部推入固定器中，并调整方向使导管朝正后方。</li>
	<li>将导管尖端轻触前囟点（bregma），并在数字显示屏上将坐标归零。抬起导管，向右侧横向移动1.1 mm，再向后移动0.5 mm（图2B）。用弯头止血钳将皮肤拨开，避免干扰操作。</li>
	<li>将细金属导管直接刺入颅骨，直至塑料套管基座牢固贴合颅骨表面。由于小鼠颅骨较薄，金属导管可直接穿透颅骨。若使用大鼠，则需在降低导管前先在颅骨上钻孔。</li>
	<li>将粘有胶水的皮肤从颅骨上轻轻拉开。在套管固定器保持套管/导管位置不变的情况下，等待1–2分钟使胶水完全干燥。</li>
	<li>练习时，为评估导管位置，可通过导管注入20–40 μl的2.5%快绿染料（FastGreen Dye）（图2C）。等待2–3分钟后，用含0.03%肝素的1X PBS灌注小鼠，并取出脑组织。在导管穿刺部位进行冠状切面切割。若导管正确置入脑室，染料将遍布整个小鼠脑室系统（图2D）。</li>
	<li>在抬起固定器的同时，用弯头止血钳固定导管位置。缓慢松开止血钳，确认套管已牢固粘附于颅骨。</li>
	<li>用棉签压住套管顶部。将大鼠骨剪插入套管顶部与基座之间的凹槽内，在持续下压的同时剪除套管顶部。操作时尽量保持骨剪水平，避免套管从颅骨脱落。若套管意外松脱，应立即重新粘合，并用棉签加压至少2分钟。</li>
	<li>使用5-0缝合线、普通止血钳和镊子，沿整个切口进行缝合，特别注意套管上方区域的密合性。由于颅骨上方切口较大，我们采用连续水平褥式缝合（见图5）。</li>
	<li>在头部和颈部涂抹少量抗生素软膏。旋松耳杆，放松鼻罩。将小鼠从立体定位仪上取下，置于加热垫上恢复。在恢复期间密切观察小鼠状态，通常持续10–30分钟。每2–3分钟检查一次，直至小鼠能够自主行走并开始理毛行为。</li>
</ol>
4. 术后护理
<ol>
	<li>术后第一周内每天监测小鼠状况。</li>
	<li>若小鼠出现疼痛或痛苦迹象，建议每24小时给予一次5 mg/kg的卡洛芬皮下注射，最多连续使用5天，以缓解疼痛。</li>
	<li>若出现感染迹象，应每日充分涂抹抗生素软膏，并咨询驻场兽医，确保伤口正常愈合。</li>
	<li>术后7-10天拆除5-0尼龙缝线，以防止缝线引起刺激。</li>
</ol>
5. 更换或移除 Alzet 渗透泵
在泵完成主动输注ASO后，可以更换或完全移除。
<ol>
	<li>按照上述术前操作步骤进行，但作如下更改：1）不需要使用弯剪、弯止血钳、大鼠骨剪和数字显示屏；2）无需准备小鼠头部，而是剃除并消毒小鼠背部泵与导管连接处的皮肤。</li>
	<li>使用镊子和剪刀，在小鼠背部垂直于泵/导管连接处做一道1.5 cm的切口。小心地将泵从切口中拉出，避免对导管施加明显拉力或推力，以防扰动导管位置。</li>
	<li>为取出泵体，需在流量调节器上方约0.5 cm处剪断导管，并用瞬间胶轻触导管末端以密封。等待1–2分钟使胶水完全干燥。将导管重新放回切口内，缝合切口。在缝合处涂抹抗生素软膏，并将小鼠置于加热恢复垫上。</li>
	<li>如需更换泵体，请提前准备好新制的泵，并准备一个盛有95%乙醇的10 cm培养皿。新泵无需使用导管。</li>
	<li>用镊子夹取一个新的泵体。将手指浸入乙醇中，取出泵体后丢弃其流量调节器。然后，小心缓慢地将旧泵从连接在导管和套管上的流量调节器上取下。一旦取下，立即缓慢地将新泵滑入原位，确保流量调节器始终不接触小鼠体外部分。</li>
	<li>将新泵经切口重新置入皮下囊袋，并缝合皮肤。在伤口处涂抹抗生素软膏，然后将小鼠放置于恢复垫上。</li>
	<li>与泵植入手术相同，术后需每日观察小鼠，检查是否存在疼痛、不适或感染迹象。根据需要给予卡洛芬和抗生素治疗。</li>
</ol>
脑室内团注
6. 术前准备
<ol>
	<li>按照上述第2节中的相同术前操作步骤进行，但需进行以下更改：1）无需使用弯头剪刀、弯头止血钳或大鼠骨剪；2）用无菌水清洗一支10 μl Hamilton注射器及针头，并装入ASO；3）将该注射器和针头安装至立体定位仪上原先放置套管驱动器的位置。</li>
</ol>
7. ASO 的团注注射
<ol>
	<li>使用镊子和小型剪刀，从颈部基部向上至两眼之间做一切口。</li>
	<li>用无菌棉签擦拭颅骨，随后用浸有双氧水的棉签擦拭以增强前囟的可见度。</li>
	<li>将注射器/针头移至预定位置并固定。确保针头斜面朝向后方。降低针头直至接触前囟，将所有坐标归零。将针头向右横向移动 1.0 mm，向前移动 0.3 mm（图 3A）。</li>
	<li>缓慢将针头刺入颅骨，直至针孔与颅骨顶部齐平。由于小鼠颅骨较薄，此操作可行。将 z 坐标归零，并以 1 mm/sec 的速度将针头下降至 -3.0 mm（图 3B）。等待 2–3 分钟，使脑组织在针周封闭。</li>
	<li>以每秒 1 μl 的速度注入全部 10 μl 反义寡核苷酸（ASO）。等待 2–3 分钟。我们采用 1 μl/秒的输注速率将 ASO 注入脑室，但不同药物的输注速率可能有所不同。练习时，可通过注入 10–20 μl 的 2.5% 快绿染料（FastGreen Dye）来检查针头位置是否正确。染料注入后，立即用含 0.03% 肝素的 1× PBS 灌注小鼠，并制备脑组织冠状切片，以确认染料位于脑室系统内（图 3C）。</li>
	<li>将棉签紧贴针头基部的颅骨处。以每秒 1 mm 的速度提起针头。一旦针头完全退出颅骨，立即用棉签覆盖针孔并按压 1 分钟，防止 ASO 外漏。</li>
	<li>缝合皮肤，涂抹抗生素软膏，并将小鼠置于加热恢复垫上。根据 ASO 浓度不同，完全恢复可能需要 20 分钟至数小时。</li>
	<li>与泵植入手术相同，术后需每日观察小鼠，检查是否存在疼痛/不适或感染情况，并根据需要给予卡洛芬（Carprofen）和抗生素治疗。</li>
</ol>

