Name: C.在体内神经元钙成像技术线虫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 学习利用基因编码荧光钙指示剂在秀丽隐杆线虫神经元中进行钙成像的技术。该方法可测量单神经元钙动态，分析感觉刺激与细胞损伤响应，为神经功能研究提供简便且经济的活体成像方案。

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本文所述工作由多人共同完成。CVG 搭建了实验装置，LS、SHC 和 CVG 共同完成了实验。CVG 和 SHC 撰写了手稿。所有作者随后参与了修改过程，并批准了手稿的最终版本。我们感谢 Paul Sternberg 提供 GCaMP 菌株。本研究中使用的一些线虫菌株由美国国立卫生研究院（NIH）研究资源中心（NCRR）资助的秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）提供。MATLAB 图像分析程序改编自文献18中使用的方法。作者的研究得到了波士顿大学和马萨诸塞州生命科学中心的支持。

1. 光学装置
 <ol>
 <li>使用具有落射荧光成像功能的标准复式显微镜。我们采用尼康Eclipse Ti-U倒置显微镜，配备Intensilight HG照明器。</li>
 <li>为获得最佳的图像和信号质量，应使用高放大倍数、高数值孔径的物镜。我们通常使用尼康X60 1.4 N.A.油浸物镜。在某些情况下，可根据荧光探针的表达水平和信号强度，使用较低放大倍数（X40、X20）的物镜。</li>
 <li>使用高灵敏度冷却CCD相机（如Andor Clara相机）以最大程度提高图像灵敏度并降低背景噪声。</li>
 <li>对于单色荧光染料，使用专为该荧光染料特定波长设计的标准显微镜荧光滤光片组。对于GCaMP，使用标准的GFP滤光片组，其激发波长优化为488 nm，发射波长优化为525 nm。无需进一步的光学改装。</li>
 <li>对于比例荧光探针（如cameleon），应使用双通道成像系统，以便在两个不同波长下同时获取相同图像。该目标可通过将双图像并排投射到相机上实现。图中展示了一种利用光学级面包板上的基本光学元件构建此系统的简易装置。 图1包括： 
 <ol class="ualpha">
 <li>配备440 ±20 nm激发滤光片和455 nm长通二向色镜的显微镜滤光片组 </li>
 <li>在显微镜成像端口外侧的初始像平面位置（通常为相机CCD传感器所在位置）放置一个图像掩模，该掩模可限制视场范围，使其仅占据相机传感器的一半区域。将此掩模置于第一像平面时，可使两个并排投射的图像具有清晰的边界且无重叠。</li>
 <li>第一块中继透镜组放置在距初始像平面一个焦距的位置，以使光线准直。</li>
 <li>一种二向色镜，可将光线分离为两个独立的成像波长或通道，反射其中一种颜色（&gt;515 nm，黄色），同时透射另一部分（&lt;515 nm，青色。</li>
 <li>发射滤光片（带通滤光片）进一步将透射光限制在特定的成像波长范围内（青色为485 ± 40 nm，黄色为535 ± 30 nm），</li>
 <li>第二组中继透镜（每个通道各一个）放置在光路中，用于将光线重新聚焦至CCD相机处的第二个像平面。</li>
 <li>一对反射镜和第二块二向色镜引导光路，使两个图像重新合并并并排投射到相机的CCD传感器上。 图 4A 显示了所得图像的一个示例。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>初始光学对准：使用低倍物镜和透射式宽场照明进行光学系统的初始安装与对准，以获得高对比度图像（在显微镜载玻片上用黑色记号笔绘制标记可取得良好效果）。首先通过显微镜目镜将图像调至清晰，然后切换至待使用的显微镜端口。在初始焦平面（位于显微镜端口外几厘米处）用一张索引卡观察图像，并保持高亮度照明。将第一个中继透镜（C）置于光路中，使其距离初始焦平面恰好为一个焦距，从而准直光线，同时不偏转光路方向。即 使光束路径居中。将掩膜置于第一焦平面，调整至限制一半视野，并在图像中形成清晰的边界。调整反射镜和滤光片（D、E、G）的位置，使光束路径保持与桌面平行，并如图所示并排形成两条平行光路。 图1B将第二个中继透镜（F）置于各自光路中心，并沿光路前后移动，使成像聚焦于放置在相机CCD传感器位置处的标定卡片上。若操作正确，两个图像应与显微镜目镜及其他相机接口实现齐焦。最后安装相机并微调对准。</li>
