Name: 在肿瘤血管生成中使用荧光共聚焦电视显微镜活体成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: 学习使用荧光共聚焦电视显微镜对小鼠结肠肿瘤模型进行活体成像，定量分析功能性毛细血管密度和渗漏指数，以评估肿瘤血管生成和内皮壁通透性。该方法可用于研究肿瘤微循环并评价靶向治疗效果。

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5 minutes

1. 对比剂的制备
<ol>
	<li>对于70 kDa的FITC-葡聚糖，注射剂量为500 mg/kg（以20 g体重小鼠为例，将10 mg FITC-葡聚糖溶于0.1 ml生理盐水中）。</li>
	<li>该试剂不宜长时间暴露于光照下。为避免荧光淬灭，建议用铝箔包裹试管。</li>
</ol>
2. 麻醉
<ol>
	<li>小鼠通过腹腔注射混合物进行麻醉，该混合物由赛拉嗪（Rompun 2%，Bayer，Puteaux，法国）和氯胺酮（Kétamine 500，Virbac，Carros，法国）按1:4比例配制，对于20 g小鼠，剂量分别为66 mg/kg和264 mg/kg。</li>
</ol>
3. 目标器官的制备
<ol>
	<li>我们在小鼠感兴趣区域（例如皮下肿瘤处）进行剃毛。动物毛发在呈白色时通常具有自发荧光，而在呈黑色时会吸收光线。</li>
	<li>切开面向待成像器官的皮肤。在注射对比剂前，必须等待出血停止，否则对比剂会渗入血液并污染图像。</li>
</ol>
4. 数据采集
<ol>
	<li>通过颈静脉或尾静脉注射造影剂。在未使用荧光造影剂的情况下，所观察器官中无或仅有极低的背景信号。</li>
	<li>将探头置于待成像器官前方。在本研究中，该器官为肿瘤。</li>
	<li>打开激光以照射肿瘤，并观察毛细血管中的荧光信号。</li>
	<li>通过缓慢移动探头并同时进行记录，手动扫描肿瘤以可视化毛细血管网络。保持手部稳定非常重要，该技术需要一定的操作经验。在本研究中，第一步实现了功能性毛细血管密度的定量分析。</li>
	<li>第二步为随时间的动态图像采集。在本研究中，我们使用了70 kDa的FITC-葡聚糖。大多数正常器官中无间质渗漏现象，但在肿瘤中存在。为了在一段时间内对同一位置进行成像（如本研究情况），必须建立一套系统以固定探头于感兴趣区域。我们通过自制支架固定探头，并在探头尖端涂抹少量超声耦合凝胶来实现。在开始记录前，需花费时间稳定与肿瘤接触的探头位置。一旦位置固定，仅因小鼠呼吸产生轻微移动。打开激光，每30秒采集3幅图像，持续20分钟，以检测毛细血管渗漏情况。每次采集后关闭激光，以减少造影剂的光漂白。</li>
	<li>在本实验中，小鼠在操作结束后被处死，以便对肿瘤进行组织学分析。</li>
</ol>

<ol><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+concepts+of+the+angiogenic+process%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Fundamental concepts of the angiogenic process.</a> Curr Mol Med. 3 (7), 643-651 (2003).</li>
<li>Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibered+confocal+fluorescence+microscopy+%28Cell-viZio%29+facilitates+extended+imaging+in+the+field+of+microcirculation.+A+comparison+with+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Res%22%5BJournal%5D)">Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy.</a> J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).</li>
<li>Charnley, N., Donaldson, S., Price, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging angiogenesis.</a> Methods Mol Biol. 467, 25-51 (2009).</li>
<li>Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Taillieu, F., Cuenod, C., Siauve, N., Clement, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+contrast+enhanced+optical+imaging+of+capillary+leakage%5BTitle%5D)+AND+%22Technol+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">Dynamic contrast enhanced optical imaging of capillary leakage.</a> Technol Cancer Res Treat. 10 (1), 49-57 (2011).</li>
<li>Kurose, I., Kubes, P., Wolf, R., Anderson, D. C., Paulson, J., Miyasaka, M., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+nitric+oxide+production.+Mechanisms+of+vascular+albumin+leakage%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of nitric oxide production. Mechanisms of vascular albumin leakage.</a> Circ Res. 73 (1), 164-171 (1993).</li>
<li>Faye, N. F. L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+capillary+leakage+is+involved+in+the+onset+of+anaphylactic+hypotension%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Macromolecular capillary leakage is involved in the onset of anaphylactic hypotension.</a> Anesthesiology. , (2012).</li>
<li>Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular Capillary Leakage Is Involved in the Onset of Anaphylactic Hypotension. Anesthesiology. 117 (5), 1072-1079 (2012).</li>
<li>Tozer, G. M., Kanthou, C., Baguley, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupting+tumour+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Disrupting tumour blood vessels.</a> Nat Rev Cancer. 5 (6), 423-435 (2005).</li>
<li>Ntziachristos, V., Schellenberger, E. A., Ripoll, J., Yessayan, D., Graves, E., Bogdanov, A., Josephson, L., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+antitumor+treatment+by+means+of+fluorescence+molecular+tomography+with+an+annexin+V-Cy5.5+conjugate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Visualization of antitumor treatment by means of fluorescence molecular tomography with an annexin V-Cy5.5 conjugate.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12294-12299 (2004).</li>
<li>Cuccia, D. J., Bevilacqua, F., Durkin, A. J., Merritt, S., Tromberg, B. J., Gulsen, G., Yu, H., Wang, J., Nalcioglu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+quantification+of+optical+contrast+agent+dynamics+in+rat+tumors+by+use+of+diffuse+optical+spectroscopy+with+magnetic+resonance+imaging+coregistration%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">In vivo quantification of optical contrast agent dynamics in rat tumors by use of diffuse optical spectroscopy with magnetic resonance imaging coregistration.</a> Appl Opt. 42 (16), 2940-2950 (2003).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

