C.在体内神经元钙成像技术线虫
April 10th, 2013
它的小的透明体，证据充分的解剖学和主机适合遗传技术和试剂， C.线虫神经成像使用相对简单的，低成本的技术。在这里，我们描述了单个神经元内保存完好的成年动物的基因编码的荧光钙指标的成像。
以下实验的总体目标是采用基因编码的荧光四分体来测量线虫内单个神经元的钙动力学。参见优雅，这是通过首先安装和拆除完整的 C 优雅来实现的，这些 C 优雅在标准显微镜载玻片上的目标神经元中表达钙敏感荧光团。接下来，使用视频显微镜和标准 epi 荧光成像技术在体内对单个神经元进行成像。
然后分析视频以测量两个常用的 Fluor fours G camp 神经元中特定位置的荧光强度，它提供强大的大振幅单通道信号和基于 Fray 的变色龙，它产生双通道比率。度量测量结果是响应特定感觉刺激的神经元活动，以及响应细胞损伤的细胞钙生理学，这两者都基于成像神经元内相对钙水平的光学测量。与脊椎动物系统或传统电生理学中的类似方法相比，该技术的主要优点是 CL elgan 代表了一种用于体内神经元成像的稳健、灵活且遗传易处理的系统，该系统在技术上简单且具有成本效益。
这种方法可以帮助回答广泛的基于场的神经元生物学中的关键问题，允许在体内测量单个神经元的活性和正弦。从具有落射荧光成像功能的标准复合显微镜开始，以实现最佳图像和信号质量。使用高放大倍率、高数值孔径物镜和高灵敏度制冷型 CCD 相机，以最大限度地提高图像分辨率和灵敏度，同时最大限度地减少单色植物群的背景噪声。
使用专为 G 阵营的 Fluor four 特定波长设计的标准显微镜荧光滤光片组。使用针对 488 纳米激发和 525 纳米发射的标准 GFP 滤光片组，四比公制植物群（如变色龙）使用双成像系统，因此可以在两个不同的波长同时捕获相同的图像。这可以使用市售或自制系统来实现，该系统通过以下方式将双图像并排投影到相机上。
带有 440 加或负 20 纳米激发滤光片和 455 纳米长通 iic 的显微镜滤光片组镜像放置在显微镜成像端口外初始图像平面上的图像掩模，相机 CCD 传感器通常位于第一个中继镜头组，距离初始图像平面一个焦距，以便整理光线， 一种二向色镜，将光分成两个独立的成像波长或通道，反射一种颜色，同时透射其他发射滤光片。进一步将透射光限制在特定的成像波长。第二个中继镜头，每个镜头对应放置在光束路径中的每个通道，以便将光线重新聚焦到 CCD 相机的第二个图像平面。
一对镜子和第二个二向色镜引导光束路径，使两个图像重新组合并并排投影到相机上。CCD 传感器。下面是结果图像的示例。
设置完成后，可以通过以下方式调整和微调图像，移动相机位置，使传输的图像覆盖相机视野的一半。通过调整其光束路径中的最后两个镜子来移动反射图像以覆盖另一半视野，并通过沿光束路径来回移动每个通道的第二个中继镜头来优化焦点。从 Citis 遗传中心或其他来源获取在感兴趣的神经元中表达钙敏感荧光团的动物。
或者，使用标准海豹 elgan 技术构建转基因动物。然后使用以下技术之一在 0.05%leal 至 2%aros 处固定用于药理学麻痹的密封优雅，并通过在两个载玻片之间压一滴熔融的 aros 来制作用于成像的 aros 垫，载玻片有两块实验室胶带作为垫片。取下顶部载玻片后，挑选 5 到 10 只动物并将它们转移到垫子上。
用盖玻片盖住垫子，并在角落涂抹少量石蜡和凡士林的热一对一混合物以将其固定到位。等待 5 到 10 分钟，让 lemisol 生效，让动物完全静止。要使用 stiff aros 方法固定动物，请制作 10%aros 垫。
在垫子表面加入约 3 微升 1 至 10 的聚苯乙烯微球溶液，然后迅速挑选 5 至 10 盎司的 clean sea elegance 加入甜菜溶液池中。轻轻盖上盖玻片，并将熔融的蜡涂抹在角落上。典型的实验需要对动物施加特定的刺激或条件，同时对单个神经元的反应进行视频记录。
用于视频采集。我们经常以每秒约 1 帧的速度成像，曝光时间约为 300 毫秒。必须分析视频以测量成像神经元相对于附近背景区域的感兴趣区域或 ROI 内每帧的荧光强度。
我们的分析程序显示电影中所有图像的压缩图像，从中手动选择包含所有帧中感兴趣对象的粗略边界，并选择独立的背景区域。对于第一个 ROI，是从边界区域内手动选择的。对于每个后续帧，程序从边界区域内选择最亮的像素，为使用 chameleon 生成的比率度量图像生成正确大小的 ROI，为每个双图像或通道选择类似的粗略 ROI 和背景区域，然后从第一帧上的一个图像中选择 ROI， 每帧的荧光信号 F 的计算方法是 ROI 中的平均像素强度减去背景区域中的平均强度。
每帧的相对钙水平计算为强度的百分比变化，该百分比变化标准化为从第一帧或一系列帧测量的初始基线值。比率度量值计算为两个通道的比率。在细胞体内选择的 ROI 会产生最强、最稳健的信号，但也可以沿着神经突选择和测量来自 ROI 的信号。
暴露在激发光下会导致 Flora 4 白化，其特点是信号稳定下降，如果发生白化，这取决于暴露水平。使用中性密度滤波器减少曝光时间和/或激发强度，以最大限度地减少录制过程中 Sea Elegance 运动产生的噪声。为了响应光照和实验刺激，使用干净的制剂小心执行固定程序。
为了成功进行图像分析，请选择比图像到神经元更暗且足够远以避免散射光的背景区域。这里显示的是一个 C 优雅的 SJ 神经元，表达 G 阵营，响应每厘米 3 伏特的外部电场，进行三次单独的试验，每次持续 10 秒。这只动物使用 lemisol 固定，但视频显示运动和聚焦都有轻微的缺陷。
在细胞体处测量漂移荧光强度。尽管视频错误显示响应第一和第三刺激的荧光大幅增加约 250%，但信号是稳健的。第二次刺激的结果大大降低。
证明神经元反应漂白的可变性是最小的，这从恢复到一致的基线水平可以明显看出。创伤性细胞损伤会触发神经元内大量的钙瞬变，这在细胞的生理反应中起着至关重要的作用。该视频显示了单个神经元对激光鸡奸的损伤诱导反应。
采用双成像光学元件记录来自变色龙报告基因的 CFP 和 YFP 荧光通道的信号。该图显示了在激光手术实验过程中在细胞体处测量的结果 FRET 信号。响应激光损伤和 T 时细胞质钙的增加等于零秒。
CFP 迅速降低，YFP 增加，导致比率度量信号立即增加约 200%，持续约 90 秒，然后回落到接近基线水平。从一致的基线可以明显看出，漂白是最小的。该图显示了在靠近切割点的轴突段中测量的结果 fret 信号。
氟 4 的局部量在实验过程中会发生变化。使信号激光手术复杂化，切断轴突并短暂破裂膜，使菌群 4 逸出并暂时降低其局部细胞质浓度。这从以后时间点 YFP 追踪的初始减少中可以明显看出。