 <li>精细调节光学对准：利用CCD相机观察到的双图像进行光学对准的精细调节。选择高对比度图像，先使用较低倍率进行初步调节，再切换至较高倍率完成最终对准。将透射图像（青色通道中的图像）定位在 图1B）以覆盖相机视场的一半，通过在 X 和 Y 方向上移动相机。将反射图像（黄色通道 图1B通过调节其光路中的最后两个反射镜（G），使另一束光覆盖视场的另一半区域。通过沿光路前后移动每个通道的第二个中继透镜来优化焦距。若不进行改动，光学装置应保持稳定，仅需极少的微调。</li>
 </ol>
 2. 样品制备与数据采集。
 <ol>
 <li>从秀丽隐杆线虫遗传学中心（C.G.C.）或其他来源获取在目标神经元中表达钙敏感荧光蛋白的动物。或者，可采用标准方法构建转基因动物 秀丽隐杆线虫 技术。单细胞表达并非必需（如果需要研究多个神经元，则有时并不理想，参见 12只要能够轻松分离多个细胞的图像和测量数据即可。如果荧光蛋白转基因未整合到基因组中，则不同个体之间的表达水平可能会存在显著差异。在此情况下，使用荧光体视显微镜预先筛选表达水平较高的个体，可提高信噪比并改善测量结果。荧光蛋白的表达水平必须足够高，以便在实验所需的成像采集参数下能被相机清晰捕获。</li>
 <li>按照所需的固定技术制备琼脂糖垫（见下文 2.3），方法是将一小滴熔化的琼脂糖压在两片载玻片之间，载玻片之间用两条实验室胶带隔开。如有需要，可在放置样品前将琼脂糖垫转移至盖玻片上。参见 图 2.</li>
 <li>固定 秀丽隐杆线虫 用于成像，可采用以下技术之一：
 <ol class="ualpha">
 <li>药理学麻痹：将0.05%左旋咪唑加入2%琼脂糖载片中（在2.2步骤制备载片前混入熔化的琼脂糖中）。挑选5–10只动物置于载片上，加盖盖玻片。取少量热石蜡混合物（50%石蜡和50%凡士林）涂抹于盖玻片四角，以固定其位置。静置5–10分钟，使左旋咪唑发挥作用，动物完全静止。</li>
 <li>硬质琼脂糖固定化： 秀丽隐杆线虫 可使用刚性10%琼脂糖垫和直径为0.05 μm的聚苯乙烯纳米颗粒进行物理固定。按2.2步骤制备10%琼脂糖垫（按重量计，10%琼脂糖溶于NGM缓冲液中）。取约3 μl珠子溶液（按体积比，1:10的聚苯乙烯微球加入NGM中），滴加至琼脂糖垫表面。迅速挑选5–10条 秀丽隐杆线虫 将珠液滴加到垫片上的珠液池中，轻轻盖上盖玻片。用熔化的石蜡涂抹在盖玻片的四个角，以固定其位置。（有关该技术的更多细节，请参见 7 以及之前发表在 JoVE 的一篇文章 8)</li>
 <li>粘接： 秀丽隐杆线虫 可使用少量兽医级粘合剂涂抹于动物的一侧，将其粘合固定。</li>
 <li>微流控设备：已设计出多种微流控设备用于物理固定 秀丽隐杆线虫 用于成像。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>将制备好的载玻片置于显微镜下，聚焦至目标神经元。通常最容易找到 秀丽隐杆线虫 使用明场照明和低倍镜观察，然后切换至高倍镜并进行荧光成像，以定位并聚焦特定神经元。 </li>
 <li>刺激：如果需要观察神经元对特定刺激（如光、电场、味觉和嗅觉信号、温度等）的反应，则必须将刺激装置整合到显微镜系统中，以便在成像过程中向样本中的动物施加该刺激。 </li>
 <li>使用显微镜CCD相机采集图像。曝光时间与激发光强度取决于荧光基团的本底信号及表达水平，信号较弱时需延长曝光时间，但会相应降低时间分辨率。我们通常采用约300毫秒的曝光时间。</li>
