Name: PRP作为一种新的方法，以防止感染的制备及抗菌性能的PRP (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: 学习制备富血小板血浆（PRP）的标准化方案，用于评估其体外抗菌性能。该方法通过双重离心法从供体兔血液中分离PRP，经凝血酶激活后与细菌接种物共孵育，测定菌落形成单位（CFU）以验证其抗菌效果。

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作者感谢 Therwa Hamza、John E. Tidwell、Nina Clovis 和 Suzanne Smith 提供实验协助，并感谢 Suzanne Smith 进行校对。作者还感谢 John Thomas 博士提供细菌临床分离株，以及 John B. Barnett 博士的支持，以及允许使用西弗吉尼亚大学微生物学、免疫学与细胞生物学系的生物安全实验室。作者感谢骨科内固定与创伤护理基金会和美国国家科学基金会（#1003907）提供的经费支持。显微镜实验和图像分析还在西弗吉尼亚大学影像设施中完成，该设施部分由 Mary Babb Randolph 癌症中心和美国国立卫生研究院资助项目 P20 RR016440 支持。
动物采血使用已获得西弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会批准。所有实验均按照所有相关指南、法规和监管机构的要求执行。

1. PRP 的制备与激活
1.1 采血
<ol>
	<li>通过吸入异氟烷（2% 溶于O₂）对兔子进行麻醉。2 用于诱导和维持（诱导用1%，维持用1%）。</li>
	<li>吸取 2 ml 0.129 M 的三钠柠檬酸（抗凝溶液）至一支 20 ml 注射器中。该三钠柠檬酸溶液的制备方法为：将 1.897 g 三钠柠檬酸溶解于 50 ml 蒸馏水 H2O 并使用 0.22 μm 无菌滤器过滤。</li>
	<li>使用70%乙醇对兔耳进行消毒。</li>
	<li>采血（例如 通过连接至注射器的蝶形针（25 G）从兔耳静脉采集 5 ml 血液。</li>
	<li>将血液与枸橼酸三钠溶液轻轻混匀，血液与枸橼酸三钠溶液的体积比为9:1。</li>
</ol>
1.2 PRP 的制备（图 1）
<ol>
	<li>将抗凝血液转移至一个50 ml塑料离心管中。取10 μl血液样本，用于通过血细胞计数法测定基础血小板计数。</li>
	<li>在配有摆动转子的离心机中，以300 × g离心10分钟，室温（RT）条件下进行。将加速度和刹车速度均设为低档（图1）。</li>
	<li>离心后，血液分为三层。底层主要为红细胞，中间层（通常称为“白膜层”）富含血小板和白细胞，上层主要为血浆（血液的液体成分）以及部分血小板（图1）。小心将离心管转移至细胞培养罩内，避免扰动各层。使用1 ml塑料移液器，将全部血浆、白膜层以及约2–3 mm厚的红细胞层转移至一个15 ml塑料离心管中。</li>
	<li>将上述转移的样本再次离心，3,000 × g离心15分钟，室温（RT）条件下进行。上层液体（上清液）为血小板贫乏血浆（PPP），将其转移至新的离心管中。</li>
	<li>通过使用PPP调节剩余血液样本中的血小板浓度，获得PRP，使血小板浓度达到2.0 × 106 个/μl（通过血细胞计数法确定）。</li>
</ol>
1.3 PRP 激活
<ol>
	<li>通过将 5,000 IU 牛凝血酶溶解于 5 ml 10% 氯化钙中，配制工作浓度为 1,000 IU/ml 的 PRP 激活液。</li>
	<li>将激活液加入 PRP 和 PPP 中，并通过反复吹打混匀溶液，形成 PRP 凝胶和 PPP 凝胶。激活液与 PRP 或 PPP 的体积比为 1:4。</li>
</ol>
2. 体外 使用杀灭曲线法对PRP进行抗菌测试（图2)
<ol>
	<li>使用无菌接种环，从S. aureus的过夜平板培养物中挑取数个菌落，接种于含有5 ml Mueller Hinton肉汤（MHB）的塑料管中。短暂涡旋混匀后，于37 °C孵育2小时。随后，使用分光光度计测定细菌培养液的光密度，并根据预先建立的标准曲线，调整至光密度相当于约1 × 108 CFU/ml。</li>
	<li>用PBS进行100倍稀释，获得1 × 106 CFU/ml的菌悬液，并将接种物置于冰上保存。</li>
	<li>准备并标记无菌的一次性5 ml圆底聚苯乙烯试管，按照表1所示设置以下各实验组，每管终体积为2 ml。</li>
	<li>先向聚苯乙烯试管中加入PRP、PPP或PBS，随后加入凝血酶溶液以启动凝胶形成。接着加入MHB，最后加入S. aureus接种物（1 × 106 CFU/ml），使终浓度达到1 × 105 CFU/ml。</li>
	<li>将试管置于37 °C，以150 rpm的转速进行振荡孵育。</li>
	<li>在预设的时间点（例如 0、1和2小时），通过反复吹吸混匀各管中的溶液（此步骤至关重要，因为细菌可能被包裹在PRP凝胶内）。取10 μl样品，用无菌0.9%生理盐水进行系列稀释，然后取每种稀释液100 μl涂布于胰蛋白酶大豆琼脂平板（TSA，含5%羊血）上，用于CFU计数。</li>
	<li>将琼脂平板于37 °C过夜培养，随后计数并记录平板上的菌落数。以时间为横坐标（小时），CFU/ml为纵坐标，在对数坐标系中绘制数据曲线。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