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</ol>

作者从 Isis Pharmaceuticals 获得反义寡核苷酸。开放获取费用由 Alzet Osmotic Pumps 赞助。

如视频所示，将药物递送至中枢神经系统的全身给药技术是一种极为强大且易于学习和使用的方法。经过练习，单次泵植入或脑室内推注可在10分钟内完成，从而能够同时处理大量小鼠。这对于具有行为学读数的研究尤为有用，因为小鼠行为学实验需要较大的样本量，以帮助发现显著差异。
根据我们递送ASO的经验 通过 泵注与推注给药各有优缺点，我们已观察到每种方法的利弊。需要指出的是，这些观点仅基于我们实验室的经验，可能并不适用于所有小鼠和大鼠模型。
我们发现使用泵的优势在于能够输送较大量的反义寡核苷酸（ASO），因为ASO在更长的时间内持续释放。这通常意味着在ASO主动输注结束后，基因敲低或剪接调控的效果可持续更长时间，尽管情况并非总是如此。泵还可以精确控制ASO的递送时间（14天、28天或42天），并且可以通过更换泵来实现更长时间的ASO持续输注。然而，我们注意到更换泵超过一次会增加实验变异性，原因是泵周围会形成纤维囊，阻碍泵对液体的正常吸收。泵的一个缺点是部分小鼠对泵的耐受性较差。如果你所使用的转基因品系本身较为脆弱，使用泵可能会带来过大的负担。此外，在最后一次输注完成后，泵必须被取出，这会使小鼠经历额外的手术和麻醉。如果进行行为学实验，尤其需要在实验前取出泵，并给予至少1–2周的恢复期，因为泵的存在会影响小鼠的某些行为表现。
采用脑室内推注给药的一个优点是成本较低。虽然在购买注射器和针头方面需要前期投入，但长期来看，由于无需购买泵、管路或导管，推注给药更具成本效益。总体而言，脑室内推注给药因无需使用套管和泵，维护更简便。我们还发现，脑室内推注可用于向更年轻和/或更脆弱的小鼠递送反义寡核苷酸（ASOs）。脑室内推注的一个缺点是其为单次注射，总体递送的ASO剂量有限；若所用ASO的作用持续时间较短，则其基因敲低或剪接调控效应也较为短暂。
渗透泵和脑室内推注均能够递送反义寡核苷酸（ASOs），从而在整只啮齿类动物中枢神经系统内敲低蛋白或改变基因的剪接，该技术在多个神经科学相关领域具有广泛的应用。如果您不确定哪种给药途径最适合您的特定研究，建议对这两种递送方法均进行预实验。