 <li>单独或以延时摄影的方式采集图像。由于 秀丽隐杆线虫 神经元通常表现出较慢的激活动力学（即 它们缺乏基于钠离子的动作电位），因此通常以约1秒的帧率进行测量即可充分捕捉神经元动态。尽管已有研究采用高达每秒约90帧的采集速率，但该速率可能受限于弱荧光信号所需的积分时间。若固定条件稳定且帧率相对较慢，单个神经元的连续成像视频可轻松持续数分钟（约5–10分钟）甚至更长时间。</li>
 </ol>
 3. 数据分析
 <ol>
 <li>有多种可用于动态和比率分析的荧光成像软件包，包括 ImageJ 和 NIS-Elements。我们使用一个简单的自定义 MATLAB 程序，用于测量选定感兴趣区域内的平均荧光信号。</li>
 <li>对于单张图像（或完全静止的时间序列图像），在成像的神经元内选择一个感兴趣区域（ROI），并选择邻近的另一区域用于背景测量。对于比率成像图像，需在两组双通道图像中分别选择相似的感兴趣区域和背景区域。 </li>
 <li>延时成像视频中，目标神经元的轻微移动需要额外的分析，以在每一帧中自动选择感兴趣区域（ROI），这可通过多种目标追踪算法实现。本程序会显示视频中所有图像的压缩合成图，用户可手动选取一个粗略边界（涵盖所有帧中目标对象的范围），并同时选定一个独立的背景区域。对于第一帧，用户需在边界区域内手动选取ROI；对于后续每一帧，程序将从边界区域内选取最亮的像素，以生成指定大小的ROI即 与手动选择的第一帧ROI具有相同数量的像素）。对于目标对象在边界区域内明显亮于周围背景的图像，本方案可为每一帧选择一个合理的ROI。</li>
 <li>每帧的荧光信号 F 计算为 ROI 内的平均像素强度减去背景区域的平均强度。比值信号计算为两个信号的比值（YFP-YFP背景)/(CFP-CFP背景)-0.65。系数0.65用于校正CFP通道对YFP通道的串色，该值取决于所使用的荧光团以及特定的滤光片组（对于cameleon实验体系，该值通常约为0.6）。</li>
 <li>每帧的相对钙离子水平计算为荧光强度相对于第一帧（或前若干帧）测得的初始基线值的归一化百分比变化：ΔF/F = (F(t) - F₀) / F₀o)/ Fo，其中 F(t) 表示时间为 t 时的荧光强度，Fo 是初始基线值。</li>
 <li>选择细胞体作为感兴趣区域（ROI）可获得最强且最稳定的信号，但也可沿神经突起选取感兴趣区域并测量信号。</li>
 </ol>
 4. 问题解决
 <ol>
 <li>漂白：激发光照射可导致荧光团发生漂白，表现为信号随照射强度呈持续下降。采用比率测量有助于对此进行校正。然而，特定波长的选择性漂白仍可能发生（通常 CFP 比 YFP 漂白更快）。若出现漂白现象，可通过缩短曝光时间 和/或降低激发光强度（在照明光路中使用中性密度滤光片）来减少光照暴露。如有必要，可通过运行模拟实验（采用相同的激发光照但不施加神经刺激）并量化信号衰减的时间常数来补偿漂白效应。</li>
 <li>固定：对于本文所述的简单图像分析，实验期间动物必须保持相对静止至关重要。C. elegans 会对光照和实验刺激产生反应，因此在记录时最有可能发生移动。轻微移动尤其在对轴突过程进行测量时，会引入显著的噪声。比率分析在一定程度上有助于减轻这些影响，而来自细胞体的测量结果更为稳健。仔细执行并优化固定操作可实现动物完全静止。</li>
 <li>背景区域选择：成功的图像分析需要仔细选择背景区域。背景区域应具有合理的均匀性，且比所成像的神经元更暗。其位置必须足够远离目标区域，以避免来自成像神经元的散射光（从而接收到信号）。我们发现，在大多数情况下，选择距离 ROI 20–50 μm 的均匀区域效果良好。</li>
 <li>比率光学系统：成像光学系统的正确校准对于生成清晰的双图像至关重要。市面上可提供用于比率成像的商用显微镜附件。另一种方法是采用快速连续成像，通过高速滤光轮在发射波长之间快速切换，同时分别记录各波长的图像。</li>
 <li>比率分析：此处描述的分析方法是一种相对简单的技术，通过在 ROI 上进行平均而获得稳健的信号。该方法需要一个可清晰识别的明亮目标以选定 ROI。通过精确对齐和配准双图像，可实现逐像素计算荧光比率，从而进行更复杂的比率分析。</li>
 </ol>

