Name: 隔离原住民土壤微生物潜力打破生物降解塑料地膜应用于农业 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 38 s
Description: 了解如何从可生物降解地膜中分离土著土壤真菌和细菌，并评估其降解能力。本方法利用网袋培养、稀释平板和液体培养基验证，为农业塑料废弃物微生物降解研究提供可靠技术方案。

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感谢 Stephen Alderman 博士、David Leaf 博士和 Erin Macri 在显微镜技术方面提供的帮助。本研究由美国农业部国家食品与农业研究所特色作物研究计划（NIFA Specialty Crops Research Initiative, USDA SCRI-SREP）资助，项目编号为 2009-02484。Briana Kinash、Kevin Kinloch、Megan Leonhard Joseph McCollum、Maria McSharry 和 Nicole Sallee 提供了出色的技术支持和富有见地的讨论。

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文所述方法是一种从土壤中分离潜在生物降解材料（BDM）降解菌的初步技术，已成功用于分离在土壤中掩埋七个月后的BDM材料上的真菌。当将这些真菌重新接种到相同类型的新型BDM材料上时，真菌能够生长，表明所分离的真菌确实是能够在BDM上定植的菌种，且这些薄膜对真菌生长无抑制作用。分离出的可降解塑料的真菌和细菌未来有可能被单独或组合用于土壤或堆肥改良，以促进塑料的降解。
在自然土壤环境中，微生物物种并非孤立存在。降解塑料的微生物，甚至是以其他碳源和能源生长的寡营养生物，若能在生物降解材料（BDMs）上定殖，可能在这些难降解营养物质的利用过程中发挥关键物种的作用。为了评估BDM的降解情况 体外 但为了更真实地模拟土壤微生物群落，本文所述方法可进行调整，用于测试真菌和细菌接种物的混合物，而非纯分离物。
值得注意的是，菌株 TT、XX、Vv 和 YY 对 BDMs 的降解程度极低，但在平板和液体生物测定中均显示出明显的 BDM 定植现象。因此，可见的定植并不一定意味着 BDM 聚合物的降解。菌株 TT、XX、Vv 和 Y...