作为其持续恢复的一部分，切断的末端会肿胀，导致更多的局部荧光 4 和强度增加。这在缓慢增加的 CFP 迹线中最为明显，但是，这些变化对两个通道的影响相同，并且品格比有效地补偿了提供稳健信号。结果测量显示与细胞体相似的反应，信号立即增加约 150%，在大约 90 秒时急剧恢复到接近基线，然后在大约 150 秒时又出现另一个较小的次要反应。
市面上有用于比率测量的商用显微镜附件，以及生成逐像素比率测量的更复杂的图像分析软件。掌握后，这些技术可以相对容易地完成，而无需其他模型系统或方法所需的复杂样品制备、组织解剖或成像技术。如果执行得当，整个实验可以在一两个小时内运行。看完这个视频后，你应该对如何固定成像的优雅有一个很好的了解，在体内对单个神经元执行视频最大复制，并分析得到的视频以测量基于神经元的相对钙水平。
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概述
本文讨论了使用基因编码的荧光钙指示剂来测量线虫 C. elegans 单个神经元中的钙动力学。该技术允许对神经元活动和细胞钙生理学的in vivo 成像，以响应感官刺激和细胞损伤。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 成像技术
背景
- C. elegans 是神经元研究的一种成熟模型生物。
- 它具有透明的身体和详细记录的神经解剖学。
- 基因技术允许钙指示剂的靶向表达。
- In vivo 成像提供了神经元功能和健康的洞察。
研究目的
- 测量单个神经元中的钙动力学。
- 分析神经元对感官刺激的反应。
- 研究细胞对损伤的反应。
使用的方法
- 安装和固定表达钙敏感荧光团的 C. elegans 。
- 使用视频显微镜和表荧光技术进行in vivo 成像。
- 分析特定神经元位置的荧光强度。
- 比较两种荧光团：GCaMP 和 FRET 基于的 Chameleon。
主要结果
- 对刺激的神经元活动的稳健测量。
- 细胞损伤期间钙生理学的洞察。
- 使用 C. elegans 进行成像的优势演示。
- 该方法的技术简单性和成本效益。
结论
- C. elegans 是in vivo 神经元成像的强大模型。
- 该技术是灵活且基因可操作的。
- 它提供了有关神经元功能和健康的宝贵数据。
常见问题
Executive Industry Relevance
In vivo neuronal calcium imaging in C. elegans provides a cost-effective, genetically tractable system for early-stage target validation and mechanistic de-risking in neuroscience drug discovery. The transparent organism enables direct observation of neuronal activity and calcium physiology in response to stimuli, supporting predictive confidence in target engagement and pathway modulation. This approach reduces biological ambiguity in preclinical screening by linking molecular interventions to functional neuronal outputs in a whole-animal context.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring neuronal calcium dynamics as a functional readout of target modulation in intact neural circuits.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization of target engagement effects on neuronal physiology without invasive electrophysiology.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing quantitative, activity-based data on compound effects in a genetically defined neuronal system.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible fluorescence intensity and ratio metric outputs suitable for high-content screening of neuroactive compounds.
- Scalability: Immobilization and imaging protocols allow extended time-lapse acquisition, enabling dose-response and kinetic analysis in multi-well formats.
- Platform Reuse: Compatible with multiple genetically encoded indicators (GCaMP, cameleon) and stimuli paradigms, supporting assay adaptation across target classes.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models conserved neuronal injury and stress responses, enabling preclinical evaluation of neuroprotective or neuromodulatory agents.