<ol><li>Miyawaki, A., Llopis, J., Heim, R., McCaffery, J. M., Adams, J. A., Ikura, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+Ca2%2B+based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li>
<li>Kerr, R. Imaging the activity of neurons and muscles. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKerr%2C+R+%22WormBook%22">WormBook</a>. , The C. elegans Reseach Community. (2006).</li>
<li>Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875(2009).</li>
<li>Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li>
<li>Rand, J. B. Acetylcholine. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRand%2C+JB+%22WormBook%22">WormBook</a>. , The C. elegans Reseach Community. (2005).</li>
<li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+using+nanoparticle-mediated+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization.</a> PLoS ONE. 8 (1), e53419(2013).</li>
<li>Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Laser+Axotomy+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo Laser Axotomy in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (51), e2707(2011).</li>
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<li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).</li>
<li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+array+of+clamps+for+immobilizing+and+imaging+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans.</a> Lab. Chip. 7, 1515-1523 (2007).</li>
<li>Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+mediate+electrosensory+behavior+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 27, 7586-7596 (2007).</li>
<li>Pinan-Lucarre, B., Gabel, C. V., Reina, C. P., Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Slone, R. D., Xue, J., Qiao, Y., Weisberg, S., Roodhouse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Core+Apoptotic+Executioner+Proteins+CED-3+and+CED-4+Promote+Initiation+of+Neuronal+Regeneration+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The Core Apoptotic Executioner Proteins CED-3 and CED-4 Promote Initiation of Neuronal Regeneration in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biol. 10, e1001331(2012).</li>
<li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+AFD+neuron+in+C.+elegans+thermotaxis+analyzed+using+femtosecond+laser+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation.</a> BMC Neurosci. 7, 30(2006).</li>
<li>Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+dynamic+range+of+fluorescent+indicators+for+Ca%282%2B%29+by+circularly+permuted+yellow+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10554-10559 (2004).</li>
<li>Kindt, K. S., Quast, K. B., Giles, A. C., De, S., Hendrey, D., Nicastro, I., Rankin, C. H., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+mediates+context-dependent+modulation+of+sensory+plasticity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dopamine mediates context-dependent modulation of sensory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 55, 662-676 (2007).</li>
<li>Chalasani, S. H., Chronis, N., Tsunozaki, M., Gray, J. M., Ramot, D., Goodman, M. B., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+a+circuit+for+olfactory+behaviour+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 450, 63-70 (2007).</li>
<li>Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+activity+patterns+in+thermosensory+neurons+of+freely+moving+Caenorhabditis+elegans+encode+spatial+thermal+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients.</a> J. Neurosci. 27, 6083-6090 (2007).</li>
<li>Biron, D., Shibuya, M., Gabel, C., Wasserman, S. M., Clark, D. A., Brown, A., Sengupta, P., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+diacylglycerol+kinase+modulates+long-term+thermotactic+behavioral+plasticity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A diacylglycerol kinase modulates long-term thermotactic behavioral plasticity in C. elegans.</a> Nat. Neurosci. 9, 1499-1505 (2006).</li>
<li>Ghosh-Roy, A., Wu, Z. L., Goncharov, A., Jin, Y. S., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+Cyclic+AMP+Promote+Axonal+Regeneration+in+Caenorhabditis+elegans+and+Require+DLK-1+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase.</a> Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).</li>
<li>Bianchi, L., Gerstbrein, B., Frokjaer-Jensen, C., Royal, D. C., Mukherjee, G., Royal, M. A., Xue, J., Schafer, W. R., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurotoxic+MEC-4%28d%29+DEG%2FENaC+sodium+channel+conducts+calcium%3A+implications+for+necrosis+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation.</a> Nat. Neurosci. 7, 1337-1344 (2004).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