传统上，降解一直被视为塑料聚合物的不良特性，因为其会缩短产品的使用寿命和耐久性。近年来，人们逐渐意识到塑料废弃物在自然环境中所造成的环境问题1,2,3，这使得可生物降解塑料成为传统塑料材料的一种有吸引力的替代选择。降解（定义为结构变化、碎裂以及分子量、完整性和强度的降低4,5）通过一系列事件发生，包括非生物过程（热应力、光氧化、水解、侵蚀和机械应力）以及生物降解过程6。虽然非生物过程可以改变塑料碎片的尺寸和特性，但其最终矿化为水和二氧化碳（在有氧条件下）和/或甲烷（在无氧条件下）则需要微生物的参与。
在农业领域，可生物降解塑料具有广阔的应用前景，其中塑料地膜被广泛用于抑制杂草生长、保持土壤水分以及提高土壤温度7,8。仅在美国，就有数十万英亩的土地使用了塑料地膜9，其中包括由可生物降解塑料制成的地膜。在作物生长季结束后，可生物降解地膜（BDMs）的处理方式包括填埋处置、焚烧回收能源10、通过堆肥降解，或在耕作后于土壤中降解11。在这些处理方式中，将BDMs翻耕入土是最省劳力的方法；然而，若在非种植季节（通常为冬季）无法实现高效降解和矿化，残留的塑料碎片可能在春季耕作和播种时干扰农业机械的正常作业，并在环境中长期存留，对野生动物、植物及微生物群落造成显著影响1,2,3,10。
尽管许多塑料制品（包括农用覆盖膜）标有“可生物降解”或“可堆肥”的标签，但在实际应用中，其降解和矿化过程可能效率过低和/或不完全，导致在土壤中分解无法成为这些产品处置的可行替代方案。例如，氧化生物降解聚乙烯在经历一年户外老化后，再在58 °C的堆肥环境中放置三个月，仅实现了12.4%的矿化；当堆肥温度为25 °C时，矿化程度甚至不到前者的一半12。在冬季，大多数地区的土壤温度将低于上述两种温度，微生物活性可能进一步降低，从而导致矿化程度更低。除了降解速率缓慢外，“可生物降解”一词的误用也导致消费者（包括农业行业从业者）对这类产品产生不信任13,14。生物降解是指天然存在的微生物4将聚合物转化为二氧化碳（和/或甲烷）和水的过程14。因此，生物降解必须通过化学方法进行测定；微生物与基质的物理结合并不意味着该材料发生了微生物降解。
作为研究农业中生物降解地膜（BDM）可持续利用的一部分，本研究重点在于发现定殖于农业土壤并能够降解市售BDM的本土微生物。已有标准测试方法用于通过非生物和生物手段化学测定可生物降解塑料的分解过程15,16,17。然而，这些方法并未涉及单一微生物物种对塑料的降解作用，也未提供相应的微生物分离方法。本文所述方法更接近于标准方法中在将真菌孢子接种至样品后评估塑料抗微生物分解能力的实验设计18,19。
当塑料的配方已知且可获得原料来源时，可将塑料粉末悬浮于基于琼脂的培养基中，通过观察透明圈的形成来确定其降解情况13该方法此前已被用于鉴定可降解聚氨酯等聚合物的微生物20，聚（丁二酸丁二醇酯-co-己二酸21和聚乳酸（poly(lactic acid)）22一种类似的方法是将纯的塑料粉末悬浮于液体培养基中，其中塑料是唯一的碳源。20,23尽管这些方法具有体系明确的优势，但其对实际情况的模拟效果较差 原位 BDMs的降解过程存在以下差异：首先，BDMs并非以细小颗粒形式分散于土壤基质中，而是以薄膜形式销售和使用，因此其表面积分布方式不同。其次，BDMs的化学组成不同于纯聚合物，通常含有填料、增塑剂和着色剂等添加剂，这些添加剂可能影响微生物的生长，从而影响矿化速率。因此，且由于本研究中某些商用薄膜的具体成分属于商业机密，实验中直接采用可投入田间使用的塑料薄膜成品进行真菌和细菌的分离。为简洁起见，下文仅以真菌分离方法为主进行描述，并在适当时注明细菌分离所需的相应修改。
在最近的一项研究中24，三种市售的生物可降解地膜（BDM）和一种实验性薄膜在美国三个不同地区的农业试验点使用了一个生长季，随后被放入网袋（250 微米孔径）中，并在同一地点的土壤中掩埋过冬。250 微米的网孔允许真菌菌丝穿透，同时排除植物根系和大多数土壤动物，并尽量减少土壤侵入25,26。尼龙材料可防止网袋在土壤中降解。挖掘后，从 BDM 样品上分离出真菌菌株，并在基本培养基上进行培养评估，培养基中除琼脂外不提供其他碳源，仅添加一块经表面消毒的、5 cm × 5 cm 的全新未使用 BDM 薄膜（预先消毒）。大多数用作薄膜的塑料在不破坏完整性的前提下无法进行高压灭菌，因此采用紫外线照射以杀灭塑料表面存在的微生物细胞。ISO 84619 建议使用 70% 乙醇进行表面消毒并随后干燥，但若采用此方法，必须确保薄膜的任何组分或添加剂不会受到乙醇的不利影响。由于 BDMs 预期设计为可耐受阳光照射，因此选择紫外线作为去污方法。
选择在BDM碎片上生长优于仅含最低培养基的样品进行进一步研究。琼脂是一种由海洋藻类产生的多糖，常用于固化微生物培养基，因为它通常不会被农业和医学上重要的微生物作为代谢底物利用；然而，已有研究从海洋细菌中分离出能够水解琼脂的酶27，也从土壤中分离出具有琼脂降解能力的细菌28。BDM聚合物和琼脂预计都是土壤真菌分泌酶类的稀有底物，因为这些真菌并未进化于含有此类聚合物作为潜在营养来源的环境中，但本研究所述的平板生物测定法中同时存在这两种底物（步骤 7）。通过比较真菌在琼脂固化培养基上的生长情况——其中（i）未添加除琼脂外的碳源（阴性对照），（ii）含BDM薄膜（实验组）和（iii）含葡萄糖（阳性对照）——可区分以BDM为碳源而不利用琼脂的真菌与仅利用琼脂的真菌。所有分离株均预期能在添加葡萄糖的最低培养基上生长；若某些真菌无法在含葡萄糖的平板上生长，可能表明其不能在本实验所用的特定最低培养基上生长。潜在的BDM降解菌应在琼脂固化最低培养基+BDM薄膜上的生长优于仅含琼脂固化最低培养基的对照组。能在最低培养基平板上生长的真菌属于琼脂降解菌或寡营养菌，它们也预期能在生物测定平板中与BDM薄膜相关的琼脂上生长，但不能在薄膜本身上生长（除非偶然同时具备降解BDM聚合物的能力）。
为了排除因利用琼脂而非BDMs导致微生物生长的可能性，我们在琼脂平板上进行BDM定植的初步实验后，接着在确定成分的液体培养基中开展了生物降解实验（步骤 9）。在生物降解实验管中，BDM碎片是唯一的已知碳源。
经过初步筛选，并在复苏分离株的甘油保存菌种后，部分菌株在不含任何已知碳源的液体限定培养基中形成了少量但可见的菌丝。这些结果表明，部分获得的分离株为寡营养微生物——即能够通过利用水环境中溶解的或空气中以挥发性形式存在的微量碳、氮及其他营养物质进行生长的生物体29,30,31通过18S核糖体DNA分析进行物种鉴定支持了这一观点，因为许多分离株与先前报道具有寡营养特性的真菌属相匹配32寡营养型生物通常为腐生生物，需要具备广泛的代谢能力，以在多种环境中利用不同的底物30因此，我们从生物可降解材料（BDMs）上分离到的真菌（可能具有特殊的酶解能力）表现出寡营养生长能力，能够在微量污染物上生长，例如指纹中的皮肤油脂、灰尘或空气中的痕量挥发物，这一点并不令人意外。由于分离到了寡营养微生物，我们得出结论：仅凭微生物在BDM表面生长这一现象，不足以推断BDM发生了降解。本文所述方法反映了我们从农业土壤中筛选土著BDM定殖微生物的努力 真正有效的 BDM 分解。