一些药物无法穿过血脑屏障（BBB），因此需要直接向中枢神经系统（CNS）递送。为绕过血脑屏障，可采用本文所述的方法将药物直接递送至脑内。尽管本实验室及本文重点研究反义寡核苷酸（ASOs），其他类型的药物如小分子、抗体、基因治疗载体等也可通过此类方法递送。 等等，也可以通过完全相同的方法进行递送。
某些蛋白质在神经退行性疾病的发病机制中起着关键作用。这些蛋白质常形成有毒物质并聚集成聚集体，最终导致神经元死亡及继发性神经系统疾病3-4。为了减缓甚至阻止这些疾病的进展，一种可能的治疗策略是直接靶向并降低致病蛋白质的水平。然而，这些蛋白质通常广泛存在于中枢神经系统（CNS）中，因此难以在全脑范围内实现有效靶向。
为了靶向整个中枢神经系统中的基因，我们将反义寡核苷酸（ASOs）注入小鼠脑脊液（CSF）中 通过 通过侧脑室注射以绕过血脑屏障（BBB）。该特定方法利用小鼠脑室系统，该系统灌注整个脑和脊髓，从而实现反义寡核苷酸（ASOs）的广泛分布。我们使用的ASOs是长度为18-20个核苷酸的RNA类似分子，可直接结合靶标mRNA序列；根据ASO的化学修饰不同，其作用机制可分为两种：A）招募RNase H降解mRNA，导致基因表达敲低；或B）调节选择性剪接 1,2,16,17需要注意的是，存在多种分子可用于敲低特定蛋白质 体内，包括shRNA。由于这些分子并非本文的重点，建议读者参考更详细阐述各种敲低作用机制及其优缺点的综述文章。 5-6.
在先前的研究中，我们曾使用反义寡核苷酸（ASOs）在肌萎缩侧索硬化症（ALS）的转基因大鼠模型中靶向蛋白质超氧化物歧化酶1（SOD1） 7 (图4）。SOD1基因突变出现在约2%的所有肌萎缩侧索硬化症病例中 8尽管最近有假说认为 SOD1 在散发性 ALS 中也可能发挥重要作用 9-10通过降低ALS转基因大鼠中总SOD1水平，发病后的生存期显著延长 7这些重要数据首次表明，针对中枢神经系统的反义寡核苷酸（ASO）治疗可对神经系统疾病模型产生显著的积极影响。此后，靶向人类SOD1的ASO已进入并成功完成了一项I期人体临床试验，副作用极小（Clinicaltrials.gov NCT01041222），相关结果已在2012年第64届th 美国神经病学学会年会。目前正计划将反义寡核苷酸推进至二期临床试验。
尽管以SOD1为靶点是首次证明使用反义寡核苷酸（ASOs）治疗神经系统疾病的研究，但此后已有多个研究针对不同疾病及其相应的蛋白质靶点展开。2010年和2011年，研究人员在脊髓性肌萎缩症（SMA）的转基因小鼠模型中使用了可调节运动神经元存活蛋白2（SMN2）剪接的ASOs，结果显著改善了疾病的表型特征11,12。目前，这类剪接调控型ASOs已进入针对SMA患儿的I期临床试验阶段（Clinicaltrials.gov 编号：NCT01494701）。此外，最近的研究还表明，即使在亨廷顿蛋白水平恢复至基线后，短暂给予靶向亨廷顿基因（huntingtin gene）的ASOs仍能显著挽救亨廷顿病小鼠模型的病理表型13。
在所有这些研究中，反义寡核苷酸（ASOs）被递送至侧脑室，以降低中枢神经系统整体的基因表达水平或改变基因剪接。可通过渗透泵或单次推注方式将ASOs递送至脑脊液（CSF）中。泵注法可实现缓慢、持续的给药，而脑室内（ICV）单次推注则是一种快速、一次性注射方式。我们已成功应用了这两种方法，但尚未在同一种转基因品系中直接比较泵注与推注的效果。
在中枢神经系统（CNS）中使用反义寡核苷酸（ASOs）是一种有效降低多种蛋白质总体水平和/或改变其剪接方式的强大手段。尽管我们仅将ASOs用作神经系统疾病的治疗方法，但我们认识到其他研究领域也可能从该技术中获益。只要目标蛋白在中枢神经系统中表达，且最终目标是实现全中枢神经系统范围内的基因表达改变，采用本文所展示的技术使用ASOs可能会非常有用。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;准备ALZET渗透泵&lt;/strong&gt; </td></tr><tr><td>Alzet 渗透泵 14 天</td><td>DURECT</td><td>型号 1002</td><td></td></tr><tr><td>Alzet 渗透泵 28 天</td><td>DURECT</td><td>Model 2004</td><td></td></tr><tr><td>Alzet 渗透泵 42 天</td><td>DURECT</td><td>Model 2006</td><td></td></tr><tr><td>2.5 mm 导管</td><td>PlasticsOne</td><td>3280PM/SPC</td><td>定制导管长度为2.5 mm</td></tr><tr><td>乙烯基导管管路</td><td>DURECT</td><td>7760</td><td>0.027&quot;，OD：0.045&quot;</td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠，冲洗用，USP</td><td>Baxter</td><td>2F7124</td><td>不可用于泵或管路中</td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠注射液，USP</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-4888-10</td><td></td></tr><tr><td>p60 