基因编码的钙离子指示剂已广泛应用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）神经生物学研究中。多个研究团队已采用这些技术来研究初级感觉神经元对外部刺激的反应，本文中展示的ASJ神经元对电场的响应即为一例。典型的研究包括对机械触觉、特定化学物质、温度以及电场的感知12, 16-19。中间神经元和肌肉细胞的活动也已被监测，无论是在刺激下的响应，还是在调控动物行为过程中的作用。许多此类研究进一步结合图像识别与追踪技术，使研究人员能够在部分固定甚至自由活动的动物体内记录神经元活动，并实现多个神经元的同步记录。此外，还有一些研究探讨了钙离子生理学的其他方面，例如神经元损伤后的钙信号响应13, 20（本文亦有展示），以及在较长时间尺度上的神经元退行性变化21。
	在设计特定实验时，应仔细考虑常用钙离子探针和动物固定方法的各种替代技术。固定方法的选择取决于技术因素，例如是否需要对动物进行物理操作、成像后是否需要恢复动物，或是否需要高通量处理。不同的荧光钙离子探针也各有其优缺点。GCaMP 采用简单的单通道图像分析，且具...

本文介绍了实用的方法 体内 钙成像在 秀丽隐杆线虫 神经元。具有高信噪比的基因编码钙敏感荧光探针的发展使得 秀丽隐杆线虫 一种相对简便且成本效益较高的神经系统生理活动测量系统。我们的成像采用标准的复式显微镜，结合广泛可用的荧光染料进行宽场荧光成像。本文介绍了多种使用不同荧光染料及样品制备方法的技术，并讨论了每种方法的优势与局限性。随后展示了两个示例实验的数据结果。关于此处所述技术的另一优秀参考资料可参见WormBook中的文章《Imaging the activity of neurons and muscles》（作者：R. Kerr）。<a href="http://www.wormbook.org" target="_blank">http://www.wormbook.org</a>) 3.
 在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中，常用的基因编码荧光钙离子探针主要有两大类：单通道GCaMP和基于FRET的钙调蛋白探针（cameleon）。我们将介绍每种方法的具体操作，并展示相应的数据示例。
 GCaMP 是基于一种对周围钙离子浓度敏感的改良型绿色荧光蛋白（GFP）构建而成。其原理是将 GFP 与高钙亲和力蛋白钙调蛋白（calmodulin）融合，使得钙调蛋白结合钙离子后，促使 GFP 分子构象转变为高效荧光状态2。近年来，这类荧光探针的不断改进使其在生理范围内的钙浓度变化下可产生显著的信号响应，荧光强度最高可增加达 500%，且具有相对较快的动力学特性，上升时间约为 95 毫秒，衰减时间约为 650 毫秒4。在相对较短的时间尺度内（数分钟），如此显著的信号强度使得可以采用较低分辨率的成像方式（较低放大倍数），并且在初始基线信号稳定可靠的前提下，无需持续进行基线或对照测量。
 Cameleon 的优势在于它是一种基于 FRET 的荧光蛋白，可通过比较两个独立通道或波长，产生比率型测量结果 1由两种独立的荧光团（青色和黄色发射的荧光蛋白，CFP 和 YFP）通过钙调蛋白（calmodulin）连接而成。该复合物用蓝光（440 nm）照射，激发 CFP。钙离子结合后使两个荧光团彼此靠近，增强从 CFP（供体）到 YFP（受体）的荧光共振能量转移（FRET），导致 CFP 发射光（480 nm）减弱，YFP 发射光（535 nm）增强。相对钙离子浓度通过 YFP 与 CFP 荧光强度的比值来测定。Cameleon 的动力学比 GCaMP 慢，已测得 体内 上升时间约为1秒，衰减时间约为3秒 5然而，反向移动信号的比率能够增大信号强度，并可补偿由荧光探针浓度变化、运动或焦平面漂移以及漂白等因素引起的多种可能伪影。 
 基因编码的荧光报告分子可大幅减少使用外源性探针所需的样品制备步骤，而 C. elegans 体型微小且身体透明，使得利用简单的宽场荧光显微镜即可在完整活体动物内进行成像。因此，样品制备中的主要技术挑战是如何安全地固定动物。目前有多种常用的技术方法，各自具有优缺点。使用药理学试剂使动物瘫痪是一种易于实施的方法，且可在同一制备样本上固定多个动物（通常使用烟碱型乙酰胆碱受体激动剂左旋咪唑（Levamisole），其可导致肌肉组织强直性收缩6）。C. elegans 也可通过将其固定在坚硬的10%琼脂糖凝胶上实现物理固定7, 8。该方法对动物生理状态影响最小，适用于长时间成像（数小时）、并可实现多个动物的回收，但技术操作难度较高。然而，上述两种方法均限制了对动物的物理接触（因动物被盖玻片覆盖），因此仅适用于某些特定实验刺激（如光、温度、电场或激光损伤）。对于需要直接物理接触的刺激，例如机械触碰或化学物质施加，许多研究已成功使用兽用级别胶水将 C. elegans 固定在位9。该方法技术难度更高，仅适用于单个动物，且无法实现动物回收。此外，已有多种微流控装置被用于物理限制 C. elegans，这类装置可在保持动物正常生理状态的同时，允许施加多种类型的刺激（取决于装置设计），并实现动物的快速更换与回收10, 11。然而，微流控技术需要额外的设计、加工和操作方面的专业技术与设备支持。在固定动物中，通常可测量感觉神经元和中间神经元的活动及其对刺激的响应；而运动神经元的活动则需要更复杂的技术手段，以实现对活动动物的成像。本文将详细介绍两种最为简便的技术方法：药理学麻痹法和坚硬琼脂糖固定法。
 本文介绍的方法可用于测量秀丽隐杆线虫（C. elegans）中的神经元活动和细胞生理状态。我们分别给出了两个示例：利用GCaMP检测ASJ神经元对外加电场的感知反应，以及利用cameleon检测神经元激光损伤后的生理钙反应。这些示例展示了两种荧光探针各自的优点与局限性，并说明了该系统所能实现的实验能力。

