Name: 一个模型研究人类巨噬细胞分化和极化的异质性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 学习从人外周血中分离单核细胞并通过密度梯度离心和阴性磁珠分选获得纯化CD14阳性细胞，进而诱导其向不同极化类型分化为巨噬细胞的方法。该模型可用于研究巨噬细胞功能异质性及炎症性疾病机制。

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感谢Nadine Wambsganss提供的出色技术协助。本工作由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，项目编号GL599/1-1）资助，部分由海德堡大学创新基金FRONTIER资助，资助对象为C.A.G.。

1. 实验方案
<ol>
 <li>缓冲液的配制方法如下：
 <ol>
 <li>制备PBMC分离用缓冲液：“洗涤缓冲液” = 含0.02% EDTA的PBS（使用0.5 M EDTA）。</li>
 <li>准备单核细胞分离缓冲液：“MACS 洗涤缓冲液” = 0.5% BSA（250 mg）+ 2 mM EDTA（200 μl）+ PBS（50 ml）。对缓冲液进行脱气处理。</li>
 <li>准备用于FACS染色及细胞保存的缓冲液：“FACS缓冲液”为含10% FCS的PBS，“固定缓冲液”为含1% PFA的PBS。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>从前臂静脉抽取30 ml全血，使用EDTA作为抗凝剂。</li>
 <li>按以下步骤分离PBMC（histopaque）：
 <ol>
 <li>准备两个无菌的50 ml离心管（不可使用聚苯乙烯材质）。</li>
 <li>将步骤2中的血液用PBS按1:1比例稀释。</li>
 <li>每管中加入 25 ml Histopaque 和 25 ml 全血/PBS。确保 Histopaque 与血液不要混合。</li>
 <li>在室温下以 400 × g 离心 30 分钟，不使用刹车。</li>
 <li>吸弃血浆。</li>
 <li>吸除不透明界面层，并用移液器转移至洁净的50 ml离心管中。</li>
 <li>加入 20 ml 含 0.02% EDTA 的 PBS。</li>
 <li>在 4 °C 条件下以 250 x g 离心 5 分钟。</li>
 <li>弃去上清液。</li>
 <li>加入10 ml含0.02% EDTA的PBS溶液。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>细胞计数方法如下：
 <ol>
 <li>涡旋振荡10秒，充分混匀。</li>
 <li>取200 μl细胞悬液 + 300 μl含0.02% EDTA的PBS + 500 μl台盼蓝染液（每10个方格200-500个细胞，否则调整稀释倍数）。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>按如下步骤进行单核细胞的阴性分离：
 <ol>
 <li>将步骤 3.10 获得的细胞在 120 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液。</li>
 <li>将细胞沉淀用 10 ml PBS + 0.02% EDTA 洗涤 2 次，每次 120 × g 离心 10 分钟。</li>
 <li>加入9 ml无菌水，持续3秒，再加入1 ml 10×PBS。</li>
 <li>用含0.02% EDTA的PBS再洗涤一次，120 × g离心10分钟。</li>
 <li>离心过程中计数。</li>
 <li>在 EasySep 缓冲液中稀释至 5 x 107/ml</li>
 <li>加入50 μl/ml单核细胞富集混合液。</li>
 <li>4 °C 下孵育 10 分钟。</li>
 <li>涡旋振荡珠子30秒。</li>
 <li>加入 50 μl/ml 珠子。</li>
 <li>4 °C 下孵育 5 分钟。</li>
 <li>用EasySep缓冲液补足至终体积2.5 ml。此时溶液呈棕褐色。</li>
 <li>放入磁铁中。</li>
 <li>室温下静置2.5分钟。在此期间，与磁珠结合的非单核细胞将移向管壁并附着于其上。</li>
 <li>将含有非结合单核细胞的缓冲液倒入新的无菌管中。该溶液呈乳白色。</li>
 <li>用含 0.02% EDTA 的 PBS 洗涤一次，120 × g 离心 10 分钟。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>将细胞以 0.5 x 10⁵ 的密度接种于塑料培养皿或多孔板中6/cm2. 加入1 ml培养基/1 × 106 细胞</li>
 <li>在感兴趣的条件下培养细胞6-14天。</li>
 <li>3天后换液，更换50%的培养基为新鲜培养基（参见 表1 详情请参见）。</li>
 <li>六天后收获细胞，用于mRNA提取、流式细胞术和蛋白质印迹分析 等等.</li>
</ol>