肿瘤微循环的研究对于理解肿瘤生长、播散及对治疗反应的病理生理学机制至关重要1。光学成像是一种可用于观察毛细血管的技术，通过使用荧光对比剂，可对形态学参数（功能性毛细血管密度）和功能参数（渗漏指数）进行量化分析。
本研究中采用的荧光显微成像技术具有一定的优势与局限性。其优势之一在于能够选择所用对比剂的分子大小。本实验中使用70-kDa FITC-葡聚糖，其在实验初期经内皮屏障的渗漏极少，从而能够观察初始的血管形态（扭曲度、无序网络结构， 等等血管与间质之间具有良好的对比度的血管区域 8，延迟后，在20分钟的观察期间出现造影剂渗漏。平面内（xy）分辨率为高（3.5 &mu;微米级分辨率使我们能够在显微水平上观察血管和间质，而大多数其他成像技术（如MRI、CT、超声、PET）仅能提供宏观水平的图像&hellip;最后，这是实时成像，意味着可以实时观察到正在发生的变化。
然而，该技术也存在一些缺点。仪器操作较为精细，探针非常小（1.8 mm），表面光滑且容易滑动，难以在肿瘤...

血管生成是一个复杂的过程1，涉及从已有的血管形成新的血管。由小动脉、毛细血管和小静脉组成的组织微循环的病理变化，与多种疾病相关，例如癌症、炎症或糖尿病。因此，开发用于定量评估微血管结构与功能的方法至关重要。成像技术能够以非侵入性或微侵入性的方式，在活体（in vivo）中实时研究微血管，并可在同一动物体内进行随时间重复的多次测量2。
目前，动态对比增强（DCE）成像3常用于评估组织微循环。动态对比增强成像是指通过随时间追踪静脉注射示踪剂在体内的生物分布情况的一种技术。通过该成像方法，可提取反映组织血管化的定量参数。DCE成像最常与CT、MRI或超声联合使用。然而，这些成像技术通常无法直接观察微血管，因为其分辨率（除非使用特定的实验装置）大多仍停留在宏观水平。
本文中，我们拟在显微尺度下研究肿瘤血管系统 体内 使用动态对比增强光学成像结合光纤共聚焦视频显微技术。我们采用了一种大分子对比剂（FITC-葡聚糖），其根据分子量以及所研究组织内皮的特性，可完全保留在血管内或通过内皮屏障渗漏至间质中 4这使得能够通过准确勾画血管来研究微血管结构，同时通过其在间质中的渗漏和积聚来研究毛细血管通透性。

<table><tbody><tr><td>胰岛素注射器&lt;br/&gt; Myjector 1ml&lt;br/&gt; 29G</td><td>Terumo Europe</td><td>BS-05M2913</td><td></td></tr><tr><td>异硫氰酸荧光素标记的70 kDa葡聚糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>01619HH</td><td>100 mg/mL &lt;br/&gt; 用生理盐水稀释</td></tr><tr><td>光纤共聚焦视频显微镜</td><td>Cellvizio - MaunaKea Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LEICA FCM1000校准与清洗套件</td><td>Leica Microsystems</td><td>LSU-488</td><td>4 &amp;deg;C下保存</td></tr><tr><td>ProFlexTM Z探头</td><td>MaunaKea Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>图像拼接软件</td><td>MaunaKea Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血管检测软件</td><td>MaunaKea Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

