Name: 核小体阵列从重组核心组蛋白和核小体定位的DNA组装 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 学习利用重组核心组蛋白和核小体定位DNA组装核小体阵列的方法，通过沉降速度实验和原子力显微镜监测组装效果。该技术有助于深入理解染色质结构与基因调控机制。

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本研究获得了美国国立卫生研究院（NIH）授予J.C.H.的GM45916和GM66834基金项目以及国际Rett综合征基金会授予A.K.的博士后奖学金资助。此外，本研究还获得了美国国立卫生研究院（NIH）GM088409基金项目和霍华德·休斯医学研究所对K.L.的资助。

1. 重组核心组蛋白的八聚体组装
原理：核小体阵列重建的第一步是从冻干的重组核心组蛋白中制备天然的核心组蛋白八聚体。将核心组蛋白以等摩尔量混合，并通过透析使样品从变性缓冲液转入复性缓冲液，从而组装成组蛋白八聚体。
<ol>
	<li>纯化并冻干重组核心组蛋白（H2A、H2B、H3、H4），步骤如下所述13.</li>
	<li>将每种冻干的核心组蛋白约 5 mg 溶解于 3 ml 变性缓冲液（6 M 盐酸胍，20 mM Tris pH 7.5，5 mM DTT）中。每份样品溶解时间至少为一小时，确保容器壁上无残留蛋白质。</li>
	<li>使用去折叠缓冲液作为参比，在276 nm处测定每种组蛋白的吸光度。</li>
	<li>使用各组蛋白的消光系数计算其摩尔浓度（参见 表1 用于 非洲爪蟾 组蛋白消光系数）。将根据吸光度测定的组蛋白浓度与冻干重量进行比较，并评估大部分蛋白质是否已溶解。</li>
	<li>确定哪种组蛋白的摩尔数最少，因为这将决定所有组蛋白的摩尔数上限。</li>
	<li>等摩尔量混合组蛋白，并用变性缓冲液稀释至终浓度为1 mg/ml。</li>
	<li>将样品放入截留分子量为6-8 kDa的透析管中。密封透析管并置于2 L冷变性缓冲液（2 M NaCl，10 mM Tris pH 7.5，1 mM EDTA，5 mM β-巯基乙醇）中。</li>
	<li>在 4 °C 下搅拌透析样品 18 小时。确保透析管能够自由且充分旋转，否则组蛋白可能发生沉淀。</li>
	<li>在18小时内更换两次透析缓冲液（即 每隔约6小时更换一次复性缓冲液，直至完成。即使出现沉淀，也不要丢弃样品，因为仍可能回收部分八聚体，尽管得率会有所降低。</li>
</ol>
注意：参见步骤 2.1-2.2，为第二天准备柱平衡。
2. 通过尺寸排阻色谱纯化组蛋白八聚体
原理：在完成第1部分后，样品中将含有组蛋白八聚体以及其他组蛋白复合物，例如聚集体、H3/H4四聚体和H2A/H2B二聚体。将使用尺寸排阻色谱法（SEC）将组蛋白八聚体与其他这些复合物分离纯化。
<ol>
	<li>将 HiLoad 16/60 Superdex200 16/60 (S200) 柱连接至 FPLC 系统。确保无气泡进入系统。</li>
	<li>使用 0.2 μm 滤过的水清洗 S200 柱。流速设为 0.3 ml/min，并设定背压上限为 0.5 MPa。确保有足够的水，并让柱子过夜清洗。</li>
	<li>使用复性缓冲液平衡 S200 柱及 FPLC 的进样环。使用 1 L 经 0.2 μm 过滤的复性缓冲液。以 1 ml/min 的流速和不超过 0.5 MPa 的压力，使复性缓冲液流经柱子约 2 小时。</li>
	<li>用 1 ml 复性缓冲液预平衡 Vivaspin 离心浓缩器（50 kDa MWCO）。从透析袋中取出样品，在 4 °C 下离心以去除任何沉淀物。用移液器将样品上清液转移至浓缩器中，浓缩至体积约为 500 μl。</li>