- Translational Continuity: Calcium dynamics serve as a biomarker-aligned readout bridging discovery phenotypes to mechanistic pathways relevant to human neurodegeneration or hyperexcitability disorders.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables early detection of off-target neuronal effects or lack of pathway modulation, reducing late-stage attrition due to mechanistic failure.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows as a functional screening tool following target identification and preceding lead optimization, providing mechanistic insight before significant investment in medicinal chemistry.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking genetic or pharmacological perturbations to real-time neuronal activity changes in vivo.
- Screening: Delivers quantitative, normalized fluorescence readouts (ΔF/F or ratio metric) that enable comparison across conditions and compounds in a standardized format.
- Analytics: Provides ratiometric and single-channel intensity measurements that correct for expression variability and motion artifacts, enhancing data reliability for cross-functional interpretation.
- Translational Research: Connects to preclinical work through conserved calcium signaling pathways implicated in axonal injury, excitotoxicity, and sensory processing disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for iterative target validation across neuroscience indications, leveraging standardized worm strains and immobilization techniques.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through direct, whole-animal observation of neuronal calcium flux as a proximal biomarker of target engagement.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via standardized immobilization (e.g., levamisole or agarose pads) and ratiometric imaging that minimizes artifacts from movement or expression drift.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by delivering early functional data on neuronal phenotype modulation, decreasing reliance on surrogate assays with low translational fidelity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by identifying compounds that fail to modulate neuronal calcium dynamics despite target binding, redirecting resources to mechanistically validated candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling, transgenic strain maintenance, and fluorescence microscopy for ratiometric or single-channel imaging.
- Dependent on access to fluorescence filter sets, dual-image optics for cameleon, and sensitivity-optimized cameras (e.g., cooled CCD) for low-light neuronal detection.
- Necessitates standardization of immobilization methods and ROI selection protocols across teams to ensure inter-lab comparability of calcium transient metrics.
- Adaptation considerations include promoter-driven expression specificity, indicator kinetics (e.g., GCaMP6f vs. GCaMP7), and stimulus delivery precision for reproducible neuronal activation.
- Practical limitations include potential photobleaching during prolonged acquisition and signal variability in neurites versus soma, which require background subtraction and ratiometric correction for accurate interpretation.