体内 肿瘤血管生成的荧光共聚焦视频显微成像

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

纤维共聚焦荧光 体内 使用光纤束成像的原理与荧光共聚焦显微镜相同，可激发荧光 原位 通过光纤传输元素，然后记录部分发射的光子， 通过 相同的光纤。光源为激光器，通过光纤束内的元件将激发光传送至样品，随着对样品的扫描，逐像素地重建图像。由于扫描速度极快，结合专用的图像处理软件，可实时获得每秒12帧的图像。
我们开发了一种技术，利用共聚焦荧光视频显微镜设备对毛细血管的形态和功能进行定量表征。实验的第一步是在肿瘤的四个象限中分别录制5秒的视频，以可视化毛细血管网络。所有视频均使用软件（ImageCell，Mauna Kea Technology，法国巴黎）进行处理，该软件可围绕选定的直径（本研究中为10 μm）自动分割血管。由此，我们可量化“功能性毛细血管密度”，即血管总面积与图像总面积的比值。该参数是微血管密度的替代标志物，而微血管密度通常需通过病理学工具进行测量。
第二步是记录肿瘤持续20分钟的影像，以量化大分子对比剂通过毛细血管壁渗漏到间质中的情况。通过测量间质内信号强度与血管内信号强度的比值，得到一个“渗漏指数”，作为毛细血管通透性的替代指标。

利用收集到的数据，我们可以定量分析反映微循环的不同参数。
我们在BALB/c小鼠体内植入的结肠肿瘤中，通过注射分子量为70 kDa的荧光大分子造影剂异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-dextran，Sigma-Aldrich，Saint-Quentin Fallavier，法国），并在激发波长488 nm、发射波长520 nm（与我们的成像系统兼容）的条件下，使用光纤共聚焦荧光视频显微系统（Cellvizio，Maunakea Technology，巴黎，法国2）研究了其外周血管网络的in vivo成像。
实验的第一步是在肿瘤的四个象限中分别录制5秒的视频，以观察毛细血管网络。这使得我们能够对肿瘤血管化情况进行代表性取样。所有视频均使用一种软件（ImageCell，Mauna Kea Technology，Paris，France）进行处理，该软件可对围绕选定直径（本实验中为10 μm，涵盖直径5–20 μm的血管）的图像中的血管进行自动分割。由此，我们可量化“功能性毛细血管密度”（FC...

本文介绍了一种分析肿瘤微血管的方法 体内 采用动态对比增强荧光视频显微技术。获取两个定量参数：反映肿瘤血管密度的功能性毛细血管密度，以及反映内皮壁通透性的渗漏指数。

光纤束式活体荧光共聚焦成像采用与荧光共聚焦显微镜相同的原理。它可激发……

以下实验的总体目标是利用共聚焦荧光视频显微系统，在小鼠结肠肿瘤模型中定量微循环。该目标通过首先静脉注射对比剂并记录肿瘤微血管的动态影像来实现。随后对肿瘤的四个象限进行成像，从而实现功能性毛细血管密度的定量分析。接下来，通过观察造影剂从血管进入间质的过程，定量分析反映血管内皮壁通透性的毛细血管渗漏指数。最终，可对肿瘤血管的形态学和功能特征进行量化，以检测不同肿瘤模型之间或靶向治疗后的差异。这种动态对比增强光学成像技术可实现对肿瘤微循环的分析。通过量化毛细血管的密度和通透性，反映肿瘤血管的结构与功能。尽管该方法可为肿瘤生理学提供深入见解，但也同样适用于其他系统，如过敏性休克、炎症、心血管疾病和糖尿病。首先对麻醉后的小鼠在目标部位进行剃毛。止血后，切开皮肤，使待成像器官朝向视野。注射造影剂以定量功能毛细血管密度。首先将探头置于待成像器官前方。接下来打开激光，照射器官。然后保持手部稳定，缓慢移动探头进行记录，直至观察到荧光标记的毛细血管网络。为了在时间上稳定动态采集，先在探头尖端涂抹少量超声耦合剂，然后将探头置于手动支撑装置中。将探头与目标器官接触后，稳定探头位置。待位置固定后，设置激光每30秒采集3幅图像，持续20分钟，以检测是否存在毛细血管渗漏。在每次记录之间关闭激光器，以减少对比剂的漂白；在感兴趣器官的四个象限中各记录5秒的视频，用于可视化毛细血管网络。使用适当的软件，对选定直径范围内的血管进行自动分割，以量化功能性毛细血管密度，即血管总面积与图像总面积的比值。随后，基于动态采集数据以检测毛细血管渗漏的存在，在毛细血管内和间质中分别选取三个感兴趣区域，于0、5、10和20分钟时间点进行分析。最后，对三个不同毛细血管及其相邻间质区域的信号强度取平均值，并计算渗漏指数百分比。根据此公式，其中 IP 代表血管周围或间质的强度，II 代表血管内的强度，功能性毛细血管密度参数是微血管密度的替代标志物，通常使用病理学工具进行测量。此处展示了所获得图像类型的示例以及血管分割的结果。在此示例中，测得的功能性毛细血管密度为 36%。在这些图像中，显示了注射后 0、5、10 和 20 分钟时，对比剂在间质中渗漏的示例，其渗漏指数为 1.47。在每幅图像中，注射后血管表现为高信号的线状结构。间质中未见信号。然而，随着时间推移，可观察到对比剂通过异常的肿瘤组织渗漏至间质中。掌握内皮屏障实验技术需要一定的经验积累。然而，一旦熟练掌握，若操作得当，该技术可在30分钟内完成。

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