	<li>将浓缩后的八聚体样品转移至新容器中，并用 1 ml 复性缓冲液冲洗浓缩器。将冲洗液浓缩至 500 μl 后加入八聚体样品中。这有助于回收残留在浓缩器中的八聚体。</li>
	<li>将样品在 1.5 ml 微量离心管中于 4 °C、10,000 rpm 离心 5 分钟。收集上清液并转移至新管中。此步骤有助于在上样至 FPLC 前去除任何沉淀物。</li>
	<li>将样品上样至 S200 柱。单次纯化时最大上样体积为 1.5 ml 或八聚体总量不超过 15 mg。</li>
	<li>使用新配制的复性缓冲液进行洗脱。流速为 1 ml/min，背压上限为 0.5 MPa。使用两倍柱体积（400 ml）的复性缓冲液，收集 2 ml 的馏分。在洗脱过程中监测 280 nm 处的吸光度。不同组分将按分子尺寸从大到小依次洗脱。组蛋白聚集体通常在约 45 ml 洗脱，八聚体在约 65 ml，二聚体在约 84 ml（图 1）。</li>
	<li>通过 18–20% SDS-PAGE 分析目标峰对应的洗脱馏分。含有纯化八聚体的馏分中，四种核心组蛋白蛋白应具有相等的摩尔量（图 1）。</li>
	<li>合并含有纯化八聚体的馏分，并使用 Vivaspin 离心过滤器浓缩至 ≤15 mg/ml。若保持稀释状态，八聚体可能解离为 H2A/H2B 二聚体和 H3/H4 四聚体。</li>
	<li>通过测定 280 nm 处的吸光度确定八聚体浓度，并根据 表 1 中的消光系数进行计算。</li>
	<li>组蛋白八聚体可在 4 °C 的复性缓冲液中短期保存。若需长期储存，八聚体在 -20 °C 并保存于 50% 甘油溶液中更为稳定。保存于甘油中的八聚体在进行吸光度测定及用于核小体阵列重建前，应透析至新鲜的复性缓冲液中。</li>
</ol>
3. 从DNA和纯化的八聚体重建核小体阵列
原理：重建核小体阵列需要将组蛋白八聚体与模板 DNA 以特定的摩尔比例混合。在 2 M NaCl 条件下，将 DNA 与组蛋白八聚体的混合物通过逐步透析的方式转移至离子强度逐渐降低的缓冲液中。逐渐降低盐浓度可确保核小体的正确形成。为了获得模板 DNA 上组蛋白八聚体饱和度符合预期的核小体阵列，需先进行小规模的预实验性重建，随后进行大规模制备性重建。小规模重建所确定的合适条件将用于指导后续的制备性重建过程。
<ol>
	<li>按照文献4,12所述方法纯化串联重复的核小体定位DNA。简言之，使用Qiagen GigaPrep试剂盒或类似产品分离质粒DNA。设置限制性内切酶消化反应，以释放模板DNA并将质粒DNA切割成较小片段（≤700 bp）。随后可通过尺寸排阻色谱法（SEC）将模板DNA与小片段质粒DNA残留物分离。使用高度约为115 cm、填充Sephacryl S-1000珠的重力柱，足以用于纯化601207bp × 12聚体DNA。</li>
</ol>
注意事项：为了降低成本但增加操作步骤，可通过碱裂解法结合苯酚/氯仿DNA纯化方法从E. coli23,24中分离质粒DNA。分离模板DNA与质粒DNA的策略可能因模板DNA大小的不同而有所变化。对于尺寸排阻层析（SEC），关键在于设计限制性内切酶消化方案，以最大程度地扩大模板DNA与质粒DNA之间的大小差异。
<ol start="2">
	<li>确定用于重组的摩尔比（r）。r 等于八聚体摩尔数与DNA重复单元摩尔数的比值。若目标是获得饱和的核小体阵列，则初始小规模试验中，采用 0.9、1 和 1.1 的 r 值是合适的。</li>
