高效，快速的早期胚胎分离拟南芥种子
June 7th, 2013
我们报告了一种简单有效的方法分离胚胎在早期发展阶段拟南芥种子。多达40个胚胎可以在1小时至4小时，分离根据下游应用。该程序是适用于转录，DNA甲基化，报告基因的表达，免疫荧光杂交分析。
该程序的总体目标是分离年轻的植物胚胎。这是通过首先解剖种子来完成的。第二步是在分离缓冲液中轻轻压碎种子。
接下来筛选胚胎，然后在倒置显微镜下通过显微抽吸收集。最后一步是在洗涤后以最小体积收集所有胚胎，并将它们转移到目标缓冲液中。最终，胚胎可用于 RNA 或 DNA 提取以分析转录组或表观基因组，或用于细胞学分析，例如基因报告基因分析或荧光原位杂交。
该技术的主要优点是能够在特定发育阶段批量分离植物胚胎。一般来说，刚接触这种方法的人可以毫无问题地快速有效地应用它。首先，在立体显微镜下选择先前经过硅化、拉动和切割的最佳形状的毛细管。
如文本协议中所述，开口应光滑，约为 50 至 100 微米。接下来，洗涤剂洗涤后，在 Coplin 染色缸中用 10% SDS 洗涤硅化多孔玻璃显微镜载玻片 10 分钟。将玻片洗涤两次，每次 2 分钟。
在无核酸酶的水中，在 70% 乙醇中浸泡 2 分钟，在 100% 乙醇中浸泡 2 分钟，然后风干。然后用移液管将约 0.5 微升 10 毫克/毫升、牛血清白蛋白或 BSA 涂抹在每个孔的整个表面上，并风干。接下来，准备胚胎分离显微镜。
使用具有 10 倍和 20 倍放大倍率物镜的倒置显微镜。将玻璃毛细管连接到微量注射器以涂覆微量毛细管。吸收大约 6 微升 BSA 并释放它。
在所需的发育阶段收集光滑的鱼，要么在杂交之后，要么在自体受精鞋底之后。授粉后 2.5 天在这里使用，包含两到四个细胞胚胎。在立体显微镜下用镊子和胰岛素从 10 到 15 个 LIC 中取出种子。针。
将种子浸入 20 微升分离缓冲液中，置于置于冰上的 2 毫升圆底 eend 管中。按照文本方案中的说明，用预先清洁的塑料杵轻轻压碎种子，以释放胚胎，直到种子提取物浑浊。适用的力度由每个用户在试用时确定。
用 300 微升分离缓冲液冲洗研杵以洗涤研杵并稀释样品。离心后，将提取物以 5， 000 chi 离心 5 秒钟。通过上下吹打 2 到 3 次，轻轻地重悬沉淀的提取物。
用安装在试管接头上的 30 微米尼龙网过滤提取物，然后摆动试管。用额外的 200 μL 分离剂、缓冲液和摆动剂冲洗网片。再。要准备用于胚胎分离的载玻片，请将干净的 BSA 涂层和硅化多孔载玻片放在倒置显微镜的载物台上。
将毛细管放在载玻片上方并调整位置以使开口位于视野中。复苏后，通过轻轻上下移液来悬浮过滤的种子提取物，将两滴 40 至 50 微升的种子提取物移液到一个或两个孔中。一次仅筛选一滴或两滴，防止样品蒸发将 50 μL 新鲜分离缓冲液放入与以前制备的不同玻片的孔中。
作为第一滴洗涤液。将此玻片保存在有盖的潮湿室中，以防止蒸发。如有必要，使用 10 倍放大镜在所需阶段筛选胚胎的种子提取物液滴。
用 20 倍放大倍数确认载物台。胚胎通常会沉到载玻片的底部。此过程最重要的方面是收集碎屑最少的胚胎。
这可以通过使用钨针清洁、仔细控制洗涤滴是否有潜在的携带碎屑以及必要时重复 wass 来实现。用钨针、胰岛素针或类似设备手动清除胚胎周围的碎屑。使用微型纵器将玻璃毛细管移动到胚胎附近，并用尽可能少的溶液吸收胚胎。
收集几个胚胎并在第一次洗涤中释放它们。落。对于细胞学应用的分子应用，胚胎可以直接进入目标缓冲液。每轮收集应在 5 到 10 分钟内保存，并且胚胎应以最小体积收集。
重复筛选和收集，直到在第一个洗涤滴中收集到所需数量的胚胎。如果碎屑被带入洗涤液滴中，请用针头将其清除，然后立即从液滴中回收所有胚胎。将胚胎释放到 50 微升的第二滴洗涤液中，然后重复回忆。
最后，释放目标缓冲液中的胚胎。转移应仅涉及所示毛细管尖端的接触，而不是浸入。以下是洗涤后最后一滴的几个胚胎。
分离的植物胚胎现在可用于各种下游应用，以控制胚胎 CD NA。测序前的文库。胚胎特异性转录本被扩增显示。以下是 CD NA 上的 PCR 扩增结果。2 到 4 个细胞胚胎的文库洗涤一次，基因组 DNA 胚胎分离已被证明在胚胎表达低的报告基因检测中非常有用，并且此处显示的母体种皮混淆检测是在 Madea 启动子控制下表达 GUS 报告基因的胚胎。
最后，应用 C 2 中荧光杂交来研究嵌入载玻片上丙烯酰胺垫中的分离胚胎的核结构。这里显示了一个使用探针针对着丝粒重复序列和核下组织区的实例。一旦掌握，该技术可以在不到一小时的时间内分离出 30 个胚胎用于细胞学应用，在不到三个小时内用于分子应用，包括所有洗涤步骤。
实际上，这项技术将使植物研究界能够探索胚胎发生的遗传和表观遗传机制。
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概述
本文介绍了一种从拟南芥种子中高效分离早期胚胎的方法。该程序可在1到4小时内分离出最多40个胚胎，适用于各种下游应用。
关键研究组成部分
科学领域
- 植物发育
- 胚胎分离
- 基因分析
背景
- 了解植物胚胎发育对于基因研究至关重要。
- 拟南芥是植物生物学中的模式生物。
- 高效的胚胎分离技术增强了研究能力。
- 应用包括转录组和表观基因组分析。
研究目的
- 开发一种简单的分离幼年植物胚胎的方法。
- 为各种分析如RNA和DNA提取提供便利。
- 支持细胞分析，包括基因报告分析。
使用的方法
- 解剖种子以获取胚胎。
- 在分离缓冲液中压碎种子。
- 在倒置显微镜下使用微吸取法收集胚胎。
- 洗涤并将胚胎转移到目标缓冲液中。
主要结果
- 最多可以高效分离40个胚胎。
- 该方法适用于各种下游应用。
- 胚胎可用于RNA或DNA提取。
- 适合免疫染色等细胞分析。
结论
- 开发的方法高效且简单明了。
- 它增强了在胚胎阶段研究植物发育的能力。
- 为进一步的遗传和表观遗传研究提供了基础。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolating early-stage plant embryos enables precise interrogation of genetic and epigenetic mechanisms during embryogenesis, supporting target validation in plant-based biopharma discovery. This method provides a scalable, reproducible source of stage-specific embryos for molecular and cytological analyses, reducing technical barriers in target de-risking workflows. It supports predictive confidence in lead identification by facilitating high-quality omics and imaging data from defined developmental windows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of embryonic gene targets by isolating pure populations of 2-4 cell embryos for downstream assays.
