高通量、自动化从临床样本中提取 DNA 和 RNA 的方法——基于通用液体处理机器人上的 TruTip 技术 关键词：DNA 提取，RNA 提取，临床样本，高通量，自动化，TruTip 技术，液体处理机器人

以下实验的总体目标是利用Hamilton Star液体处理工作站和True Tip提取技术，从全血中分离人类基因组DNA。为实现这一目标，将含有血液样本、裂解缓冲液、蛋白酶K和乙醇的溶液反复吸入和 dispense 通过True Tip多次，从而使DNA结合到True Tip基质上。接下来，两种不同的洗涤缓冲液依次流经True Tip，以去除结合的核酸上残留的蛋白质、裂解缓冲液及其他污染物。

第三步中，通过多次抽吸和 dispensing 空气使 true tip 的结合基质干燥，以蒸发残留的洗涤缓冲液；最后一步中，将 illusion 缓冲液反复流过结合基质，使 DNA 从基质上释放。利用 true tip 技术可获得无污染的高分子量基因组 DNA，其纯度和浓度可通过紫外-可见光吸收、凝胶电泳、定量 PCR 或测序进行验证。与基于离心柱或磁性颗粒的其他样本制备方法相比，true tip 的优势在于易于自动化操作。

它不需要配备离心机和磁棒的昂贵系统，简单的操作流程节省了宝贵的仪器平台空间。尽管今天我们主要关注全血样本，Tru Tip 还可应用于其他基因组 DNA 样本，以及临床拭子样本中的病毒 RNA 提取，或血浆中游离 DNA 的分离等。本次实验操作将由我们实验室的自动化工程师 Dane Brady 演示，他在 Hamilton 液体处理工作站上开发 Tru Tip 提取流程的过程中发挥了关键作用。

在此方案中，Hamilton Star液体处理机器人可同时从96孔全血样本中提取DNA。Hamilton Star的平台配备可选的加热振荡模块，这对于全血等特定临床基质的酶消化步骤至关重要。由于该系统可装配96通道移液头，因此每个实际的移液步骤和试剂均使用专用的96孔板。

首先打开 Hamilton Star 机器人相关设备以及计算机。启动计算机上的 Hamilton Run Control 软件，打开 ACON 提供的用于 96 个样本的运行文件。

现在根据示意图设置星形甲板布局。在标注为“1”的位置放置1 mL滤芯吸头，在位置2放置未滤芯的1 mL吸头，在位置3放置Conni Hamilton 1 mL LPT 2毫米真吸头。继续参考图表，用所需的LabWare将位置5至12依次填满，但暂不加载样品。

现在加入75毫升裂解与结合缓冲液。F应加载至槽位5。或者，也可使用预先装有缓冲液的板，以简化设置并优化工作台布局。

继续相应地加载机器人。最后，取下血样管的管帽，并将其放入样本载体架或平台位置四。将样本一放置在最左侧载体的后方，随后依次将样本向下放置，样本96最终位于右前方位置。

所有样品上样后，使其平衡至室温。由于该方案完全自动化，因此操作者出错的可能性极小。样品需按正确顺序放入样品架中，但可通过实施条形码技术以确保样品追踪的准确性。

要启动自动化程序，请在运行文件窗口的左上角选择播放按钮，并输入正在处理的样本数量。程序执行的第一步是将 80 µL 蛋白酶 K 转移至加热振荡模块位置 14 的孵育板中。接下来，程序将使用八通道移液臂将 200 µL 样本分别加入孵育板的每个样本孔中。

接着使用96通道机械臂将600 µL裂解缓冲液F加入孵育板的每个孔中。程序随后对溶液进行10个循环的混匀，并在深孔板中于70°C、500 RPM条件下孵育20分钟，实际温度为60°C，处于蛋白酶K活性范围内。在样品孵育的同时，液体处理系统继续运行，将提取和洗脱试剂从试剂槽批量加入相应的96孔板中，向深孔板的每个孔中加入100 µL Elucian缓冲液A。

在第13位，向深孔板的每个孔中加入800微升乙醇。在第10位，向第12位深孔板的每个孔中加入1.6毫升洗涤缓冲液K，并向第11位深孔板的每个孔中加入1.6毫升洗涤缓冲液J。经过20分钟孵育后，将样品混合物从孵育板转移至第10位含有乙醇的深孔板中，并通过12次移液循环进行混匀。

在整个过程中，根据需要将使用过的试剂吸头弃置于废液桶中。程序从裂解步骤继续进行至DNA提取，首先从甲板位置三加载96个True Tip。下一步是在位置10进行样品的吸取与 dispense，共循环10次，从而使核酸结合到True Tip整体柱上。

接着，移液尖端移至第11位，将洗涤缓冲液J循环通过整体柱五次，以去除残留的裂解液、缓冲液和样品基质。然后，移液尖端移至第12位，洗涤缓冲液K循环通过其中五次，以去除结合的核酸上的蛋白质及其他污染物。随后，移液尖端在洗涤板上方高速循环80次，进行空气干燥。

此时，True Tips 移动至第13位，通过洗脱缓冲液 A 进行两个循环，重复五次，将 DNA 释放至深孔板中。随后，True Tips 被弹出至废弃容器中。程序至此结束。

从仪器中取出洗脱板，并将提取的样本转移至适当的管中用于储存或下游应用。该程序还可自定义设置，以在仅一小时内自动将最终样本转移至用户选择的指定管或板中。自动化系统利用机器人从96个血液样本中提取了基因组DNA。

同时处理了45份阳性血液样本和45份试剂空白样本的吸光度谱。260 nm与280 nm吸光度比值的平均值为1.96，260 nm与230 nm比值的平均值为1.93，表明在1%琼脂糖凝胶上样本纯度较高。随机样本显示分子量较高，剪切程度极低。

每200微升全血的平均得率约为五微克DNA。在优化全自动True Tip方案时，需特别注意确保各孔之间无交叉污染。实时PCR结果显示阳性和阴性样本之间具有清晰的分离，如此处所示。

对于RNA提取，96个样本的完整提取过程可在一小时内完成，且所需人工操作时间极少。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在Hamilton Star液体处理工作站上利用TRU Technology自动化系统从全血中分离人基因组DNA。