一次性培养皿（已灭菌）</td><td>TRP</td><td>93060</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片（无菌）</td><td>Butler Schein</td><td>#007319</td><td></td></tr><tr><td>乳胶外科手套（无菌）</td><td>Micro-Touch</td><td></td><td>货号将取决于所需手套的尺寸</td></tr><tr><td>无菌毛巾单</td><td>Dynarex</td><td>4410</td><td></td></tr><tr><td>0.2 μm 注射器滤器</td><td>PALL</td><td>4192</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器（无菌）</td><td>BD</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;PUMP &amp;& BOLUS 手术方案&lt;/strong&gt; </td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11001-12</td><td></td></tr><tr><td>弯头止血钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>13009-12</td><td></td></tr><tr><td>精细尖头剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>弯头钝头剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14029-10</td><td></td></tr><tr><td>骨剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>16104-14</td><td></td></tr><tr><td>直型止血钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td>10 &amp;mu;l 气密，带可拆卸针头</td></tr><tr><td>针头</td><td>Hamilton</td><td>7758-04</td><td>26 号针头，尖端类型：2</td></tr><tr><td>5-0 尼龙缝合线</td><td>Covidient</td><td>SN-871</td><td></td></tr><tr><td>酒精棉片</td><td>选择</td><td>#521</td><td></td></tr><tr><td>棉签（无菌）</td><td>普尔itan</td><td>REF 806-WC</td><td></td></tr><tr><td>超级胶水</td><td>Loctite</td><td></td><td>长颈瓶</td></tr><tr><td>警告：快绿染料</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td>处理本产品时请佩戴护目镜和手套</td></tr><tr><td>抗生素软膏</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>眼膏</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>电动剃须刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% 聚维酮碘</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3% 过氧化氢</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>珠式灭菌器</td><td>SouthPointe 外科手术中心</td><td>GRM5-1450</td><td></td></tr><tr><td>小型动物立体定位</td><td>科普夫</td><td>Model 940</td><td></td></tr><tr><td>鼻锥</td><td>Kopf</td><td>Model 923-B</td><td></td></tr><tr><td>耳杆</td><td>Kopf</td><td>Model 921</td><td>该模型为可选方案</td></tr><tr><td>套管驱动器</td><td>Kopf</td><td>模型 1966</td><td></td></tr><tr><td>注射器固定架</td><td>Kopf</td><td>模型 1972</td><td></td></tr><tr><td>温度控制系统</td><td>Kopf</td><td>Model TCAT-2LV</td><td>可选</td></tr><tr><td>氧气/异氟烷系统</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