	<li>通过计算每种待测摩尔比下约 18 μg DNA 所需添加的八聚体量，制备小规模样品。混合 DNA 与组蛋白八聚体。样品中 NaCl 的终浓度应 ≥2 M，DNA 的终浓度约为 0.3 μg/μl。最终样品缓冲液条件还应包含 10 mM Tris（pH 7.8）和 1 mM EDTA。</li>
	<li>样品现已准备好进行透析。将样品加入 12k-14k MWCO 透析袋中。将透析袋置于 2 L 离子强度逐步降低的缓冲液中进行透析，步骤如下。</li>
</ol>
所有缓冲液中的组分：10 mM Tris（pH 7.8）、1 mM EDTA。缓冲液1（加入1 M NaCl、1 mM DTT）孵育5-6小时。缓冲液2（加入0.75 M NaCl、1 mM DTT）过夜孵育。缓冲液3（加入2.5 mM NaCl、1 mM DTT）孵育5-6小时。缓冲液4（加入2.5 mM NaCl、0.1 mM PMSF）过夜孵育。
<ol start="5">
	<li>从透析管中取出样品，并继续进行第4-6节操作。如果小规模样品获得理想结果，则在大规模样品上重复第3-6节的步骤。</li>
</ol>
注意：为了节约资源，小规模样品的体积应为满足后续筛选实验所需的最小体积。为了确保有足够的样品用于此处列出的沉降速度和原子力显微镜（AFM）实验，建议使用50 μl、浓度为0.3 mg/ml的DNA样品。大规模制备样品的体积取决于其预期用途。大规模样品应以与小规模样品相同的方式进行制备。
4. 重建核小体阵列的沉降速度分析
原理：在贝克曼Xl-A/I分析型超速离心机中进行的沉降速度实验可提供溶液中分子大小和形状的信息。在低盐条件下进行的沉降速度实验用于确定重建的阵列上核小体的饱和程度。
<ol>
	<li>使用 TEN 缓冲液（10 mM Tris pH 7.8，1 mM EDTA，2.5 mM NaCl）将样品稀释至 260 nm 处吸光度约为 0.5。取 400 μl 样品加入带有双通道中心部件的样品池中，一侧为样品，另一侧为参照液（TEN 缓冲液）25。保持参照液弯月面高于样品弯月面（即加入 420 μl 参照溶液）。</li>
	<li>将样品池装入转子中，并利用样品池底部与转子上的刻度线对齐样品池25。使用压缩空气轻轻清除样品池透镜上的灰尘。</li>
	<li>开启 XL-A/XL-I 离心机，插入转子，并按照说明书所述安装并固定光学系统。打开 Proteome Lab 软件，选择文件：新建。</li>
	<li>设置一次单次扫描运行，转速为 3,000 rpm，温度为 25 °C。在选项中选择“扫描结束后停止”，并运行径向校准（若当前转子是 AUC 中上次使用的转子，则无需进行径向校准）。</li>
	<li>对每个样品池，命名样品，选择波长（260 nm），选择吸光度模式，并在计算机上选择保存文件的位置。开始单次扫描运行。</li>
	<li>利用单次扫描确定合适的径向扫描长度（图 2A）。缩短待扫描的样品池区域可减少运行时间。但需确保包含样品弯月面，并将扫描终点设置得非常接近或到达样品池底部。</li>
</ol>
注意：单次扫描可通过在样品弯月面出现前开始测量，从而缩短测量区域（图2A）。在AUC运行过程中生成的大多数扫描图谱应包含越过弯月面的边界部分以及稳定的平台区（图2B）。AUC样品池的镜头若被污染，可能产生具有显著尖峰的扫描图谱，这些异常可能影响数据分析。UltraScan软件附带有一份手册，是分析分析型超速离心数据相关资讯的重要资源26。
<ol start="7">
	<li>使用 XL-A/XL-I 控制面板，输入转速为 0 并按下启动。这将使离心腔抽真空，并使腔内温度达到平衡。开始运行前需等待 1 小时，以确保温度充分平衡。</li>
	<li>使用软件设置所需转速和扫描次数。较高的转速可提高分辨率，但应在样品沉降到离心池底部之前至少采集 20 次扫描（建议更多）。为监测运行进程并检查潜在问题（如离心池泄漏），可方便地在选项菜单中叠加最后几次扫描图谱。应监测前几次扫描，以确保仪器正常运行。</li>
