一个 体外 研究人类巨噬细胞分化与极性异质性的模型

以下实验的总体目标是从人外周血中分离单核细胞，并将其诱导分化为不同极化类型的巨噬细胞。首先通过密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞，第二步采用阴性磁珠分离法获得纯化的CD14阳性单核细胞。

接下来，在特定条件下培养单核细胞，以诱导产生特异性极化的巨噬细胞。最终，可通过定量PCR检测巨噬细胞极化标志物在其培养条件下表达的差异。该方法有助于解析巨噬细胞向不同极化类型分化的机制。

这一特征在动脉粥样硬化等炎症性疾病中极为重要。从志愿者前臂静脉抽取30毫升全血后，将血液平均分装至两个非聚苯乙烯材质的50毫升锥形管中。然后在每管中加入10毫升PBS稀释血液。

接下来，向每支试管中的25毫升全血和PBS中加入25毫升Histopaque，注意避免Histopaque与血液混合。然后在室温下以400 × g离心30分钟，离心过程中不设刹车。离心结束后，先吸除血浆层，再将不透明的界面层转移至新的50毫升离心管中。

在250 ×g、4°C条件下，用20毫升含CDTA的PBS洗涤界面处的细胞，持续5分钟。弃去上清液后，将沉淀重悬于10毫升含CDTA的PBS中，并通过涡旋振荡10秒充分混匀细胞。随后，取200微升细胞悬液，加入300微升含EDTA的PBS和500微升台盼蓝，混匀。

为了在血细胞计数板的10个方格中获得约200至500个细胞，首先通过以120 × g离心10分钟，重复三次，进行阴性分离。第二次洗涤后，将细胞沉淀重悬于9毫升无菌水中，持续3秒，然后加入1毫升10×PBS。再次洗涤并计数细胞后，将其用EasySep缓冲液稀释至每毫升5×10⁷个细胞。随后，将细胞与单核细胞富集混合液按每毫升50微升的量在4°C下孵育10分钟。

孵育的最后1分钟时，将单核细胞富集磁珠涡旋振荡30秒。然后向每毫升细胞悬液中加入50 µL磁珠，并将磁珠与细胞悬液继续孵育5分钟。第二次孵育结束后，将细胞悬液体积调整至2.5 mL。

加入更多 eep 缓冲液后，溶液将呈现棕褐色。接下来，将离心管置于 eep 磁铁中，在室温下放置 2.5 分钟。待磁珠结合的细胞充分吸附后，将含有未结合单核细胞的缓冲液倒入新的无菌离心管中。

用 PBS 加 EDTA 洗涤未结合的细胞一次后，溶液将呈现乳白色，将细胞转移至多孔板中，然后向培养板中的每 1 × 10⁶ 个细胞加入一毫升培养基。最后，在特定的实验条件下培养细胞六天，以诱导巨噬细胞分化。在第三天更换一半培养基，第六天更换新鲜培养基。

收获细胞以进行所需的实验分析。采用上述方案，通常可从100毫升血液中常规获得约25 × 10⁶个单核细胞，通过CD14流式细胞术染色测定的单核细胞纯度通常高于95%。单核细胞最初呈圆形，悬浮于培养液中，数小时内即开始贴壁。

然而，经过六天培养后，它们会贴壁生长，呈现类似煎蛋或纺锤状的外观。在仅添加M-CSF的培养条件下，或在培养最后24小时加入氧化型LDL，未暴露于氧化型LDL的细胞中约有80%具有活性，通过碘化丙啶染色测定确认。而经氧化型LDL处理后，培养六天后的细胞存活率约为70%。

在MCSF流作用下，流式细胞术分析表明，尽管细胞持续表达白细胞标志物CD45，但单核细胞标志物CD14的表达下调。根据可能在细胞培养过程中诱导巨噬细胞极化的特定条件，需要检测其他标志物以确认极化是否成功。特定条件可诱导巨噬细胞极化。

例如，M1 极化的巨噬细胞表达典型的标志物，如 IL-6 和 TNF-α，而 M2 极化的巨噬细胞则表达 CD36 和 CD206。巨噬细胞还可通过功能实验进一步研究。例如，可使用荧光标记的低密度脂蛋白（LDL）来研究氧化型 LDL 的摄取。在此实验中，细胞被暴露于 10 µg/mL 的 DII 标记氧化型 LDL 中 4 小时，细胞核则用 DAPI 复染。

直方图展示了经M-CSF诱导的巨噬细胞对DII标记的氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）摄取的流式细胞术检测结果，其中实心灰色直方图代表未处理的对照细胞，黑色空心直方图代表经氧化型低密度脂蛋白处理后的巨噬细胞。该技术使研究人员能够研究人源巨噬细胞的分化过程及其异质性。

从而使其能够研究动脉粥样硬化等炎症性疾病，以鉴定新的疾病机制和新的治疗靶点。