Name: 分离恶性疟原虫晚期感染的红细胞由磁性装置 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: 学习利用疟色素顺磁性分离恶性疟原虫晚期感染红细胞的方法。该技术可高效富集感染细胞并保持寄生虫侵袭能力，为疟疾研究提供纯净样本。

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本工作由巴拿马国家科学技术秘书处（SENACYT）资助，授予CS的PRB-009项目基金以及授予LC的博士奖学金。

除离心步骤外，本方案的所有操作均应在生物安全柜内进行，以保持样品无菌。
晚期阶段分离 P. falciparum感染的红细胞
由于疟原虫属的共有代谢产物——血红素（hemozoin）赋予了寄生虫顺磁性，因此利用该方法可以分离所有晚期阶段的疟原虫感染红细胞。建议在培养物中保持较高的寄生虫血症率（3-10%），以获得更好的分离产量，尽管典型的培养物通常含有2-4%的红细胞压积（红细胞体积百分比）和1-8%的寄生虫血症率（感染红细胞的百分比）。寄生虫的培养可参照Trager和Jansen1所述方法进行。
<ol>
 <li>每次进行裂殖体分离操作时，都必须组装一个简单的多部件装置。为此，使用 Miltenyi BioTec 的 LS 柱、Magnetic MidiMACS 分离器和 MACS MultiStand（图1）。首先，将磁力分离器固定在金属支架上，然后将磁性柱置于分离器上。
 </li>
 <li>在另一个离心管中（全程使用 50 ml 锥形管），混合 23.2 ml RPMI 1640 培养基与 750 μl 7.5% 碳酸氢钠，配制成工作液。另准备若干离心管，用于丢弃和收集寄生虫培养物的穿流液。
 </li>
 <li>向柱中加入 3 ml 工作液以平衡柱子，并将穿流液弃入废液管中。</li>
 <li>向柱中加入 8 ml 的 P. falciparum 培养物，确保当培养物即将完全推动工作液流出柱子时，立即用收集管替换废液管，以开始回收未结合的培养物。此步骤可避免进一步稀释培养物。</li>
 <li>当培养物完全流经柱子后，加入 1 ml 工作液，将残留在柱内的红细胞完全推出。</li>
 <li>洗涤步骤：向柱中再加入 3 ml 工作液，并将流出液体收集至“弃用”管中，以避免稀释另一管中作为穿流液保存的培养物。
 </li>
 <li>洗脱步骤：当 3 ml 工作液完全通过柱子后，将柱子从支架上取下，并置于一个 15 ml 离心管上方。</li>
 <li>再次向柱中加入 3 ml 工作液。此步骤可洗脱被柱内磁珠截留的晚期阶段寄生虫感染的红细胞。</li>
</ol>
注意： 此时，根据所需寄生虫的数量，可开始新一轮或多个轮次的收集，但显然受限于原始培养物中的寄生虫血症水平。只要流速保持稳定状态，该层析柱可重复使用。
<ol start="9">
 <li>收集寄生虫的浓缩：将含有洗脱液的15 ml离心管在室温下以150 × g离心5分钟，使被寄生的红细胞形成深色沉淀。
 </li>
 <li>弃去上清液，保留足够液体以取少量样品，并通过显微镜检测确定浓度和总产量（见下文步骤2）。</li>
 <li>此时，若晚期阶段寄生虫的分离与捕获已成功完成，可将收集的培养物再次与新鲜培养基共同孵育。</li>
 <li>将收集的寄生虫稀释至后续实验所需的体积和溶液中。</li>
</ol>
2. 纯度与得率分析
<ol>
 <li>使用血细胞计数板并在光学显微镜下计数，以确定所获得的寄生虫浓度。计数时，取10 μl收集的寄生虫与培养基的混合液，滴加到血细胞计数板盖玻片下方。计数血细胞计数板四个象限中的寄生虫数量，将总数除以4，再乘以104，即可得到每毫升感染红细胞的浓度。
 </li>
</ol>
注意事项： a) 混合液的浓度由用户在重悬沉淀时通过添加较多或较少的培养基来决定。建议工作浓度为 5.5 × 104 裂殖体每 &mu;升（通常通过加入100-300） &mu;l 加入收集的寄生虫中）。如果 20 &mu;该浓度的溶液加入至终体积100 μL中 &mu;将培养基与红细胞混合后，在典型的4%红细胞压积培养物中可获得约1%的寄生率。b) 在血细胞计数板下计数时需迅速完成，因为随着样品在计数室中干燥，红细胞会开始裂解。被感染的红细胞（应占多数）内部可见一个深色斑点，可借此与未感染的红细胞区分。 
<ol start="2">
 <li>进行薄层吉姆萨染色，以评估收集物的纯度：将载玻片在10%甲醇中迅速固定，干燥后浸入用蒸馏水稀释的20%吉姆萨染色液中。染色10分钟，随后可自然晾干并在显微镜下观察。寄生率应可达到70%以上。</li>
</ol>