<table><tbody><tr><td>Eclipse Ti-U 倒置显微镜&lt;br/&gt; 显微镜</td><td>尼康</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intensilight HG 照明器</td><td>尼康</td><td>C-HGFI</td><td>荧光光源</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo VC 60X 油镜</td><td>尼康</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光学平台或 3'X3' 光学平台&lt;br/&gt; 面包板等级</td><td>Thor Labs</td><td></td><td>如果不使用光学平台，一个&lt;br/&gt; 光学级面包板上的&lt;br/&gt; 坚固的实验台应&lt;br/&gt; 足够。</td></tr><tr><td>Clara Interline 相机</td><td>Andor&lt;br/&gt; 技术</td><td></td><td>高灵敏度CCD相机</td></tr><tr><td>wtGFP 长通发射</td><td>Chroma Technology&lt;br/&gt; 公司</td><td>41015</td><td>用于成像 GCaMP 的 GFP 滤光片组</td></tr><tr><td>440 ± 10 nm 滤光片</td><td>Chroma</td><td>D440/20x EX</td><td>cameleon激发滤光片</td></tr><tr><td>二向色镜 &amp;> 455 nm&lt;br/&gt; 长通滤光片</td><td>Chroma</td><td>455DCLP BS</td><td>用于cameleon的显微镜二向色镜&lt;br/&gt; 成像</td></tr><tr><td>二向色镜 &amp;> 515 nm&lt;br/&gt; 长通滤光片</td><td>Chroma</td><td>515DCLP BS</td><td>用于cameleon的二向色镜&lt;br/&gt; 成像</td></tr><tr><td>535 ± 15 nm 滤光片</td><td>Chroma</td><td>D535/30m EM</td><td>YFP发射滤光片</td></tr><tr><td>滤光片 480 ± 20 nm</td><td>Chroma</td><td>D485/40m EM</td><td>CFP发射滤光片</td></tr><tr><td>镜头，200 mm，消色差</td><td>Thor Labs</td><td>AC508-200-A1</td><td>FRET 光学中继透镜（3）</td></tr><tr><td>银宽带镜</td><td>Thor Labs</td><td>ME2S-P01</td><td>FRET 光学系统（2）</td></tr><tr><td>NGM 缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>左旋咪唑</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯微球</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>08691-10, 2.5% by&lt;br/&gt; 体积，50 nm&lt;br/&gt; 直径</td><td>聚苯乙烯纳米颗粒用于 &lt;em&gt;C.&lt;/em&gt;&lt;br/&gt; &lt;em&gt;秀丽隐杆线虫 &lt;/em&gt;固定</td></tr><tr><td>转基因品系，品系&lt;br/&gt; &lt;em&gt;gpa-9::GCaMP3（在 pha-1 背景中）&lt;/em&gt;&lt;br/&gt; &lt;em&gt;him-5 bkg &lt;/em&gt;</td><td>Sternberg 实验室</td><td>品系 PS6388</td><td></td></tr><tr><td>转基因品系， &lt;em&gt;mec-&lt;/em&gt;&lt;br/&gt; &lt;em&gt;4::YC3.60&lt;/em&gt;</td><td>加贝尔实验室</td><td>品系 CG1B</td><td></td></tr></tbody></table>