<ol><li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+and+macrophage+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).</li>
<li>Gordon, S., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+plasticity+of+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes.</a> European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).</li>
<li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization.</a> Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).</li>
<li>Ingersoll, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+gene+expression+profiles+between+human+and+mouse+monocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets.</a> Blood. 115, 10-19 (2010).</li>
<li>Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+aldose+reductase+during+foam+cell+formation+as+possible+link+among+diabetes%2C+hyperlipidemia%2C+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).</li>
<li>Gleissner, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCL4+downregulates+the+atheroprotective+hemoglobin+receptor+CD163+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages.</a> Circ. Res. , (2009).</li>
<li>Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXC+chemokine+ligand+4+induces+a+unique+transcriptome+in+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages.</a> J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).</li>
<li>Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+the+human+monocyte-to-macrophage+differentiation+and+polarization%3A+New+molecules+and+patterns+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression.</a> J. Immunol. 177, 7303-7311 (2006).</li>
<li>Verreck, F. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+il-23-producing+type+1+macrophages+promote+but+il-10-producing+type+2+macrophages+subvert+immunity+to+%28myco%29bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human il-23-producing type 1 macrophages promote but il-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).</li>
<li>Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+monocyte-derived+macrophages+under+serum-free+conditions+improves+their+tumor+promoting+functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions.</a> PLoS One. 7, e42656(2012).</li>
<li>Boyle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+intraplaque+hemorrhage+evokes+a+novel+atheroprotective+macrophage+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype.</a> American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).</li>
<li>Cho, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+dendritic+cell-like+phenotype+in+macrophages+during+foam+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation.</a> Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).</li>
<li>Vogt, G., Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+human+macrophages+with+enhanced+antimycobacterial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).</li>
<li>Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidized+low+density+lipoprotein+exposure+alters+the+transcriptional+response+of+macrophages+to+inflammatory+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).</li>
<li>Qin, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+THP-1+cells+as+a+model+for+mimicking+the+function+and+regulation+of+monocytes+and+macrophages+in+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature.</a> Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).</li>
<li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+pma-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5, e8668(2010).</li>
<li>Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. Isolation of human monocyte populations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWahl%2C+LM+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Waldo, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+macrophages+in+culture+and+in+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques.</a> Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).</li>
<li>Martín-Fuentes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+variation+of+scavenger+receptor+expression+in+human+macrophages+with+oxidized+low-density+lipoprotein+is+associated+with+a+differential+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response.</a> The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).</li>
</ol>

作者无需披露任何利益冲突。

单核细胞来源的巨噬细胞是先天免疫系统中的关键细胞类型。它们在包括动脉粥样硬化或癌症在内的多种炎症性疾病中发挥重要作用2。因此，研究巨噬细胞生物学对于加深我们对多种疾病发病机制的理解以及开发新型治疗方法至关重要。
许多研究采用过表达或缺失特定目的基因的小鼠模型。然而，在研究与人类疾病相关的单核细胞来源巨噬细胞过程时，这种方法似乎并非最佳选择，因为小鼠与人类的单核细胞及其衍生细胞之间存在显著差异4。因此，使用原代人类细胞的可靠模型似乎是研究巨噬细胞分化相关疾病机制的良好替代方案。
该方法的一个明显优势是 体外 此处介绍的模型的优势在于不依赖于THP-1或其他永生化细胞系 14-15尽管细胞系易于获取且无需频繁采血，但其在表型和功能上与原代细胞并不完全相同。因此，Cho 等 比较了原代人巨噬细胞的基因表达特征，并将其与先前发表的THP-1细胞数据进行了对比 12,14他们发现这两种细胞类型之间存在显著但中等程度...