- Operational Value: Yields up to 40 embryos in 1-4 hours, supporting medium-throughput target screening without specialized equipment.
- Predictive Value: Provides stage-resolved biological material for transcriptome and epigenome analysis, improving target hypothesis confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Isolated embryos are suitable for RT-PCR, RNA-seq, DNA methylation, FISH, immunostaining, and reporter gene assays, enabling multi-omics screening.
- Operational Value: Uses low-cost, transferable techniques (plastic pestle, glass capillary, inverted microscope) for assay standardization across labs.
- Scalability: Simple setup allows replication across teams for consistent embryo collection in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports biomarker discovery by enabling epigenomic and transcriptomic profiling of early embryos.
- Mechanistic De-risking: Facilitates cytological analysis (e.g., FISH, reporter assays) to validate gene expression patterns in native embryonic context.
- Preclinical Model Relevance: Provides a defined developmental system (Arabidopsis) for studying conserved embryogenesis mechanisms relevant to crop improvement platforms.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, providing stage-specific embryos for omics and imaging assays that inform target selection and lead optimization prior to preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling isolation of embryos at precise developmental stages for genetic and epigenetic analysis.
- Screening: Generates standardized embryo samples suitable for quantitative molecular assays (RNA-seq, methylation) and cytological readouts.
- Analytics: Delivers high-purity embryonic material for transcriptome, epigenome, and imaging-based measurements that inform target prioritization.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical continuity by providing mechanistic insights into embryogenesis regulation.
- Enterprise Reuse: Low-cost, equipment-light protocol enables broad adoption across research groups as a reusable capability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing clean embryonic material free from seed coat and endosperm contamination.
- Operational Value: Simple, transferable technique ensures reproducibility and minimizes variability in embryo isolation across users.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions in target validation by accelerating access to stage-specific embryonic data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets through reliable embryonic omics and phenotypic data.
Implementation Considerations
- Requires basic microscopy skills and embryo staging competence under inverted light microscopy.
- Needs standard lab equipment: plastic pestle, Eppendorf tubes, glass capillaries, BSA-coated slides, and isolation buffer.
- Demands consistent seed handling and crushing force optimization to avoid embryo damage or excessive debris.
- Requires adaptation of collection timing and washing steps based on downstream application (molecular vs. cytological).
- Limited by embryo fragility and adhesion to maternal tissues, necessitating careful manipulation to maintain viability and purity.