直接向啮齿类动物中枢神经系统脑室内给药

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

由于某些药物无法穿过血脑屏障，因此需要直接将其递送至中枢神经系统（CNS）。本实验室主要研究反义寡核苷酸（ASOs），但本视频中展示的技术也可用于将多种其他药物递送至中枢神经系统。反义寡核苷酸（ASOs）能够实现序列特异性靶点的敲低1，并可调节特定基因的亚型比例2。为了在小鼠中枢神经系统中实现广泛的基因敲低或剪接调控，可通过两种不同的给药途径将ASOs递送至大脑，本视频中将分别演示这两种方法。
第一种方法使用Alzet渗透泵，该泵连接一根导管，通过手术植入侧脑室。这种方法可将反义寡核苷酸（ASOs）持续输注到中枢神经系统内，持续指定的时间段。第二种方法是将高浓度的ASO单次弹丸式注射至右侧侧脑室。这两种方法均利用小鼠脑室系统，将ASO递送至全脑和脊髓；但根据具体研究需求，可能优先选择其中一种方法。

在泵注给药或脑室内（ICV）单次注射后的指定时间（我们通常使用四周），测试反义寡核苷酸（ASOs）的有效性非常重要。我们建议取大脑和脊髓的不同区域，通过定量实时PCR检测目标基因在mRNA水平的表达量/亚型，同时通过Western Blot或ELISA检测其蛋白水平（参见已发表的示例，图4）。这有助于评估ASOs在中枢神经系统不同区域的有效性。如果目标蛋白的半衰期较长，我们建议在ASO给药后延长观察时间，以评估蛋白表达抑制或剪接调节的最大效果。
检测寡核苷酸的分布情况也十分重要。泵输注可使寡核苷酸分布于同侧和对侧半脑，但通常在靠近脑室系统的区域可观察到较高的反义寡核苷酸（ASO）浓度16。脑室内（ICV）推注给药则可在中枢神经系统（CNS）内实现更均匀的寡核苷酸分布16，但其作用持续时间可能较短。我们建议读者参考 Southwell et al. 的研究，以了解泵输注与推注给药在寡核苷酸分布方面的直接比较结果16。
我们还建议测试反义寡核苷酸（ASOs）的多个剂量及其作用持续时间，因为每种ASO的行为会略有不同 体内ASO 通常具有相对较长的作用持续时间，在 ASO 递送后，靶标敲低或剪接调控的效果可持续数月。此外，不同 ASO 的效果存在差异，某些基因靶点也比其他靶点更容易实现敲低。因此，在筛选 ASO 以确定先导候选分子时，我们建议至少测试 3 至 5 种 ASO。 体内 每种反义寡核苷酸（ASO）使用 4–6 只成年小鼠作为初步实验样本量。
如果使用反义寡核苷酸以外的药物，还需针对该特定化合物优化理想的药物浓度、药物作用持续时间以及中枢神经系统内的药物分布。
<img alt="渗透泵和脑室内推注给药的大小鼠手术坐标表；前后、内外侧数据。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50326/50326table1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表 1"> 
表 1. 手术坐标。 在植入渗透泵或进行脑室内（ICV）推注给药时，用于定位小鼠和大鼠右侧侧脑室的坐标。渗透泵和ICV推注两种操作的坐标均以右侧侧脑室为靶点。我们采用两组不同的坐标，因为这是我们经验最丰富的方案，且已知可实现反义寡核苷酸（ASO）的良好分布。
<img alt="离体器官浴实验装置；生物力学；带标签的设备；肌肉收缩研究。" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
 图1. 立体定位装置。(A) 进行Alzet泵植入和团注给药手术所需的立体定位设备。i) 玻璃珠灭菌器。ii) 数字显示装置。iii) 带可动臂的立体定位基座。iv) 温度可控加热垫。v) 异氟烷/氧气系统。vi) 异氟烷麻醉舱。(B) 鼻罩和耳杆的特写。(C) 两种必需的附件。左侧：用于脑室内团注给药的注射器/针头固定装置；右侧：用于渗透泵植入的套管驱动器。
<img alt="使用套管、导管、注射器和脑室染料结果分析的立体定位大鼠脑灌注方法。" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. Alzet 渗透压泵植入。（A） 适用于小鼠的 Alzet 渗透压泵选项：14 天泵（0.25 μl/hr）、28 天泵（0.25 μl/hr）和 42 天泵（0.15 μl/hr）。（B） 以前囟为参考点的泵植入坐标：后向 -0.5 mm，外侧（右侧）-1.1 mm，腹侧 -2.5 mm（导管长度）。（C） 将导管穿过颅骨并用胶水固定套管后，通过导管冲洗染料，以评估导管在侧脑室中的位置是否正确。（D） 按照 （C） 中方法注入染料后立即灌注的小鼠脑组织。若导管成功植入脑室，染料将分布至小鼠整个脑室系统。
<img alt="脑内注射装置；立体定位示意图、注射器放置位置及脑室染料分布结果。" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 脑室内团注注射。（A） 从前囟开始的团注注射坐标：+0.3 mm 前部，-1.0 mm 外侧（右侧），以及 -3.0 mm 腹侧。（B） 将针头穿过颅骨插入至腹侧 -3.0 mm 后，通过注射器推注染料，以评估针头是否正确置于侧脑室。（C） 按照（B）中方式注射染料后不久灌注的大脑。若针头成功置入脑室，染料将分布至小鼠整个脑室系统。
<img alt="Rat SOD1 analysis; mRNA, protein levels; Western blot, bar charts; experimental results." fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
 图4. 反义寡核苷酸降低大鼠SOD1水平 体内 （图直接取自 Smith） 等 7）。（A-D） 反义 SOD1 寡核苷酸 SODr146192 或 SOD对照序列 持续28天向正常大鼠右侧脑室输注 100 μg/day. （A） 通过qRT-PCR检测脑和脊髓中内源性SOD1 mRNA水平。 (B) ASO灌注后SOD1和α-tubulin蛋白水平 (C 和 D) 不同脑区灌注后微管蛋白和SOD1的蛋白水平定量 (E) 将针对早老素1或GSK-3β的反义寡核苷酸（ASOs）注入非转基因小鼠右侧侧脑室，持续2周，随后检测右侧额叶/颞叶皮层中的mRNA水平。经美国临床研究学会许可转载。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50326/50326fig4large.jpg" target="_blank"> 单击此处查看大图</a>.
<img alt="啮齿类动物迷宫求解路径图，实验行为分析。" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig5.jpg" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326fig5highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 水平褥式缝合操作。 使用5-0尼龙缝合线从皮肤穿入穿出，起始于前部并向后部延伸，重点覆盖套管部位。当到达最后端位置后，缝合线再折返向上，再次跨过套管进行穿线。此方法可确保伤口正确闭合，并防止套管或导管穿透皮肤。