单核细胞来源的巨噬细胞是先天免疫系统的重要细胞组分，在多种急性和慢性炎症过程中发挥重要作用1。巨噬细胞在动脉粥样硬化或癌症等多种炎症性疾病中具有关键作用2。巨噬细胞具有高度可塑性，能够根据局部微环境的不同而呈现不同的表型3。因此，研究巨噬细胞的分化与异质性，对于深入理解多种疾病的病理生理机制、发现新的治疗靶点以及开发新型疗法至关重要。
在许多情况下，小鼠模型被用于研究特定疾病的病理生理学。然而，使用小鼠模型研究巨噬细胞生物学存在若干局限性：（1）小鼠与人类外周血中白细胞亚群数量（即单核细胞和粒细胞）的比例存在显著差异，提示单核细胞在小鼠与人类病理生理过程中的作用不同。（2）小鼠与人类外周血单核细胞在基因表达方面存在显著差异，表明其在健康与疾病状态下的功能可能存在重大差别4。（3）用于鉴定小鼠单核细胞和巨噬细胞的多种标志物（F4/80、LyC、etc.）在人类髓系细胞中并不存在，使得小鼠模型的研究结果向人类情况的转化变得相当困难。
因此，为了加深对人类疾病中巨噬细胞分化与异质性的理解，我们需要利用能够作用于人类巨噬细胞的模型。为此，本文描述了一种易于使用的人类原代巨噬细胞生成模型，可用于研究由人单核细胞衍生的巨噬细胞 体外 在不同条件下导致不同类型的巨噬细胞极化。在多项研究中，我们使用了 体外 单核细胞来源的原代人巨噬细胞模型，用于分析巨噬细胞生物学及其在人类动脉粥样硬化中的潜在意义 5-7.
尽管尚未完全取代动物实验或获取的人体组织实验 死后该模型可用于识别和验证与多种人类疾病密切相关的疾病机制和治疗靶点。

<table><tbody><tr><td>50 ml 离心管（无菌）</td><td>Fisher</td><td>055398</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS（1X），液体（不含钙或镁）</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-8806</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasySep 人单核细胞富集试剂盒</td><td>StemCell Technologies</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 磁力架</td><td>StemCell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>FACS 管</td><td>Fisher</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Macrophage-SFM（1X）</td><td>Invitrogen</td><td>12065-074</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma</td><td>P-4458</td><td></td></tr><tr><td>Nutridoma-SP</td><td>Roche</td><td>11011375001</td><td></td></tr><tr><td>人 M-CSF 10 &amp;mu;g</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养板，6 孔</td><td>Fisher</td><td>07-200-80</td><td></td></tr></tbody></table>

一个 体外 研究人类巨噬细胞分化与极性异质性的模型

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

单核细胞来源的巨噬细胞是先天免疫系统中一种重要的细胞类型。在研究巨噬细胞生物学的小鼠模型中，由于小鼠与人源单核细胞来源的巨噬细胞在表型和功能上存在差异，因而受到限制。因此，本文描述了一种 体外 用于生成和研究人原代巨噬细胞的模型。简言之，从前臂静脉采集外周血后，通过密度梯度离心分离外周血单个核细胞，再利用阴性磁珠分离法从中获取单核细胞。随后，在特定条件下将这些单核细胞培养六天，以诱导不同类型的巨噬细胞分化或极化。该模型操作简便，避免了小鼠与人类之间因物种特异性差异所带来的问题。此外，该模型更接近于 体内 相比使用永生化细胞系，该模型具有更多生理相关条件。总之，本文所述模型适用于研究巨噬细胞生物学、鉴定疾病机制及新的治疗靶点。尽管尚不能完全替代动物实验或获取的人体组织研究 死后该模型可用于识别和验证与多种人类疾病密切相关的疾病机制和治疗靶点。

采用上述方案，我们通常可从 100 ml 血液中获得 25.1 x 106 ± 2.2 x 106 个单核细胞（26 次独立实验的平均值 ± 标准误，图 1A）。通过 CD14 流式细胞染色测定的单核细胞纯度通常高于 95%（97.1 ± 0.4%，3 次独立实验的平均值 ± 标准误，图 1B）。经台盼蓝染色测定的新鲜分离单核细胞活力通常大于 95%（数据未显示）。细胞最初呈圆形并悬浮生长，通常在数小时内开始贴壁。贴壁过程伴随细胞形态改变，呈现“煎蛋样”或纺锤样形态（图 2）。在含 M-CSF（100 ng/ml）的培养基中培养 6 天后，无论是否在最后 24 小时添加氧化型 LDL（100 μg/ml），未暴露于 oxLDL 的细胞中约有 80% 存活，而经 oxLDL 处理的细胞存活率约为 70%（图 3）。经 M-CSF 培养 6 天后的流式细胞分析显示，细胞仍表达白细胞标志物 CD45RO，但单核细胞标志物 CD14 的表达下调（图 4...