<ol><li>Jensen, J. B., Trager, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+in+culture%3A+use+of+outdated+erythrocytes+and+description+of+the+candle+jar+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum in culture: use of outdated erythrocytes and description of the candle jar method.</a> J. Parasitology. 63 (5), 883-886 (1977).</li>
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<li>Hebbel, R. P., Eaton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathobiology+of+heme+interaction+with+the+erythrocyte+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Pathobiology of heme interaction with the erythrocyte membrane.</a> Semin. Hematol. 26 (2), 136-149 (1989).</li>
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<li>Hempelmann, E., Marques, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+malaria+pigment+from+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of malaria pigment from Plasmodium falciparum.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 32 (1), 25-30 (1994).</li>
<li>Fitch, C. D., Kanjananggulpan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+ferriprotoporphyrin+IX+in+malaria+pigment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The state of ferriprotoporphyrin IX in malaria pigment.</a> J. Biol. Chem. 262 (32), 15552-15555 (1987).</li>
<li>Moore, L. R., Fujioka, H., Williams, P. S., Chalmers, J. J., Grimberg, B., Zimmerman, P. A., Zborowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemoglobin+degradation+in+malaria-infected+erythrocytes+determined+from+live+cell+magnetophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Hemoglobin degradation in malaria-infected erythrocytes determined from live cell magnetophoresis.</a> FASEB J. 20 (6), 747-749 (2006).</li>
<li>Spadafora, C., Gerena, L., Kopydlowski, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+in+vitro+invasive+capabilities+of+Plasmodium+falciparum+schizonts+isolated+by+Percoll+gradient+or+using+magnetic+based+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of the in vitro invasive capabilities of Plasmodium falciparum schizonts isolated by Percoll gradient or using magnetic based separation.</a> Malaria J. 10, 96(2011).</li>
<li>Jackson, K. E., Spielmann, T., Hanssen, E., Adisa, A., Separovic, F., Dixon, M. W., Trenholme, K. R., Hawthorne, P. L., Gardiner, D. L., Gilberger, T., Tilley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+permeabilization+of+the+host+cell+membrane+of+Plasmodium+falciparum-infected+red+blood+cells+with+streptolysin+O+and+equinatoxin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Selective permeabilization of the host cell membrane of Plasmodium falciparum-infected red blood cells with streptolysin O and equinatoxin II.</a> Biochem. J. 403, 167-175 (2007).</li>
<li>Goodyer, I. D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+mature-stage+Plasmodium+falciparum+by+gelatine+flotation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Trop.+Med.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation.</a> Ann. Trop. Med. Parasitol. 88 (2), 209-211 (1994).</li>
<li>Pasvol, G., Wilson, R. J., Smalley, M. E., Brown, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+viable+schizont-infected+red+cells+of+Plasmodium+falciparum+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Trop.+Med.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Separation of viable schizont-infected red cells of Plasmodium falciparum from human blood.</a> Ann. Trop. Med. Parasitol. 72, 87-88 (1978).</li>
<li>Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+cells+and+subcellular+particles+with+Percoll%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+Biophys.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fractionation of cells and subcellular particles with Percoll.</a> J. Biochem. Biophys. Methods. 44 (1-2), 1-30 (2000).</li>
<li>Paul, F., Roath, S., Melville, D., Warhurst, D. C., Osisanya, J. O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+malaria-infected+erythrocytes+from+whole+blood%3A+use+of+a+selective+high-gradient+magnetic+separation+technique%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Separation of malaria-infected erythrocytes from whole blood: use of a selective high-gradient magnetic separation technique.</a> The Lancet. 318, 70-71 (1981).</li>
<li>Trang, D. T., Huy, N. T., Kariu, T., Tajima, K., Kamei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+concentration+of+malarial+parasite-infected+red+blood+cells+and+removal+of+contaminating+white+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Malar.+J%22%5BJournal%5D)">One-step concentration of malarial parasite-infected red blood cells and removal of contaminating white blood cells.</a> Malar. J. 3, 7(2004).</li>
<li>Nillni, E. A., Londner, M. V., Spira, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+separation+of+uninfected+erythrocytes+from+those+infected+with+Plasmodium+berghei+and+for+isolation+of+artificially+released+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Parasitenkd%22%5BJournal%5D)">A simple method for separation of uninfected erythrocytes from those infected with Plasmodium berghei and for isolation of artificially released parasites.</a> Z. Parasitenkd. 64, 279-284 (1981).</li>
</ol>