<table><tbody><tr><td>马铃薯葡萄糖琼脂</td><td>Becton Dickinson</td><td>8X05491</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Fisher</td><td>BP 1423-2</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Acros Organics</td><td>200-287-4</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16216-10</td><td>有毒</td></tr><tr><td>分子筛</td><td>Fisher</td><td>M-8892</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>E200</td><td></td></tr><tr><td>Contrex</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>5204</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>缓冲液和培养基用矿物盐</td><td>Fisher</td><td>Various</td><td>多家供应商提供这些试剂</td></tr></tbody></table>

分离具有降解农业用可生物降解塑料地膜潜力的天然土壤微生物

Isolation of Native Soil Microorganisms with Potential for Breaking Down Biodegradable Plastic Mulch Films Used in Agriculture

从农业土壤中分离出能够定殖市售可生物降解地膜（BDM）薄膜的本土真菌，并评估其降解塑料的潜力。通常情况下，当塑料的配方已知且原料来源可获得时，可将粉末状塑料悬浮于基于琼脂的培养基中，通过观察透明圈的形成来判断降解情况。然而，该方法难以真实模拟BDM在原位（in situ）条件下的降解过程。首先，BDM在土壤基质中并非以微小颗粒形式分散存在；其次，市售BDM并非纯聚合物，而是含有添加剂（例如 填料、增塑剂和染料）的薄膜，这些成分可能影响微生物的生长。本文所述方法用于从埋入土壤后的地膜薄膜中获得的微生物分离物。从挖出的BDM上获得的真菌分离物被单独测试，将其接种于新的、经消毒的BDM碎片上，这些碎片置于仅以琼脂为碳源的限定培养基表面，观察其生长情况。能够在BDM上生长的分离物进一步在液体培养基中进行测试，其中BDM为唯一添加的碳源。经过约十周后，通过扫描电子显微镜评估真菌的定殖情况及BDM的降解程度。分离物通过核糖体RNA基因序列分析进行鉴定。本报告描述了真菌分离的方法，但通过更换适用于细菌的培养基，同样可用于细菌的分离。本研究方法将有助于针对完整塑料薄膜或产品降解的研究，尤其适用于塑料原料未知或无法获得的情况。然而，本方法不能提供一种定量比较BDM降解速率的手段。

在最近的一项研究中24，将三种市售标称为“可生物降解”的生物降解地膜（BDM）各设置四个重复，另加一种实验性薄膜和一种传统塑料对照，在2010年春季分别铺设于华盛顿州芒特弗农、田纳西州诺克斯维尔和德克萨斯州拉伯克的番茄种植田中作为覆盖地膜。2010年秋季，从四个重复小区中采集经户外老化后的BDM膜片样本，并从膜片下方原覆盖区域正下方采集原位土壤。每个老化的BDM膜片按步骤1所述方法，夹在尼龙网袋内的土壤中。同时设置仅含土壤的对照处理。将网袋埋入先前覆盖地膜的相同小区和行间，覆土7.5 cm，并原地放置至七个月后2011年春季耕作时取出。随后用铲子将网袋从田间取出，装入自封袋塑料袋中，并使用冰袋冷藏运输，确保次日送达实验室。
本文报告了我们研究中的代表性结果。在所有三个地点，每种生物降解地膜（BDM）中均分离出天然土壤真菌，共获得54个菌株。我们描述了在其中一个地点（Mount Vernon）使用的两种商用产品中分离得到的菌株。其中一种产品为名为BioAgri的可生物降解塑料。这种黑色薄膜标注为“基于淀粉”（BioAgri，Pa...