体内 神经元钙成像在 c. elegans 中的应用

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

线虫 秀丽隐杆线虫 是进行相对简单且低成本神经成像的理想模式生物 体内其微小透明的身体和结构简单且特征明确的神经系统，使得可在完整动物体内识别并进行任意神经元的荧光成像。通过简单的固定技术，可对动物生理状态产生最小干扰，从而实现长时间的延时成像。基因编码的钙离子敏感型荧光探针（如cameleon）的发展 1 和 GCaMP 2 允许 在体 神经元钙成像，关联细胞生理学与神经元活动。大量表达这些荧光蛋白的转基因品系可直接获得，或可通过成熟技术构建。本文详细描述在单个神经元内测量钙动态变化的实验步骤 体内 同时使用GCaMP和cameleon。我们讨论了这两种方法的优缺点，以及各种样品制备（动物固定）和图像分析方法。最后，我们展示了两个实验的结果：1）利用GCaMP测量特定神经元对外部电场的感官反应；2）利用cameleon测量神经元对激光创伤的生理性钙反应。此类钙成像技术在 秀丽隐杆线虫 并已扩展应用于自由活动动物的测量、多个神经元的同步记录，以及不同遗传背景之间的比较。 秀丽隐杆线虫 呈现了一个稳健且灵活的系统 体内 在技术简便性和成本方面，神经元成像相较于其他模型系统具有优势。

本文展示了两个独立实验的结果。第一个实验采用GCaMP来测量特定感觉神经元对明确定义的外部刺激的反应，很好地示例了如何利用荧光钙指示剂在完整秀丽隐杆线虫（C. elegans）中光学监测神经元活动。第二个实验则采用cameleon来测量特定激光损伤后神经元内触发的细胞内钙瞬变，从而说明如何在活体（in vivo）条件下对单个细胞的钙生理学进行测量。为了聚焦于每种测量方法的技术细节，本文详细呈现并讨论了单次实验的结果。通常，研究人员会计算随时间变化的平均反应（即在每个时间点相对于刺激的反应平均值），或计算特定指标（如反应的平均振幅），这些指标均基于多次实验的结果。通常需要进行10至20次实验才能获得可接受的平均测量值，但具体次数取决于反应本身的固有变异性。本文所讨论实验的相关数据分析可参见文献12和13。
GCaMP测量感觉反应： 当施加较强的外部电场（≥3 V/cm）时，秀丽隐杆线虫 主动向电场的负极精确爬行。我们先前的研究表明，这种趋电性行为主要由动...

凭借其微小透明的身体、详尽记录的神经解剖结构，以及一系列适用的遗传学技术和试剂， 秀丽隐杆线虫 是理想的模式生物 体内 使用相对简单且低成本的技术进行神经元成像。本文描述了利用基因编码的荧光钙指示剂在完整成年动物体内进行单个神经元成像的方法。