单核细胞来源的巨噬细胞是先天免疫系统的重要细胞。本文介绍了一种易于使用的 体外 通过密度梯度离心、阴性磁珠分选及特定的细胞培养条件，可获得单核细胞来源的巨噬细胞，用于表型与功能研究。

单核细胞来源的巨噬细胞是先天免疫系统中一种重要的细胞类型。研究巨噬细胞生物学的小鼠模型存在以下局限性：……

以下实验的总体目标是从人外周血中分离单核细胞，并将其诱导分化为不同极化类型的巨噬细胞。首先通过密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞，第二步采用阴性磁珠分离法获得纯化的CD14阳性单核细胞。接下来，在特定条件下培养单核细胞，以诱导产生特异性极化的巨噬细胞。最终，可通过定量PCR检测巨噬细胞极化标志物在其培养条件下表达的差异。该方法有助于解析巨噬细胞向不同极化类型分化的机制。这一特征在动脉粥样硬化等炎症性疾病中极为重要。从志愿者前臂静脉抽取30毫升全血后，将血液平均分装至两个非聚苯乙烯材质的50毫升锥形管中。然后在每管中加入10毫升PBS稀释血液。接下来，向每支试管中的25毫升全血和PBS中加入25毫升Histopaque，注意避免Histopaque与血液混合。然后在室温下以400 × g离心30分钟，离心过程中不设刹车。离心结束后，先吸除血浆层，再将不透明的界面层转移至新的50毫升离心管中。在250 ×g、4°C条件下，用20毫升含CDTA的PBS洗涤界面处的细胞，持续5分钟。弃去上清液后，将沉淀重悬于10毫升含CDTA的PBS中，并通过涡旋振荡10秒充分混匀细胞。随后，取200微升细胞悬液，加入300微升含EDTA的PBS和500微升台盼蓝，混匀。为了在血细胞计数板的10个方格中获得约200至500个细胞，首先通过以120 × g离心10分钟，重复三次，进行阴性分离。第二次洗涤后，将细胞沉淀重悬于9毫升无菌水中，持续3秒，然后加入1毫升10×PBS。再次洗涤并计数细胞后，将其用EasySep缓冲液稀释至每毫升5×10⁷个细胞。随后，将细胞与单核细胞富集混合液按每毫升50微升的量在4°C下孵育10分钟。孵育的最后1分钟时，将单核细胞富集磁珠涡旋振荡30秒。然后向每毫升细胞悬液中加入50 µL磁珠，并将磁珠与细胞悬液继续孵育5分钟。第二次孵育结束后，将细胞悬液体积调整至2.5 mL。加入更多 eep 缓冲液后，溶液将呈现棕褐色。接下来，将离心管置于 eep 磁铁中，在室温下放置 2.5 分钟。待磁珠结合的细胞充分吸附后，将含有未结合单核细胞的缓冲液倒入新的无菌离心管中。用 PBS 加 EDTA 洗涤未结合的细胞一次后，溶液将呈现乳白色，将细胞转移至多孔板中，然后向培养板中的每 1 × 10⁶ 个细胞加入一毫升培养基。最后，在特定的实验条件下培养细胞六天，以诱导巨噬细胞分化。在第三天更换一半培养基，第六天更换新鲜培养基。收获细胞以进行所需的实验分析。采用上述方案，通常可从100毫升血液中常规获得约25 × 10⁶个单核细胞，通过CD14流式细胞术染色测定的单核细胞纯度通常高于95%。单核细胞最初呈圆形，悬浮于培养液中，数小时内即开始贴壁。然而，经过六天培养后，它们会贴壁生长，呈现类似煎蛋或纺锤状的外观。在仅添加M-CSF的培养条件下，或在培养最后24小时加入氧化型LDL，未暴露于氧化型LDL的细胞中约有80%具有活性，通过碘化丙啶染色测定确认。而经氧化型LDL处理后，培养六天后的细胞存活率约为70%。在MCSF流作用下，流式细胞术分析表明，尽管细胞持续表达白细胞标志物CD45，但单核细胞标志物CD14的表达下调。根据可能在细胞培养过程中诱导巨噬细胞极化的特定条件，需要检测其他标志物以确认极化是否成功。特定条件可诱导巨噬细胞极化。例如，M1 极化的巨噬细胞表达典型的标志物，如 IL-6 和 TNF-α，而 M2 极化的巨噬细胞则表达 CD36 和 CD206。巨噬细胞还可通过功能实验进一步研究。例如，可使用荧光标记的低密度脂蛋白（LDL）来研究氧化型 LDL 的摄取。在此实验中，细胞被暴露于 10 µg/mL 的 DII 标记氧化型 LDL 中 4 小时，细胞核则用 DAPI 复染。直方图展示了经M-CSF诱导的巨噬细胞对DII标记的氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）摄取的流式细胞术检测结果，其中实心灰色直方图代表未处理的对照细胞，黑色空心直方图代表经氧化型低密度脂蛋白处理后的巨噬细胞。该技术使研究人员能够研究人源巨噬细胞的分化过程及其异质性。从而使其能够研究动脉粥样硬化等炎症性疾病，以鉴定新的疾病机制和新的治疗靶点。