由于富含血小板血浆（PRP）具有促进愈合的特性，其在临床应用中日益广泛15-17。在本研究中，PRP被提出作为一种预防感染的新方法。研究发现，PRP对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌（MSSA）、A族链球菌以及淋病奈瑟菌具有显著的抗菌作用。与传统抗生素治疗相比，PRP在预防感染方面具有以下主要优势：（1）目前的抗生素治疗正面临挑战，包括日益增多的抗生素耐药性报道14,18-20。PRP可能成为一种先进的替代方案，因为(i) PRP中的血小板杀菌蛋白可能具有趋化性，可吸引中性粒细胞、单核细胞和T细胞等免疫细胞，这些细胞在抵御病原体入侵中发挥重要作用21；且(ii) 与传统抗生素相比，由于细菌难以改变其细胞膜结构，血小板杀菌蛋白更不易诱导细菌产生耐药性22。（2）PRP不仅能减少感染，还能促进伤口愈合；而感染和伤口愈合均在创伤、时间和经济成本方面代价高昂。
富血小板血浆（PRP）近年来受到越来...

植入物相关感染是一种重要的临床并发症。金黄色葡萄球菌（S. aureus）是植入物相关感染中分离到的最常见微生物之一。该菌能够形成覆盖在植入物表面的生物膜，可能导致抗生素耐药性感染1,2。治疗植入物相关感染通常需要长期住院，进行反复清创以及长期的肠外抗生素治疗。在抗生素耐药的情况下，可能需要移除植入物。细菌对抗生素耐药性的不断上升已被美国疾病控制与预防中心（CDC）称为“全球最紧迫的健康问题之一”。若不开发新的有效抗菌治疗方法，未来多重耐药病原体可能无法用常规抗生素治愈。因此，预防植入物相关感染至关重要，亟需新的预防性药物或策略来防止此类感染的发生。
富血小板血浆（PRP）是一种自体血液的浓缩物，含有超过30种生长因子，有助于骨组织及骨移植材料的愈合3-5。由于血小板释放的多种生长因子浓度较高，临床上关于应用PRP促进骨再生和软组织成熟的报道日益增多。
PRP 的若干特性表明，PRP 可能也具有抗菌特性6-9。PRP 含有大量血小板、高浓度的白细胞（可能对细菌和真菌具有宿主防御作用）以及多种抗菌肽7,8,10。在一项针对大量心脏外科患者的大样本研究中发现，术中在伤口闭合时使用 PRP 凝胶可显著降低浅表性和深部胸骨感染的发生率11。基于这些理由和观察结果，我们提出假设：PRP 除了已被广泛研究的促进愈合特性外，还具有抗菌特性。使用 PRP 预防感染的潜在优势可能包括：（i）与传统抗生素治疗相比，PRP 诱导耐药性的可能性更低。（ii）PRP 还具有促进愈合的特性，可能对预防感染产生协同作用；PRP 的促愈合特性可形成一种屏障，阻止细菌黏附，从而降低感染风险，因为病原体与人体细胞在植入物表面存在竞争性黏附12,13。（iii）PRP 本身具有生物相容性，安全且无传播性疾病的风险。
我们的长期目标是将富血小板血浆（PRP）作为一种预防植入物相关感染的新方法。本研究的目的是采用两次离心法制备PRP，检测PRP的体外抗菌特性，并描述评估此类抗菌特性的实验方案。