我们无任何披露事项。

疟原虫（P. falciparum）的体外培养物寄生率有限，在培养增殖达到高峰时，仍有超过一半的红细胞未被感染。大多数科研实验希望仅使用被感染的红细胞进行研究。为此，有必要采用一种分离技术，根据感染状态将培养物分离开来。有效的方法包括使用链球菌溶血素 O（streptolysin O）选择性通透并裂解未感染的红细胞11，以及一系列利用两类细胞密度差异的差速离心法。其中一些方法包括明胶漂浮法12和使用Plasmion的方法13，但最常用的介质是密度梯度介质Percoll，它可通过形成不同密度的分层来分离不同类型的红细胞，但可能对疟原虫具有一定的毒性14。
我们采用了一种最初由 Paul 描述并由 Trang 进一步分析的技术15, 16，该技术基于疟色素（haemozoin）的顺磁性。疟色素是寄生虫在消化血红蛋白过程中产生的一种惰性晶体。正如我们课题组在其他文献中所报道的，该方法具有非侵入性，且似乎不会影响寄生虫的生物学活性，这一点可通过治...

<table><tbody><tr><td> RPMI 1640 Hepes 改良型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4130</td><td>添加 10% 人血清、2% 葡萄糖和 0.2% 碳酸氢钠</td></tr><tr><td>MidiMACS 分离器</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand 支架</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>LS 分离柱</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td> 血细胞计数板</td><td>Grafco</td><td>Grafco Neubauer Chamber</td><td>可通过其他多个供应商获得</td></tr></tbody></table>