an-vitro-model-to-study-heterogeneity-human-macrophage

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

一个<em在体外</em&gt;模型研究人类巨噬细胞分化和极化的异质性

本视频展示了将原代单核细胞诱导分化为巨噬细胞的过程。可通过粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）将原代人单核细胞分离并诱导为类似M1型的促炎表型，或通过巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导为类似M2型的抗炎表型。...

原代单核细胞体外培养及向巨噬细胞的分化

在本视频中，我们演示了一种诱导外周血来源的单核细胞分化并极化为M1或M2型巨噬细胞的方法。使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、脂多糖和干扰素-γ孵育可获得促炎性的M1型巨噬细胞，而使用巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素-4孵育则可诱导产生抗炎性的M2型巨噬细胞。...

单核细胞来源细胞向类巨噬细胞的分化与极化

本文描述了一种简便易行的自适应方法 体外...

利用骨髓来源巨噬细胞研究巨噬细胞极化

我们介绍一种简单高效的生成人巨噬细胞的方案。通过双密度梯度离心法处理血沉棕黄层，分离单核细胞，随后在特氟龙涂层细胞培养袋中将其分化为巨噬细胞。该方法可最大化巨噬细胞产量，并便于后续实验的细胞收获。...

通过双梯度离心法分离人单核细胞及其在特氟龙涂层细胞培养袋中向巨噬细胞的分化

双梯度离心法，人单核细胞，巨噬细胞分化，特氟龙涂层培养袋，细胞培养，外周血单个核细胞，Ficoll密度梯度，Percoll梯度，单核细胞分离，巨噬细胞

本文介绍了一种利用显微镜和荧光染色在活细胞培养中检测巨噬细胞胞外诱捕网（MET）生成的实验方案。该方案可进一步扩展，通过免疫荧光染色来检测特定的MET蛋白标志物。...

体外刺激与可视化分化人单核细胞来源巨噬细胞的胞外诱捕网释放

本方案描述了从人诱导性多能干细胞高效生成巨噬细胞的方法，以及对这些细胞进行后续表征的技术。通过细胞表面标志物表达、基因表达分析和功能检测，评估由诱导性多能干细胞衍生的巨噬细胞的表型与功能特性。...

由多能干细胞生成并表征人类巨噬细胞

本方案提供了一种研究结核分枝杆菌（Mycobacterium...

结核分枝杆菌感染后人单核细胞来源的M1和M2极化细胞的制备及流式细胞术分析

M2样肿瘤相关巨噬细胞（TAM）与肿瘤进展及癌症患者的不良预后相关。本方案提供了一份详细指南，可在14天内可重复地将THP-1类单核细胞分化并极化为M2样巨噬细胞。该模型为研究肿瘤微环境中TAM的抗炎作用奠定了基础。...

利用人单核样THP-1白血病细胞系诱导巨噬细胞分化并极化为M2样表型

本文介绍了一种评估植入物表面免疫调节潜力的详细实验方案 体外旨在提高现有实验方案的可靠性和可重复性，并推动进一步研究。通过使用人外周血单核细胞来源的巨噬细胞，检测其在钛材料表面培养时的分泌性细胞因子谱、mRNA表达及细胞表面标志物，以研究巨噬细胞的极化状态。...

在植入物表面极化并表征人单核细胞来源的M1与M2型巨噬细胞

单核细胞和巨噬细胞是具有高度可塑性和可重编程性的免疫细胞，在健康与疾病中发挥关键作用。它们通过启动特定的分化程序和表型，感知并响应多种多样的刺激。我们已建立了一种标准化的 体外...

人源单核细胞来源巨噬细胞的重编程模型 体外 检测方法

学习从人外周血中分离单核细胞并通过密度梯度离心和阴性磁珠分选获得纯化CD14阳性细胞，进而诱导其向不同极化类型分化为巨噬细胞的方法。该模型可用于研究巨噬细胞功能异质性及炎症性疾病机制。

一个体外研究人类巨噬细胞分化与极性异质性的模型

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