<table><tbody><tr><td>牛凝血酶</td><td>King Pharmaceuticals, Inc</td><td>60793-215-05</td><td>凝血酶（牛源）</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>King Pharmaceuticals, Inc</td><td>60793-215-05</td><td>10% 氯化钙</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>巴克斯特</td><td>1001936060</td><td></td></tr><tr><td>Mueller Hinton 肉汤</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>275710</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>三水合柠檬酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆琼脂</td><td>Fisher Scientific</td><td>R01202</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>Kendro Laboratory Products</td><td>750043077</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>默克密理博</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr></tbody></table>

prp 作为一种预防感染的新方法：制备与 体外 prp的抗菌特性

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

由于抗生素耐药性日益增强、耐药菌在动物与人类之间的传播以及治疗感染的高昂成本，植入物相关感染正对全球医疗行业带来越来越大的挑战。
本研究中，我们提出一种新策略，该策略可能通过富血小板血浆（PRP）潜在的抗菌特性，有效预防植入物相关感染。由于PRP（一种生物制品）在促进组织修复方面已有充分研究，其临床应用日益广泛，包括骨科手术、牙周及口腔手术、颌面外科手术、整形外科手术、运动医学等。
PRP 可能是预防植入物相关感染的传统抗生素治疗的一种先进替代方案。与传统抗生素治疗相比，使用 PRP 可能具有优势，因为 PRP 诱导抗生素耐药性的可能性较低，且 PRP 的抗菌作用和促进愈合特性可能在预防感染方面产生协同效应。众所周知，病原体与人体细胞会竞争植入物表面，而 PRP 促进愈合的特性可能增强人体细胞的黏附，从而降低感染风险。此外，PRP 本身具有生物相容性，安全性高，且无传染性疾病传播风险。
在本研究中，我们选取了多种常引起骨科感染的临床细菌菌株，并检测了富血小板血浆（PRP）是否对其具有 体外 对这些细菌具有抗菌特性。我们采用两次离心法制备PRP，该方法可使所有样本获得相同的血小板浓度。我们获得了稳定的抗菌结果，发现PRP具有显著的抗菌作用 体外 对甲氧西林敏感和甲氧西林耐药细菌的抗菌特性 金黄色葡萄球菌， A组 链球菌，以及 Neisseria gonorrhoeae因此，PRP 的使用可能有助于预防感染，并减少对昂贵的植入物相关感染术后治疗的需求。

PRP 通过两次离心法可重复地制备（图1发现PRP具有显著作用（菌落形成单位减少高达100倍） 体外 对耐甲氧西林的抗菌特性 S. aureus （耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）（图3），在全球范围内的医院中普遍存在 14同样，PRP 对甲氧西林敏感菌具有强效的抗菌特性 S. aureus （MSSA），A组 链球菌，以及 Neisseria gonorrhoeae.
 