市面上有标称为“可生物降解”的塑料薄膜，可用于农业覆盖地膜。耕作是一种具有吸引力的处置方式，但此类薄膜在田间条件下的降解过程尚不明确。本研究的目的是建立从田间掩埋后的塑料地膜上分离定殖的本土土壤真菌和细菌的方法。

从农业土壤中分离出能够定殖市售可生物降解地膜（BDM）薄膜的本土真菌，并对其降解潜力进行了评估……

以下实验的总体目标是分离出定殖并降解可生物降解地膜的土壤真菌和细菌。首先将可生物降解地膜装入网袋并在土壤中孵育足够长的时间，以允许本土土壤微生物大量定殖。孵育结束后，提取地膜并进行梯度稀释涂布，从而获得每种可培养且与地膜密切相关的微生物的单菌落。然后将分离得到的微生物接种到新的表面、未受污染的可降解覆盖材料上，以及含有或不含碳源的琼脂平板上。为比较生长情况，还需在液体培养基中进行验证。结果表明，某些分离菌株可通过扫描电子显微镜观察到定殖和/或降解现象，并可通过凝胶渗透色谱法进行验证。请注意，处理未知的真菌和细菌分离物可能存在风险，在进行本实验操作时应始终采取预防措施，例如佩戴手套、密封培养管和培养皿，并在生物安全柜中操作。根据文本方案将覆盖物碎片在土壤中孵育并制备培养基和试剂后，将新的覆盖物碎片切成 4.25 厘米的正方形以进行去污处理。若不影响材料性质或造成降解，可通过高压灭菌法对覆盖物碎片进行灭菌；对于不可高压灭菌的覆盖物碎片（如塑料材质的碎片），则不采用高压灭菌。按照文本方案准备生物安全柜后，将覆盖物碎片成行放置于已去污染的罩内，使用洁净的灭菌镊子，从最前排开始并向后排依次操作，以避免手和手臂跨越已去污染的表面，将覆盖物碎片在紫外线下孵育两小时。翻转覆盖物碎片，使已处理的一面朝下，置于洁净区域，暴露于紫外线下，但该区域此前未与覆盖物直接接触。每面均进行两小时紫外处理后，再次从前排至后排依次操作。使用无菌镊子将覆盖物碎片从生物安全柜中取出，放入无菌干燥的带盖容器中，例如铝箔覆盖的烧杯。将其置于无菌转移罩下，避光、室温保存。采用无菌操作技术，将经紫外线消毒的覆盖物碎片放置于琼脂平板表面，先放下一个角，再轻轻使其余部分自然展开并与琼脂接触。对于非透水性薄膜，将四滴10微升熔融半固体最小培养基分别置于覆盖物碎片的四个角上，以提供水分和营养，促进疏水性塑料的初始定植。切勿触碰覆盖物碎片的表面。使用移液管尖端操作，液滴将固化成珠状。将盖好的培养皿直立放置，在室温下孵育过夜以使培养基凝固。随后将培养皿倒置（琼脂面向上），避光保存于4°C环境中。生物测定所需的所有材料现已准备完毕，可以开始从埋入土壤中的覆盖物碎片中分离潜在的降解真菌。从土壤中挖出网袋，并从网袋中取出覆盖材料碎片。使用无菌刮刀和镊子轻轻去除覆盖材料上的多余土壤，注意不要破坏附着在材料表面的土壤。将生物降解地膜（BDM）薄膜剪切成1厘米见方的小片，直至获得0.5克样品材料。每次重复取样时，取0.5克覆盖物碎片及其附着的土壤，放入含有9.5毫升PBS的25毫升培养管中。向仅含土壤的对照管或覆盖物已完全降解的样品管中加入0.5克土壤，以破坏任何生物膜并使细胞从覆盖物碎片上脱离。将试管在高速下涡旋振荡30秒，然后在水浴中超声处理10分钟，再进行一次涡旋振荡。这将获得与覆盖物碎片相关的微生物细胞的均匀悬浮液。对样