</ol>
5. 沉降速度数据的编辑与分析
原理：原始沉降速度数据应由能够提供经扩散校正的沉降系数分布的程序进行分析。该信息进而可指示重组样品中具有特定饱和度水平的组分所占的比例。 例如 如果使用12-mer DNA模板，则可以确定含有10、11和12个核小体/DNA的重组阵列所占的比例。
<ol>
	<li>使用 UltraScan 等 AUC 数据分析软件编辑数据26。必须对每个样品池的扫描数据进行编辑，以生成用于后续分析的数据集。正确编辑扫描数据包括定义样品弯月面、将数据缩减至感兴趣区域，以及定义基线和平台区（图 2）。在此阶段也可从数据集中删除不需要的扫描数据。但由于可在分析过程中去除不需要的扫描数据，因此建议在此阶段保留所有扫描数据。</li>
	<li>我们强烈推荐使用增强型 van Holde-Weischet 方法分析数据27。该分析方法可校正运行过程中扩散效应的影响，并得到沉降系数的积分分布。特别是，UltraScan 中实现的增强型 van Holde-Weischet 方法允许在分析中包含缺乏稳定平台区或含有未完全脱离弯月面的边界组分的扫描数据28。</li>
	<li>确定组装好的核小体阵列的沉降系数分布。图 3 展示了 601-12（207 bp，12 聚体）核小体阵列的代表性结果。</li>
	<li>如果某个小规模样品中含有具有理想沉降系数范围的阵列，则从第 3 节开始，以更大规模重复该过程。如果所有小规模样品均未获得合适的沉降系数分布，则从第 3 节开始，更换新的 r 范围后重复小规模测试。</li>
</ol>
6. 使用原子力显微镜（AFM）观察核小体阵列
原理：原子力显微镜（AFM）可用于观察核小体阵列的饱和程度。该技术可作为质量控制检测手段，与分析超速离心（AUC）沉降速度法和限制性内切酶消化法相互补充。
<ol>
	<li>采用上述方法，获得充分饱和的核小体阵列（图 5A）。</li>
	<li>通过将约 30 μl 商业化的 APTES（Sigma-Aldrich (3-Aminopropyl)triethoxysilane A3648-100ML）以 1:1,000 的比例稀释于 0.22 μm 滤过的超纯水中，处理云母片 30 分钟，制备 APTES 处理的云母载片。</li>
	<li>30 分钟后，用滤过的水冲洗掉 APTES，并在氮气气流下轻轻吹干。</li>
	<li>将适当稀释的核小体阵列样品（约 1.5 ng/μl）加到载片上，在室温下加盖孵育 15 分钟。</li>
	<li>用滤过的样品缓冲液冲洗样品，按前述方法干燥后，将载片置于原子力显微镜（AFM）载物台上（本实验使用 Asylum Research MFP-3D 原子力显微镜）。</li>
	<li>首先以 512 条扫描线获取 2 × 2 μm 的扫描图像，统计核小体数量以确定饱和程度（图 5B）。</li>
	<li>理想情况下，应选择载片上核小体阵列分布清晰分离的区域进行成像。</li>
	<li>为获得更高分辨率图像，可进行 500 × 500 nm 的扫描（图 5C）。</li>
	<li>图像可使用 Asylum 公司提供的 MFP-3D 软件进行平整化处理和分析。</li>
	<li>每幅图像可划分为四个象限，并进行数字放大以更清晰地观察分离良好的阵列；可在阵列上手动绘制多条直线，获取核小体的高度轮廓图（图 5C，右侧面板—高度轨迹图及 图 5D）。</li>
	<li>每种类型的阵列应分析多幅此类图像，涵盖数百个核小体。记录高度轮廓数据，分类后在 MS Excel 中进行绘图分析。</li>
</ol>