两次离心法可获得相同血小板浓度的富血小板血浆（PRP）即 2.0 × 106 血小板μl）但在血液中浓度较高（约为基线水平的10倍； 图4）并使我们能够获得一致的抗菌结果；不同个体动物的PRP在CFU结果上无显著差异（即 已观察到兔子。
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与植入物相关的感染是一种重要的临床并发症。本研究介绍了一种利用富血小板血浆（PRP）预防植入物相关感染的方法，提供了制备血小板浓度恒定的PRP的实验方案，并报道了PRP newly identified 的抗菌特性以及用于检测这些抗菌特性的相关实验方案 体外

PRP 作为一种预防感染的新方法：制备与 体外 PRP的抗菌特性

植入物相关感染由于抗生素耐药性日益增加，正逐渐成为全球医疗行业越来越严峻的挑战，……

本实验的总体目标是体外检测富血小板血浆（PRP）的抗菌特性。首先，从供体兔中分离富血小板血浆；接着，制备细菌接种物，然后用凝血酶激活PRP，并与细菌接种物混合。孵育混合物、样品，并测定生成的菌落形成单位。通过比较经PRP处理的样品与对照样品中菌落形成单位（CFU）的减少情况，可证明PRP的抗菌特性。若无PRP处理，与传统的BOL治疗相比，富血小板血浆诱导BOL耐药的可能性较低。它还具有促进伤口愈合的特性，可能对预防感染产生协同作用。在本实验方案中，采用了双重离心法，将PRP中的血小板浓度标准化为每微升约10^6个血小板，约为血液中基础浓度的10倍，并使用了富含白细胞的PRP。由于白细胞也参与直接杀灭细菌以及抗原特异性的免疫反应，这可能有助于PRP的抗菌特性。首先通过吸入异氟烷对兔子进行麻醉。用20毫升注射器抽取2毫升0.129摩尔/升的三钠柠檬酸盐。使用70%乙醇对兔子耳朵进行消毒。使用25号蝶形针从兔耳静脉采血，并通过轻柔振荡将血液与枸橼酸钠溶液混合。将抗凝血液转移至50毫升塑料离心管中。取10微升血液样本，使用血细胞计数法在水平转子离心机中测定血小板基础值。将加速度和刹车速度设为低速，在300 G下离心血液10分钟。在室温下，小心将离心管转移至细胞培养超净台，避免扰动各层。将全部血浆富集层及2至3毫米厚的红细胞层转移至一个15毫升塑料管中。在3000 Gs条件下离心15分钟。室温下，将乏血小板血浆的上清液转移至新的管中。通过用PPP调整剩余血样中的血小板浓度，使血小板浓度达到每微升2 × 10⁶个，该数值由金黄色葡萄球菌（S. aureus）过夜划线接种的血琼脂平板经血细胞计数确定。挑取五个菌落接种于5毫升Muller-Hinton肉汤中，涡旋混匀。松开瓶盖，在37°C下孵育2小时。使用分光光度计读取光密度。根据预先确定的标准曲线，将接种物调整至相应的光密度。用 PBS 进行 100 倍稀释，以获得每毫升 1 × 10⁶ CFU，并将接种物置于冰上。准备并标记无菌的一次性5毫升圆底聚苯乙烯管。根据所示样本组，先加入P-R-P-P-P-P或PBS，然后加入凝血酶溶液以进行激活。接下来，加入穆勒-欣顿肉汤，然后加入ESUs接种物，以获得每毫升1×10⁵ CFUs的终浓度。将试管在37°C下孵育，以每分钟150转的速度进行圆周振荡，并在预定的时间点取样。混匀每支试管中的溶液，以确保细菌未被困在PRP凝胶内部。取每个样品 10 微升，用无菌 0.9% 生理盐水进行系列稀释，然后用移液器将每种稀释液各 0.1 毫升点样于三磷酸大豆琼脂平板上。用于菌落形成单位（CFU）计数培养时，将琼脂平板在 37 摄氏度下培养过夜。然后计数并记录平板上的菌落。以时间为横轴，以每毫升菌落形成单位（CFU）为纵轴，将数据绘制在对数坐标上。在纵轴上，富血小板血浆通过两次离心法可重复地制备。PRP 对多种细菌具有强效抗菌特性，包括耐甲氧西林和敏感型金黄色葡萄球菌、链球菌属以及淋病奈瑟菌，在1小时和2小时时间点均表现出杀菌作用。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）在全球范围内的医院中普遍存在。该杀菌实验表明。PRP 在体外对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）具有较强的抗菌活性，在1小时和2小时时间点均表现出显著效果。定量分析表明，与PPP和PBS对照组相比，使用PRP在1小时时间点可使菌落形成单位（CFU）减少高达100倍。通过两次离心法制备的PRP血涂片显示，其血小板数量约为全血的10倍，这一优势有助于获得稳定且可重复的实验结果。血小板的数量和质量是影响本实验成功的关键因素。通过该方法，可进一步评估其他细菌菌株，同时也可在体内检测富血小板血浆（PRP），以研究其在动物感染模型中所具有的抗微生物特性。该技术为PRP领域的研究人员探索PRP在动物及临床环境中预防感染和促进伤口愈合的潜在应用奠定了基础。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