我们介绍了一种通过在小鼠右侧脑室植入导管或进行团注给药，将药物靶向递送至中枢神经系统的方法。本文重点介绍反义寡核苷酸的递送。该技术可轻松适用于其他药物以及大鼠。

由于无法穿过血脑屏障，某些药物需要直接递送至中枢神经系统（CNS）。我们的实验室专注于……

以下实验的总体目标是通过侧脑室将药物（如本方案中所示的反义寡核苷酸）直接递送至啮齿类动物的中枢神经系统。该目标可通过两种不同方法实现。第一种方法包括在外科手术中将一根金属导管植入小鼠右侧侧脑室，并将其连接至一个皮下植入的渗透压泵。一旦泵完成药物输注，可选择完全移除泵以终止治疗，或更换新泵以继续进行主动治疗。第二种给药方法是通过向右侧脑室注射单次推注剂量的药物。利用该方法可将定量药物快速灌注至整个中枢神经系统，从而证明反义寡核苷酸已成功递送至整个啮齿类动物的中枢神经系统。如本方案所示，应在寡核苷酸灌注后检测多个不同脑区中的 mRNA 和蛋白质水平。尽管该方法可用于指导如何将反义寡核苷酸直接递送至中枢神经系统，也可应用于其他药物，包括抗体、基因治疗药物、载体以及小分子化合物。所有外科手术必须在无菌条件下使用无菌器械和溶液进行，并遵循机构和政府的指导方针。详细信息可在文本方案和机构的 IACUC 指导方针中找到。将小鼠置于异氟烷诱导室中麻醉后，取出小鼠并进行足趾夹捏，以确认小鼠已完全失去意识后方可开始操作。快速剃除从肩部上方至两眼之间的毛发。然后小心而轻柔地将麻醉后的小鼠放置于立体定位仪上。将鼻罩罩住小鼠鼻子，并将气体流量导向立体定位仪。为保持小鼠处于麻醉状态，使用耳杆固定头部。此处使用可调平耳杆，但由于侧脑室体积较大，即使颅骨未完全水平，仍可准确靶向侧脑室。将异氟烷浓度下调至2%以维持麻醉，并涂抹眼膏。用浸有95%乙醇的棉签擦拭每只小鼠的头部和颈部上方，随后用浸有碘液的棉签擦拭，以消毒手术区域。同时，将无菌手术单覆盖在小鼠身上。确保小鼠的体温维持在37摄氏度。此处使用直肠探针反馈的温度控制加热系统。然后进行zat泵的植入。根据所需输注天数选择合适的泵，并按照方案文本部分的说明准备泵。从颈部基部向两眼之间区域做一切口后，将钝头剪刀向上弯曲的一侧朝上，平滑地插入颈部基部皮下。将剪刀向左后肢方向缓慢滑动，并稍微张开剪刀以形成一个皮下囊袋。先用无菌棉签擦拭颅骨使其清洁，再用浸有双氧水的棉签进行擦拭。为了增强bgma，使用弯止血钳小心地从锥形管中取出一个泵，确保泵不接触锥形管的管壁。用镊子夹住泵的基部，并将流量调节器完全推入。使用弯止血钳固定泵体，钳夹位置为流量调节器与管路的连接处。将泵插入颈部基部的皮下，并小心地向后推至左侧后肢，推进至无阻力处为止。使用弯止血钳时需注意，避免导管接触任何物体。在套管顶部与基座相接的凹槽处将其夹住。将套管推进器移至适当位置并固定。然后在套管底部滴一滴瞬干胶，将套管顶部推入推进器中，并调整位置使导管朝正后方。迅速操作，将导管尖端接触bgma，同时用手拉开皮肤，避免干扰，在数字显示屏上将坐标归零。使用弯止血钳抬起导管，并将其向右侧横向移动 1.1 毫米，向后方移动 0.5 毫米。如图所示，迅速将导管穿过颅骨，直至套管基部紧贴颅骨。由于小鼠颅骨相对较薄，可直接将导管穿过颅骨和小鼠组织。将带有胶水的皮肤从颅骨上拉开。然后用套管驱动器固定套管位置，等待一到两分钟，使胶水完全干燥。接着，用弯头止血钳固定套管位置，同时抬起驱动器。缓慢松开止血钳，确保套管已牢固固定在颅骨上。使用棉签按压套管顶部。将无菌大鼠骨剪插入套管顶部与基部之间的凹槽中，并保持骨剪水平。为避免将套管从颅骨上脱落，请在继续用棉签向下按压的同时，剪断套管顶部的颅骨夹。