体内 神经元钙成像在 C. elegans 中的应用

线虫秀丽隐杆线虫（C. elegans）是体内神经元成像的理想模式生物，因其体型小、身体透明且结构简单，适合进行相对简便且低成本的神经成像研究。

以下实验的总体目标是利用基因编码的荧光指示剂来测量线虫秀丽隐杆线虫单个神经元内的钙离子动态变化。为实现这一目标，首先将表达有钙离子敏感型荧光蛋白的完整秀丽隐杆线虫固定在标准显微镜载玻片上并使其 immobilized（固定不动）。随后，使用视频显微镜和标准的落射荧光成像技术对单个神经元进行活体成像。随后通过分析视频，测量神经元特定位置两种常用荧光探针的荧光强度：一种是G-CaMP，可产生强健且大幅值的单通道信号；另一种是基于FRET的Chameleon探针，可生成双通道比率信号。通过该方法获得的定量测量结果，可反映神经元对特定感觉刺激的响应情况，以及细胞损伤后细胞内钙离子生理变化，二者均基于对成像神经元内相对钙离子水平的光学测量。与脊椎动物系统中的类似方法或传统电生理学技术相比，该技术的主要优势在于，秀丽隐杆线虫（C. elegans）是一个稳定、灵活且遗传操作便捷的活体神经成像模型系统，技术上简便且成本较低。该方法有助于解答基于神经生物学的广泛领域中的关键问题，能够在活体条件下对单个神经元的活动和信号进行测量。首先使用具备落射荧光成像功能的标准复式显微镜，以获得最佳的图像和信号质量。为最大限度提高单色荧光成像的分辨率和灵敏度，同时降低背景噪声，应采用高倍率、高数值孔径的物镜以及高灵敏度冷却CCD相机。使用专为G camp的Fluor four特定波长设计的标准显微镜荧光滤光片组。对于GFP，使用在488纳米激发和525纳米发射条件下优化的标准滤光片组。对于Chameleon等比例荧光探针，采用双成像系统，以便在两个不同波长下同时获取相同的图像。这可以通过 commercially available 或自行搭建的系统实现，该系统以如下方式将双图像并排投射到相机上。显微镜滤光片组包含一个激发滤光片，其波长为440 ± 20 纳米，以及一个455 纳米长通二向色镜；一个图像掩膜被放置在初始像平面处，该位置位于显微镜成像端口外侧，通常为相机CCD传感器所在的位置；第一组中继透镜位于距离初始像平面一个焦距的位置，用于使光线准直；一个二向色镜将光线分至两个独立的成像波长或通道，反射一种颜色的同时透射另一种颜色；发射滤光片进一步将透射光限制在特定的成像波长范围内；第二组中继透镜，每个通道各有一个，放置在光路中，用于将光线重新聚焦至CCD相机处的第二个像平面。一对反射镜和第二块二向色镜引导光路，使两幅图像重新合并，并并排投射到相机的CCD传感器上。以下是所得到图像的示例。建立系统后，可按以下方式调整和优化图像：移动相机位置，使透射图像覆盖相机视场的一半；通过调节反射光路中最后两个反射镜，使反射图像覆盖视场的另一半；并通过沿光路前后移动每个通道的第二个中继透镜来优化焦距。从Citis遗传中心或其他来源获取在目标神经元中表达钙敏感荧光蛋白的实验动物。或者，使用标准的秀丽隐杆

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C.在体内神经元钙成像技术线虫

本视频介绍了钙成像背后的概念，并包含一个示例方案，用于对置于模制琼脂糖小孔中的线虫进行延时成像。...

钙成像：一种在活体 C. elegans 中可视化神经活动的方法

本视频展示了一种利用基因编码的荧光报告蛋白对行为活动中的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

秀丽隐杆线虫卵子产出行为调控中单个神经元的钙成像

来源：Doser, R., 等. 体内神经元钙处理的亚细胞成像. J. Vis. Exp. (2023)本视频展示了对转基因秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

成像秀丽隐杆线虫神经元中的亚细胞钙动力学

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用于长期钙成像的琼脂糖微室培养秀丽隐杆线虫 Caenorhabditis elegans

本方案描述了使用基因编码的Ca2+探针记录自由活动的Caenorhabditis...

行为动物中单个神经元的比率钙成像 秀丽隐杆线虫

该方法提供了一种将光遗传学与基因编码的钙离子传感器相结合的技术，用于成像模式生物 C. elegans...

在体钙成像技术在 C. elegans 体壁肌肉中的应用

本文报道了一种可在自由活动的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中进行钙成像的系统，该系统能够实现良好控制且非局域化的振动刺激。该系统使研究人员能够以纳米级位移精确控制非局域化振动的特性，并量化秀丽隐杆线虫（C.

自由活动状态下的钙成像 秀丽隐杆线虫 具有良好控制的非局域振动

树突棘是神经系统的重要细胞特征。本文描述了用于评估线虫（C.

在 Caenorhabditis elegans 中成像树突棘

当前方法描述了一种用于高分辨率、亚区室钙成像的非比率测量法 体内 在 秀丽隐杆线虫 使用 readily available 遗传编码钙离子指示剂.

神经元钙处理的亚细胞成像 在体

体内可视化受精及早期发育过程中的钙瞬变 秀丽隐杆线虫

学习利用基因编码荧光钙指示剂在秀丽隐杆线虫神经元中进行钙成像的技术。该方法可测量单神经元钙动态，分析感觉刺激与细胞损伤响应，为神经功能研究提供简便且经济的活体成像方案。

体内神经元钙成像在 C. elegans 中的应用

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