PRP作为一种新的方法，以防止感染的制备及<em在体外</em&gt;抗菌性能的PRP

本文介绍了基于质粒回收和限制性酶切位点插入的嵌合体组装方法（CAPRRESI），该方案通过将限制性酶切位点插入同义DNA序列并实现功能性质粒的回收。该方法是一种快速且低成本的蛋白编码基因融合技术。...

CAPRRESI：通过质粒回收与限制性酶切位点插入实现嵌合体组装

本研究旨在描述使用配备30号针头的医用注射枪，在5 mm深度下，对23名雄激素性脱发患者头皮进行三次、每次0.20...

机械性与可控性PRP注射治疗雄激素性脱发患者

该方案介绍了 大肠杆菌基于选择性压力将非天然氨基酸（ncAAs）引入乳酸乳球菌抗菌肽乳酸链球菌肽（nisin）中。其特性可在重组表达过程中被改变 通过...

通过非经典氨基酸的选择性压力整合产生的抗菌肽

我们描述了一种利用一系列同基因型抗生素抗性大肠杆菌（Escherichia coli）进行抗生素去重的平台。通过表达相应抗性基因的大肠杆菌（E.

利用抗生素耐药性平台进行抗生素去重

本方案介绍了一种可制备富血小板血浆（PRP）的装置，用于在100%自体成纤维细胞培养系统中促进细胞的体外扩增。...

自体富血小板血浆的制备及其在体外人成纤维细胞扩增中的促进作用

本方案旨在描述如何研究金黄色葡萄球菌（Staphylococcus...

改良的酶保护实验用于研究Staphylococcus aureus的内化作用及抗菌化合物的胞内活性

我们介绍四种利用纳米颗粒和纳米结构表面评估其抗菌活性的方法 体外...

纳米颗粒与纳米结构表面抗菌活性的评估 体外

本方案总结了在洁净室环境中最大限度降低微生物负荷的最佳实践，包括环境监测、工艺监测和产品无菌检测等策略。该方案适用于需要符合现行良好组织操作规范和现行药品生产质量管理规范标准的生产和检测机构。...

洁净室环境与细胞治疗中的微生物控制与监测策略

目前尚缺乏一种用于评估实验室环境中朊病毒污染常见区域及有效去污染方法的检测手段。本文所述方案为实施实验室朊病毒安全拭子检测提供了关键基础，且该方法可轻松调整，以满足不同实验室的具体需求。...

朊病毒安全实验室拭子检测

我们介绍了一种利用逆转录病毒转导技术制备抗原特异性小鼠T细胞的实验方案...

小鼠T细胞中T细胞受体的逆转录病毒转导

学习制备富血小板血浆（PRP）的标准化方案，用于评估其体外抗菌性能。该方法通过双重离心法从供体兔血液中分离PRP，经凝血酶激活后与细菌接种物共孵育，测定菌落形成单位（CFU）以验证其抗菌效果。

PRP 作为一种预防感染的新方法：制备与体外 PRP的抗菌特性

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