<ol><li>Luger, K., Mader, A., Richmond, R., Crystal Sargent, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 7, (1997).</li>
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</ol>

作者无利益冲突。

模型核小体阵列是一种非常有用的工具，用于 体外 染色质结构与功能的研究。例如，它们已被广泛用于研究染色质纤维在溶液中的凝聚机制 30-34，并使得获得四核小体的X射线结构成为可能 35近年来，它们已被证明在解析特定核心组蛋白变体、突变体及翻译后修饰的结构效应方面具有重要作用。14-16,36本文介绍了一种利用核小体定位DNA和重组核心组蛋白组装模式化核小体阵列的通用方法。
从纯化的八聚体和601序列重建核小体阵列207 x 12 DNA 的制备过程较为直接，包括若干透析步骤，逐步将 NaCl 浓度从 2 M 降至 2.5 mM。该方案中最困难的部分是选择合适的 r 值，以达到所需的模板饱和度。合适的 r 值首先通过小规模实验经验性确定，然后在更大规模上重复操作，以制备用于实验的核小体阵列。在本例中，我们试图获得 601207 x 12 DNA 模板，每条 DNA 上大多结合 12 个核小体。完全饱和的 601 的沉降系数207 含有1...

真核生物的基因组并非以裸露的DNA形式存在，而是通过结合蛋白质进行压缩和组织。这种DNA与蛋白质的复合物被称为染色质。染色质的基本重复单位是核小体。一个核小体由组蛋白八聚体以及缠绕在该八聚体上约1.6圈的146个碱基对的DNA组成1。组蛋白八聚体由两份核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4组成。沿DNA分子重复排列的核心组蛋白八聚体称为核小体阵列。核小体阵列的伸展结构被称为10 nm纤维或“串珠”结构，在低盐条件下体外存在2。10 nm纤维可通过阵列内压缩和/或阵列间寡聚化进一步凝聚成更高级的结构2。这些高级结构可在盐的存在下被诱导形成，也可通过染色质结构蛋白与核小体阵列的结合而受到影响3,4。染色质压缩程度与体内转录速率呈负相关5,6。近期研究强调了基因组结构组织在细胞分化、癌症发生等过程中的重要性7,8。利用核小体阵列研究染色质结构与功能的方法已得到广泛应用。本文描述了一种利用重组核心组蛋白和核小体定位DNA组装核小体阵列的方法。
使用含有核小体定位序列串联重复的重组DNA，可重建具有规则排列核小体的阵列。其中两种较为常用的定位序列是5S rRNA基因序列和“601”序列9,10。601序列来源于SELEX实验，其核小体定位能力比5S序列更强11。因此，601阵列的连接DNA长度更加均一。串联重复的核小体定位DNA可通过凝胶过滤获得4,12。重组组蛋白在变性条件下从E. coli中纯化得到13。使用重组组蛋白可精确控制核小体阵列中的组蛋白组成。例如，可将带有特定突变14或翻译后修饰15,16的组蛋白取代野生型核心组蛋白。
沉降速度实验通过在施加离心力的条件下监测大分子在溶液中的沉降速率，从而获得样品中大分子的大小和形状信息17。因此，沉降速度实验是研究染色质纤维结构在溶液状态下因染色质凝聚而发生改变的合适工具18。重要的是，首先应将沉降速度实验用作核小体阵列重建过程中的质量控制步骤。如果DNA与核小体未以适当的摩尔比结合，则阵列可能出现核心组蛋白不足或过饱和的情况。因此，通过沉降速度实验获得的信息可用于确认DNA是否被核小体充分饱和。尤其在使用先前未表征的DNA模板时，采用其他方法来估计DNA上核小体的饱和度非常重要。因此，我们还描述了一种利用原子力显微镜（AFM）分析核小体阵列的方法。AFM是一种强大的技术，能够直观显示多种参数的影响，例如饱和程度、组蛋白变体的存在效应或MgCl2的作用19,20。AFM还已被用于通过延时成像研究核小体动力学21。体外组装的12聚体核小体阵列特别适合AFM研究，因其尺寸处于AFM成像的理想范围之内22。在本研究中，我们使用核小体阵列的AFM成像作为质量控制手段，同时也用以验证分析型超速离心（AUC）的结果（“眼见为实”）。除了简单的可视化之外，AFM还可测量样品的高度轮廓，作为额外的定量指标。

<table><tbody><tr><td>(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648-100ML</td><td></td></tr><tr><td>6-8 kDa 截留分子量透析管</td><td>Fisher</td><td>21-152-5</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad Superdex 200 16/60 层析柱</td><td>GE</td><td>17-1069-01</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 50 kDa 截留分子量离心浓缩管</td><td>Sartorius</td><td>VS2031</td><td></td></tr><tr><td>12-14 kDa 截留分子量透析管</td><td>Fisher</td><td>08-667A</td><td></td></tr><tr><td>Illustra Sephacryl S-1000 Superfine</td><td>GE</td><td>17-0476-01</td><td></td></tr><tr><td>XL-A/I 分析型超速离心机</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用重组核心组蛋白和核小体定位dna组装核小体阵列

Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

沿DNA分子重复排列的核小体核心组蛋白八聚体称为核小体阵列。核小体阵列可通过两种方式获得：从体内来源纯化，或在体外由重组核心组蛋白和串联重复的核小体定位DNA重新构建。体外重建方法的优势在于能够组装出组成更均一、定位更精确的核小体阵列。分析型超速离心机中的沉降速度实验通过分析大分子在离心力作用下在溶液中迁移的速率，提供有关其大小和形状的信息。该技术结合原子力显微镜，可用于质量控制，确保重建后的大多数DNA模板均被核小体饱和。本文描述了重建毫克量级、长度和组成明确的核小体阵列所需的实验方案，适用于染色质结构与功能的生物化学和生物物理研究。

为了说明该实验方案，我们使用重组的Xenopus核心组蛋白和含有12个串联重复的207 bp 601定位序列（601207 × 12）的DNA重建了核小体阵列。我们首先将冻干的核心组蛋白组装成天然八聚体，然后使用S200柱通过FPLC纯化八聚体（图1A）。较大的复合物会更早从S200柱中洗脱出来。组蛋白通常按以下顺序洗脱：非特异性组蛋白聚集体、组蛋白八聚体、H3/H4四聚体以及H2A/H2B二聚体（图1A）。S200柱洗脱峰通过SDS-PAGE进行分析。纯化的八聚体组分的凝胶应显示四种组蛋白蛋白的等摩尔比例（图1B）。需要注意的是，Xenopus H2A和H2B的分子量仅相差约200 Da，因此在SDS凝胶上表现为单一蛋白条带。H3/H4四聚体和H2A/H2B二聚体会在组蛋白八聚体峰之后洗脱，但非常接近该峰。在选择保留的组分时，应谨慎丢弃色谱图中八聚体峰末尾部分的组分，因为这些组分可能含有较多非八聚体形式的组蛋白复合物。本实验中，收集并保存了第64至67号组分用于核小体阵列的重建...

本文介绍了一种利用重组核心组蛋白和串联重复的核小体定位DNA重建模型核小体阵列的方法。我们还描述了如何通过分析型超速离心机中的沉降速度实验以及原子力显微镜（AFM）来监测重建后核小体阵列的饱和程度。