利用磁性方法分离晚期阶段感染的plasmodium falciparum红细胞

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

与其他疟原虫物种不同， P. falciparum 可在实验室中培养，便于对其进行研究 1. 虽然能达到的寄生虫血症水平可以达到 &asymp;40% 的上限时，研究者通常将比例维持在约 10%。在许多情况下，有必要将含有寄生虫的红细胞（RBCs）与未感染的红细胞分离，以富集培养物并推进特定实验。 
当P. falciparum感染红细胞时，该寄生虫会降解血红蛋白并以其为营养来源2, 3。然而，寄生虫必须应对其中一种毒性极强的含铁血红素基团4, 5。寄生虫通过将血红素转化为一种惰性的晶体聚合物——疟色素（haemozoin），从而避免其毒性作用6, 7。这种含铁分子被储存在寄生虫的食物泡中，其所含金属的氧化状态与血红素中的不同8。疟色素中铁处于三价状态，使其具有顺磁性，而未感染的红细胞则无此性质。随着寄生虫在红细胞内逐渐成熟，疟色素的含量也随之增加9，使得红细胞内晚期阶段的P. falciparum顺磁性进一步增强。
基于这种顺磁性，可通过将培养物通过含有磁珠的色谱柱来分离恶性疟原虫（P. falciparum）感染的红细胞晚期阶段。当含有磁珠的色谱柱置于磁铁架上时，磁珠会被磁化。由于感染的红细胞具有顺磁性，它们将被截留在色谱柱内，而流出液则主要包含未感染的红细胞以及含有寄生虫早期阶段的红细胞。
本文介绍了使用磁性柱富集晚期阶段寄生虫群体的方法，该方法可保持寄生虫良好的活性10。完成此操作后，未结合的培养物可放回培养箱，使残留的寄生虫继续生长。

在图2中显示了培养物通过磁性柱前(A)和操作后(B)的情况。通常在100倍放大视野下可见1至2个被感染的红细胞，如图2所示，箭头指向图2A中的被感染红细胞。在典型操作中，起始培养物的寄生率约为5%（图2A），经此操作后通常可获得寄生率为97%–100%的红细胞（图2B）。寄生率富集达20倍左右易于实现，根据需要或预期，多次让培养物通过磁柱可高效获得大量晚期阶段感染的P. falciparum红细胞。
<img src="/files/ftp_upload/50342/50342fig1.jpg" alt="磁性分离过程示意图；用于细胞纯化实验的色谱柱和磁性分离装置设置。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt...

利用血色素的顺磁性分离晚期阶段 恶性疟原虫-在培养中生长的感染红细胞。该方法简便快速，且不影响寄生虫后续的侵袭能力。

利用磁性方法分离晚期阶段感染的Plasmodium falciparum红细胞

与其他疟原虫物种不同，恶性疟原虫（P. falciparum）可在实验室中进行培养，这为其研究提供了便利¹。尽管达到的寄生虫血症水平可升至……

恶性疟原虫是一种仅在红细胞内生存的人体寄生虫。在生长过程中，它利用红细胞内的分子作为营养来源；由于血红蛋白中的铁分子对寄生虫具有毒性，因此寄生虫会将其摄取并转化为一种名为血红素的惰性晶体。这种血红素晶体使寄生虫具有一定的顺磁性。正是利用这种顺磁性，可将被感染的红细胞与未携带寄生虫的红细胞分离开。通过使用磁铁，可将寄生虫比例极低的培养物浓缩至寄生率接近百分之百。在许多需要研究寄生虫特定性状的实验中，去除大量未感染红细胞的干扰因素，实现被感染与未被感染红细胞的分离，具有重要意义。此处展示的方法快速、简单，且对寄生虫无害。今天我们将描述恶性疟原虫裂殖体阶段的分离步骤。每次进行分离操作时，都需要组装这一多组分设备。首先将柱支架置于金属架上，然后将磁性柱放置在支架上。在本实验中，我们使用 Miltenyi 的 LS 柱。接下来，使用 50 ml 离心管加入 23.2 ml RPMI 1640 培养基和 750 µl 7.5% 碳酸氢钠溶液，此混合液即为本步骤的工作液。为确保实验顺利进行，在开始前必须对柱子进行校准。为此，加入 3 ml 工作液，液体将流入标记为废弃的 50 ml 离心管中。然后向层析柱中加入 8 ml 恶性疟原虫 FCI 培养液。注意观察，一旦培养液将工作液的最后部分推出层析柱，立即将离心管更换为下方另一个 50 ml 离心管。开始收集培养物。当培养物流经层析柱的流速停止后，向柱中加入1 ml工作液，以推动未结合的红细胞。随后，向柱中加入3 ml工作液，并切换至废弃管，以免改变培养物的比例。当三毫升溶液流经层析柱后，将其从支架上取下，并置于任意一个15毫升离心管上。接着，加入三毫升工作溶液。此步骤将洗脱被层析柱内珠粒捕获的chizen。根据所进行的实验，我们可以收集到所需数量的寄生虫。如果我们的培养物中裂殖体含量较高，则可能在第一次收集时就获得所需的虫体量。否则，由于柱子的结合能力可能低于培养物中的虫体含量，我们可以将培养物多次通过柱子，从而收集到更多的寄生虫。完成此步骤后，将15 ml离心管在150 ×g条件下离心5分钟。离心后，可在管底观察到沉淀形成。随后弃去上清工作液，保留足够液体以便通过显微镜检测确定产量。然后我们可以决定在此时停止或重复收集；如果需要，可继续在同一支 15 ml 离心管中收集更多的 chizen。该实验步骤可用于侵袭实验、寄生虫同步化以及生长实验。