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

隔离原住民土壤微生物潜力打破生物降解塑料地膜应用于农业

从一个厌氧消化器开始，该消化器是一个密封的无氧反应器，接种了模拟废水中沉降固体的合成污泥。污泥中含有嗜中温厌氧微生物，这是一种混合微生物群落。这些微生物在中等温度下生长旺盛，并推动污泥中有机物的分解。持续搅拌污泥以维持细菌活性并促进消化。随后，将可生物降解的聚合物——即生物塑料——加入污泥中。孵育期间，水解细菌会附着在生物塑料上，并将其转化为可溶性化合物。发酵细菌随后将这些化合物转化为挥发性脂肪酸，即短链有机酸。产甲烷菌是一类产生甲烷的微生物，可利用这些酸生成甲烷气体和二氧化碳，从而形成沼气。沼气通过出口从反应器中排出，并收集到气体采样袋中。这种共消化方法能够将生物塑料和污泥高效地转化为可再生的生物燃气。...

生物塑料厌氧消化产沼气

污染影响着所有生物群落。海洋环境受到的影响尤为严重，特别是珊瑚礁，这是地球上最敏感的生态系统之一。生物修复是指生物降解污染物的能力。本文介绍了分离和检测具有生物修复能力以及潜在益生特性的珊瑚共生微生物的方法学。...

用于宏生物体研究与保护的生物修复及益生菌开发微生物菌株筛选

本文介绍了一种用于筛选土壤生物多样性中参与难降解材料降解的真菌菌株的实验方案。首先，分离能够在腐殖酸或木质纤维素上生长的真菌菌株，随后通过酶学实验以及对烃类和塑料等污染物的降解能力测试其活性。...

从土壤生物多样性中分离与筛选降解难降解材料的真菌

我们展示了微塑料和纳米塑料（分别为 MPs 和...

利用农用塑料薄膜制备微纳米塑料用于基础科学研究

本文介绍了一种从不同根际土壤中快速、标准化建立协同多物种生物膜群落的方法。该方法是一种独特的实验方案，旨在研究并模拟复杂的根际土壤微生物群落。...

从根际土壤构建多物种生物膜群落的方法

根际土壤，多物种生物膜，微生物群落，生物膜构建，土壤微生物学，微生物相互作用，体外模型，高通量筛选，微生物组工程，生物膜动态

本文介绍了一种从土壤中提取微塑料并鉴定其聚合物类型的方法。该方法在操作性、适用性和成本效益方面均经过优化，为标准化土壤中微塑料分析方法奠定了科学基础。...

农田土壤中常规微塑料的分离与鉴定

iChip 技术利用了一种廉价且简单的方法 原位 一种可提高从土壤中发现新型微生物效率的分离装置。新型微生物可用于土壤微生物组研究、天然产物发现等多种应用。...

利用iChip技术分离土壤微生物

本文描述了一种利用核磁共振波谱法测定土壤中源自聚己二酸丁二醇对苯二甲酸酯的微塑料和纳米塑料含量的方法。该技术改进了现有方法，因为它可扩展用于纳米塑料的定量分析，并且能够轻松适应大规模环境样品的处理。...

利用质子核磁共振波谱法定量土壤中基于对苯二甲酸/己二酸丁二醇酯的微纳米塑料

本方案描述了一种分离芯片（iChip）的设计与使用方法，用于 原位 在其自然环境中培养顽固性土壤微生物。同时还描述了 原位 抗微生物物质产生菌的土壤细菌培养。该方案可经调整用于从不同生态位中分离具有其他理想特性的细菌。...

原位 分离与培养难培养土壤细菌的分离芯片（iChip）方法

本视频展示了一种从14天龄拟南芥幼苗组织中分离完整原生质体的方法。由于所分离的原生质体至少可保持完整状态96小时，且来源于幼苗而非一个月大的成熟植株，因此该方法可加快需要完整原生质体的实验检测流程。...

从14天龄的Arabidopsis thaliana幼苗组织中分离原生质体

了解如何从可生物降解地膜中分离土著土壤真菌和细菌，并评估其降解能力。本方法利用网袋培养、稀释平板和液体培养基验证，为农业塑料废弃物微生物降解研究提供可靠技术方案。

分离具有降解农业用可生物降解塑料地膜潜力的天然土壤微生物

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