利用重组核心组蛋白和核小体定位DNA组装核小体阵列

由沿DNA分子重复排列的组蛋白八聚体构成的结构称为核小体阵列。核小体阵列可通过两种方法之一获得：……

本实验旨在构建含有串联重复核小体定位DNA序列的核小体阵列，首先通过透析将核心组蛋白从变性缓冲液中复性，重新折叠成组蛋白复合物。随后，使用尺寸排阻柱分离组蛋白八聚体。接下来，将组蛋白八聚体与模板DNA以不同的摩尔比例混合，并通过从高盐到低盐的逐步透析，使组蛋白在DNA上组装成核小体。接下来，通过沉降速度分析样品，以确定达到所需饱和度的适当摩尔比。结果可根据核小体阵列在离心力作用下在溶液中的迁移情况，或基于原子力显微镜生成的图像来显示核小体阵列的饱和程度。相较于单核小体，核小体阵列的主要优势在于核小体之间由连接DNA相连，从而施加了额外的结构约束。尽管该方法可用于研究染色质结构，但它也可应用于其他系统，例如以染色质模板进行的体外转录研究。接下来，Ryan 和 Anna 将演示如何利用重组核心组蛋白在具有核小体定位能力的 DNA 上组装核小体阵列。首先取纯化后的冻干重组核心组蛋白 H2A、H2B、H3 和 H4，将每种蛋白约 5 毫克溶解于 3 毫升变性缓冲液中，室温下振荡孵育至少 1 小时。现在使用去折叠缓冲液作为空白对照，在 276 纳米处测定每种组蛋白溶液的吸光度。然后利用各自的消光系数计算每种组蛋白的摩尔浓度。将根据吸光度测定的组蛋白浓度与冻干粉的干重进行比较，评估大部分蛋白质是否已溶解。确定含有最少摩尔数的组蛋白样品，该样品的摩尔数将作为所有组蛋白的限制性摩尔数。然后以等摩尔量混合各组蛋白。用变性缓冲液稀释组蛋白混合物，使其最终浓度为每毫升一毫克。现在将样品转移至透析袋中。密封透析袋并放入两升冷复性缓冲液中。在4°C条件下搅拌透析18小时。确保透析袋能够自由且充分地旋转，以避免产生沉淀。每六小时更换一次透析缓冲液，即使出现沉淀也不要丢弃样品，部分八聚体可能仍可回收，尽管产率会有所降低。将S 200柱连接至FPLC系统时，确保无气泡进入系统。使用0.3毫升/分钟的流速和0.5兆帕的背压限制，用0.2微米滤过的水对S 200柱过夜清洗。随后用一升0.2微米滤过的复性缓冲液平衡系统约两小时。同时，用一毫升复性缓冲液平衡一个离心浓缩器。现在从透析袋中取出样品。将样品在 4 摄氏度下离心，以去除任何沉淀物。用移液器将样品上清液转移至浓缩管中。将样品浓缩至约 500 µL 的体积。将浓缩后的Optimus样品转移至新容器中。用1毫升复性缓冲液冲洗浓缩装置，将冲洗液浓缩至500微升，然后加入ER样品中。将样品在1.5毫升微量离心管中，于4°C、10,000 RPM条件下离心5分钟。将上清液转移至新的离心管中。随后将样品上样到S 200柱中。用400毫升新配制的复性缓冲液洗脱样品，并收集2毫升的组分。在洗脱过程中监测280纳米处的吸光度。His标签蛋白聚集体通常在约45毫升EMR、约65毫升和时间t处洗脱。大约 84 毫升。通过在 18% 至 20% SDS-PAGE 上电泳分析样品，对目标峰的洗脱组分进行分析。含有纯化emu的组分应包含等摩尔量的四种核心组蛋白蛋白。现在合并含有纯化OCR的组分，并使用离心过滤器进行浓缩，以确定最终的OCR浓度。在280 nm处测定吸光度，然后利用消光系数计算浓度。按照方案文本中的详细步骤，从 DNA 和纯化的 ERs 重建核小体阵列。然后将样品稀释至 260 纳米处的吸光度为 0.5。将 400 微升样品加入带有双通道中心部件的离心池中，样品置于一侧，另一侧为参考缓冲液 10。尽管两个区域中的液体液面应接近相同高度，但需保持参考液面高于样品液面。将细胞装入转子，并正确对齐细胞。根据转子上细胞底部的刻度标记，使用压缩空气轻轻清洁细胞透镜表面。开启 X-L-A-X-L-I 离心机。按照说明书中的描述，插入转子并安装固定光学部件。打开蛋白质组学实验室软件，选择“新建文件”。设置单次扫描运行，转速为3000 RPM，温度为25摄氏度。针对每个细胞，命名样品，选择波长，选择吸光度，并在计算机上选择保存文件的位置。在选项中选择停止。完成最后一次扫描并运行径向校准后，开始单次扫描运行。使用单次扫描来确定合适的径向扫描长度。使用 X-L-A-X-L-I 控制面板。输入速度为零，然后按星号键以平衡腔室。通过软件设置所需的速度和扫描次数。较高的离心速度可提高沉降系数的分辨率。然而，应在样品完全沉降到样品池底部之前至少采集20次扫描数据。监测前几次扫描结果，以确保仪器正常运行。叠加最近的多次扫描结果，以监测实验进程并检查可能存在的问题，例如细胞泄漏；沉降速度结果的分析，以及使用原子力显微镜可视化阵列的方案，均在本实验的方案文本中详细说明。将冻干的非洲爪蟾核心组蛋白在通过FPLC在S 200柱上纯化的八聚体（octr）中重新溶解。洗脱顺序依次为非特异性组蛋白聚集体，随后是组蛋白八聚体、H3、H4四聚体以及H2A-H2B二聚体。对纯化的八聚体组分进行SDS-PAGE分析，结果显示四种组蛋白蛋白的摩尔量相等。需要注意的是，Xip H2A和H2B的分子量仅相差约200道尔顿，因此在SDS凝胶上通常表现为单一蛋白条带。将第64至67组分合并并保存，用于核小体阵列的重建。使用在3000 RPM条件下采集的一次扫描的Proteome Lab软件截图，确定超速离心细胞扫描的测量范围。随后编辑一系列沉降速度扫描数据，生成数据集，其中红线和绿线为观察沉降系数分布的两种不同方法。在UltraScan中，红线表示沉降系数的积分分布，而绿线表示染色质结构研究中的微分分布。体外原子力显微镜可补充分析型超速离心，以确定重建后模板饱和程度。此处用于成像的27个SRA中，大多数含有10到11个核小体。该500 × 500纳米的扫描图像清晰显示了带有连接DNA的核小体阵列。图中还展示了振幅轨迹、相位轨迹，以及同一高度轨迹，其中通过手绘线穿过核小体以确定核小体的高度轮廓。一旦掌握，若操作得当，该技术可在三至四天内完成。在进行该实验操作时，必须严格注意试剂浓度的精确测量。完成该步骤后，还可通过原子力显微镜等技术检测核小体阵列的饱和程度。该技术的建立为染色质领域的研究人员探索染色质结构与染色质压缩奠定了基础。