separation-plasmodium-falciparum-late-stage-infected-erythrocytes

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

分离<em&gt;恶性疟原虫</em&gt;晚期感染的红细胞由磁性装置

本文描述了一种用于脑型疟疾寄生虫滞留的体外模型1。恶性疟原虫感染的红细胞被筛选以结合永生化的人脑微血管内皮细胞。筛选获得的寄生虫表现出独特的表型。该筛选方法可应用于多种P.

Plasmodium falciparum 寄生虫与人脑微血管内皮细胞黏附的筛选方法

荧光原位杂交（FISH）可用于鉴定单个细胞中的mRNA转录本，从而分析多基因活性，例如在恶性疟原虫感染的红细胞中同时转录var多基因家族中的多个成员1。该技术具有可适应性，可应用于不同类型的基因、细胞和生物体。...

单细胞基因转录的RNA荧光原位杂交（FISH）分析

我们已经开发出一种 体外 疟疾-HIV-1 共感染模型用于研究其影响 恶性疟原虫...

一种用于研究人类原代单核细胞来源免疫细胞中Plasmodium falciparum与HIV-1相互作用的体外共感染模型

本方法研究临床分离株中Plasmodium...

一种血小板介导的聚集现象简易实验方案 恶性疟原虫资源匮乏环境下感染性红细胞的检测

本视频展示了一种基于流式细胞术的吞噬作用检测方法，涉及标记并经调理的颗粒...

一种定量检测抗体介导的吞噬寄生虫感染红细胞的实验方法

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高产量纯化Plasmodium falciparum裂殖子用于调理抗体检测

人类微小RNA从宿主红细胞转运至Plasmodium falciparum寄生虫。本文描述了将合成的微小RNA转染到宿主红细胞以及从P. falciparum中分离全部RNA所使用的技术。此外，本文还将详细介绍一种用于分离P.

研究小型RNA与Plasmodium falciparum核糖体占据率调控作用的方法

本文介绍了一种利用衰减全反射红外光谱仪结合多元数据分析，对感染红细胞水相中Plasmodium...

通过衰减全反射红外光谱法与多元数据分析检测与定量无细胞红细胞中Plasmodium falciparum

在这项工作中，我们描述了研究细胞外囊泡（EVs）释放作用的实验方案 恶性疟原虫...

疟疾感染期间细胞外囊泡功能的评估

本方案的总体目标是指导如何测定自然暴露于恶性疟原虫（Plasmodium...

测量自然获得性诱导吞噬作用的抗体 恶性疟原虫 基于流式细胞术的寄生虫检测方法

利用聚焦离子束铣削技术，从浸冻的生物样品中制备用于冷冻电子断层扫描的玻璃态原位薄片。...

使用双束扫描电子显微镜制备玻璃态生物样品薄片用于冷冻电子断层扫描

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