使用5-0尼龙缝线、普通止血钳和镊子，沿整个切口进行缝合，特别注意套管上方区域的缝合。在头部和颈部涂抹少量抗生素软膏。拧下耳杆并松开鼻锥。将小鼠从立体定位仪中取出，放置于加热垫上以恢复。术后每天监测小鼠，检查是否存在疼痛、不适或感染情况，并根据批准的实验方案，必要时使用卡洛芬等镇痛药进行处理。取出耗尽的泵时，应小心地将泵从位于小鼠背部、垂直于泵连接处的一个1.5厘米切口中拉出，操作过程中不得明显牵拉或推动导管。接着，在流量调节器上方约0.5厘米处剪断导管，并将瞬间胶（super glue）接触导管末端以将其封闭。等待一到两分钟，使胶水完全干燥。将导管重新放入切口，并缝合切口。在缝合后的皮肤上涂抹抗生素软膏，并将小鼠置于加热的恢复垫上。若需更换泵，请提前准备好新的泵以及一个装有95%乙醇的10厘米培养皿。使用镊子夹取新泵。然后将另一只手的手指浸入95%乙醇中，握住泵体。丢弃新的泵流量调节器，并小心地将旧泵从其流量调节器上取下。立即将泵连接到导管和套管上，当旧泵取下后，缓慢地将新泵滑入到位，确保流量调节器始终不接触小鼠体外表面。将新的泵通过切口重新置入皮下囊袋中，按之前的方法缝合皮肤，伤口处涂抹抗生素软膏，然后将小鼠放置于恢复垫上。术后需每日观察小鼠，检查是否存在疼痛、不适或感染情况，并根据需要给予镇痛剂以实施脑室内推注。按前述方法做头皮切口，清洁动物颅骨并用过氧化氢处理。然后将装有药物的注射器就位。将针头斜面朝向后方并固定。缓慢降低针头，直至接触bgma。将所有坐标归零，然后将针头向右侧横向移动1.0毫米，向前移动0.3毫米。缓慢推进针头穿透颅骨，直至针尖斜面顶端与颅骨上表面齐平。由于小鼠颅骨极薄，因此可实现上述操作。将Z坐标下调，以每秒1毫米的速度将针头降至-3.0毫米。等待2至3分钟，使脑组织在针头周围闭合。以每秒1微升的速度注入全部10微升反义寡核苷酸。等待两到三分钟。以每秒一微升的输注速率将寡核苷酸注入脑室。尽管不同药物的输注速率可能有所不同，但仍需将棉签紧贴针头基部的颅骨处。以每秒一毫米的速度拔出针头。一旦针头离开颅骨，立即用棉签按压针孔部位并持续按压一分钟，以防止药物外漏。缝合皮肤并涂抹抗生素软膏后，将小鼠置于加热的恢复垫上。根据寡核苷酸的浓度不同，完全恢复可能需要20分钟到数小时。术后仍需每天监测小鼠，检查是否存在疼痛、不适或感染情况，并根据需要给予镇痛药物。此图像显示了在通过快速绿染料灌注以验证zet渗透泵插入坐标是否准确进入脑室后，立即获取的灌注脑组织。如本视频所示，如果导管成功置入脑室，染料将分布至小鼠脑室系统的各个部分，如此处所示。该图像显示了在注射快绿染料以验证脑室内团注坐标准确性和操作流程后，小鼠灌注后的脑组织。如果针头成功置入脑室，染料将再次分布至小鼠整个脑室系统。以下图像显示了利用反义寡核苷酸实验在体内降低大鼠SoD1表达的结果。将SoD1寡核苷酸以每天100微克的剂量持续灌注28天至正常大鼠右侧侧脑室。该图像表明，脑和脊髓中内源性OD1 mRNA水平降低。通过Q-R-T-P-C-R检测，在OD1寡核苷酸灌注后，该图像显示SOD1蛋白水平也有所降低。在此处给予OD1反义寡核苷酸灌注后，对脑内不同区域的微管蛋白和OD1的蛋白水平进行定量分析，结果表明该SOD1寡核苷酸特异性介导SOD1的表达敲低。此外，将针对早老素1或GSK3β的寡核苷酸连续两周灌注至非转基因小鼠的右侧侧脑室，并检测其mRNA水平。该结果展示了使用反义寡核苷酸可调控的多种靶标。一旦掌握这些技术，只要操作得当，输注泵植入和推注给药均可在10分钟内完成。