assembly-nucleosomal-arrays-from-recombinant-core-histones-nucleosome

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核小体阵列从重组核心组蛋白和核小体定位的DNA组装

在本视频中，我们展示了高速时间序列原子力显微镜（AFM）成像技术，用于研究核小体复合物的动态过程。当AFM探针扫描核小体表面时，可检测核小体高度的变化，并记录DNA随时间解缠绕的过程。...

高速时间序列原子力显微镜捕捉核小体动态

本方案描述了含有不同同位素标记的姐妹组蛋白的核小体的重建方法。同时，在使用预先修饰的组蛋白拷贝后，可生成不对称翻译后修饰的核小体。这些样品可直接用于高分辨率核磁共振（NMR）波谱技术，同时研究姐妹组蛋白上的修饰串扰机制。...

用同位素标记不同的姐妹组蛋白重建核小体

本文介绍了一种利用静态和时间序列原子力显微镜（AFM）成像技术在单分子水平上表征核小体颗粒的实验方案。所述的表面功能化方法可实现对核小体结构及其动态行为在纳米尺度下的高分辨率捕捉。...

利用原子力显微镜成像研究核小体的结构与动力学

本文介绍了一种利用遗传密码子扩展技术表达乙酰化组蛋白蛋白，并在体外组装重建核小体的方法。...

利用遗传密码子扩展技术在组蛋白中进行位点特异性的赖氨酸乙酰化以用于核小体重建 大肠杆菌

本方案详细阐述了使用两种样品制备方法制备用于冷冻电镜载网的核小体复合物的步骤。...

用于冷冻电镜结构解析的与DNA修复因子复合的核小体核心颗粒的制备

本文介绍了一种用于重建含核小体的DNA系链以进行单分子相关力与荧光显微镜检测的详细实验流程。此外，还描述了若干后续实验，可用于观察染色质相互作用蛋白的结合行为，并分析核小体物理性质的变化。...

原位核小体组装用于单分子关联力与荧光显微镜技术

本视频演示了从非洲爪蟾（Xenopus...

非洲爪蟾胚胎的组织者与动物极外植体解剖及细胞黏附实验的构建

从小鼠尾部提取基因组DNA

我们提出了一种纳米光子学（量子点-荧光共振能量转移，QD-FRET）与微流控技术相结合的创新且强大的方法，用于研究聚电解质聚集体（polyplexes）的形成过程，该方法有望为未来基于核酸的治疗药物提供对聚集体更精确的控制，并实现均匀、可定制聚集体的合成。...

结合量子点-荧光共振能量转移与微流控技术实时监测DNA纳米复合物的自组装过程

分析型超速离心机（AUC）样品池用于盛装样品和参考缓冲液，在实验过程中暴露于高真空环境，并以高达 60,000 rpm 的转子速度运行。本视频将演示组装、加样和校准这一 AUC...

分析型超速离心机样品池的组装、装载与校准

学习利用重组核心组蛋白和核小体定位DNA组装核小体阵列的方法，通过沉降速度实验和原子力显微镜监测组装效果。该技术有助于深入理解染色质结构与基因调控机制。

利用重组核心组蛋白和核小体定位DNA组装核小体阵列

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