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科研

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神经科学

啮齿动物的中枢神经系统药物直接脑室交货

对作用于中枢神经系统的药物进行全面的临床前测试，通常需要评估和比较不同给药途径下的药物生物分布。本文在小鼠中展示了三种常用的全身给药方法（静脉注射、腹腔注射和口服）以及一种局部给药方法（对流增强输送）。...

啮齿类动物模型中治疗中枢神经系统疾病的全身与局部药物递送

本文展示了两种截然不同的注射方法：1）脑内注射（脑室内注射）和...

通过脑室内（ICV）和静脉内（IV）注射在小鼠中递送治疗剂

来源：Poland, R. et al. 利用啮齿类动物脑部微量注射研究动机行为的分子基础。 J. Vis. Exp.

清醒啮齿类动物脑内基于显微注射的治疗剂递送

本视频展示了在小鼠模型中通过奥马耶（Ommaya）介导的脑室内注射技术。该方法可实现潜在药物候选物的局部递送，并避开血脑屏障。...

小鼠脑室内注射：一种经Ommaya导管向小鼠脑室直接给药的药物递送方法

来源：Chen, Y., et al．大鼠中枢神经系统中反义寡核苷酸的鞘内递送．J. Vis. Exp.

向大鼠中枢神经系统鞘内递送测试化合物

儿科疾病的动物模型可能出现早期发病和快速进展的病情。对幼年小鼠模型进行具有临床相关性的治疗给药在技术上可能较为困难。本方案描述了一种针对出生后前两天内的新生小鼠进行的无创静脉注射方法。...

新生小鼠静脉注射

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大鼠中枢神经系统中反义寡核苷酸的鞘内递送

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向大鼠和小鼠脑内动脉内递送神经干细胞：应用于脑缺血

本文介绍了一种无需使用脑立体定位仪的徒手操作方法，用于在小鼠中快速、简便地进行脑室内注射。...

小鼠脑室内自由手注射

我们介绍一种用于大鼠的直接迷走神经注射方案，可将药物直接递送至神经内部，且不会引起注射后的并发症。该方法适用于涉及自主神经系统调控的临床前神经科学研究。通过必要的修改，该技术也可用于大鼠及其他物种其他神经的直接注射。...

大鼠迷走神经直接注射操作方案

了解通过导管植入和单次推注注射两种方法，将反义寡核苷酸等药物直接递送至啮齿动物侧脑室的中枢神经系统给药技术。该方案适用于神经科学和药物递送研究。

直接向啮齿类动物中枢神经系统脑室内给药

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