隔离原住民土壤微生物潜力打破生物降解塑料地膜应用于农业

以下实验的总体目标是分离定植和降解可生物降解地膜的土壤真菌和细菌。这是通过首先将可生物降解的地膜放在网袋中在土壤中孵育足够长的时间以允许本地土壤微生物大量定植来实现的。孵育后，提取覆盖物并稀释铺板，从而产生每种可培养类型的密切相关微生物的单个分离菌落。

然后将分离的微生物修补到新鲜表面、受感染、可生物降解的覆盖物以及有或没有碳源的琼脂平板上。为了比较生长情况，然后在液体介质中确认结果。结果显示基于扫描电子显微镜的某些分离物的定植和/或降解，并且可以通过凝胶渗透色谱法进行验证。

不要忘记，使用不明真菌和细菌分离物可能很危险，在执行此程序时应始终采取预防措施，例如戴手套、密封培养管和培养皿以及在生物安全柜中工作。在土壤中孵育覆盖物并根据文本方案制备培养基和试剂后，将新的覆盖物切成 4.25 厘米的正方形以净化覆盖物。如果它不会改变或降低不可高压灭菌的覆盖物（例如由塑料制成的覆盖物）的降解，请对它们进行高压灭菌。

根据文本方案准备生物安全柜后，将覆盖物成排放入净化罩中，并在紫外线下孵育覆盖物两个小时，使用干净消毒的镊子从前排开始，向后工作，以避免将手和手臂放在新净化的表面上。翻转覆盖物片，将受感染的一面朝下放在干净的区域，暴露在紫外线下，但之前不要与覆盖物接触。经过每侧两个小时的紫外线处理后，再次从前到后工作。

使用无菌镊子从生物安全柜中取出覆盖物，并将其放入无菌干燥的有盖容器中，例如铝箔覆盖的烧杯。将它们存放在室温下，在无菌转移罩下避光。使用无菌技术，将受紫外线感染的覆盖物片放在琼脂平板的表面，先轻轻地放下一角，让方块的其余部分与琼脂接触。

对于非透水薄膜，在覆盖物片的角落顶部放置四滴 10 微升的熔融半固体最小培养基，为疏水性塑料的初始定植提供水和营养来源。不要触摸覆盖物的表面。使用移液器吸头时，液滴会硬化成珠子。

将带盖的板在室温下直立孵育过夜以凝固。然后将平板琼脂面朝上存放在 4 摄氏度的黑暗中。生物测定所需的所有材料现已准备好，您可以开始从埋在土壤中的覆盖物碎片中分离潜在的覆盖物降解真菌。

从土壤中挖出网袋，并从网袋中取出覆盖物。使用无菌抹刀和镊子轻轻去除覆盖物上多余的土壤，而不会干扰附着在表面的土壤。将 BDM 胶片切成 1 厘米见方的块，直到回收 0.5 克材料。

对于每个重复样品转移，将 0.5 克覆盖物块和附着的土壤放入 25 毫升中。含有 9.5 毫升 PBS 的培养管将 0.5 克土壤添加到仅对照管或覆盖物完全降解的样品中，以打破任何生物膜并将细胞从覆盖物碎片中分离。高速涡旋试管 30 秒，然后在水浴中超声处理 10 分钟，然后再次涡旋。

这应该会产生与覆盖物块相关的微生物细胞的均匀悬浮液。用于样品的连续稀释。用 4.5 毫升无菌 PBS 制备一个培养管，并从原始悬浮管中为每个样品用 450 微升 PBS 填充深孔板的三个孔。

将 0.5 毫升转移到 4.5 毫升无菌 PBS 中，获得 5.0 倍 10 至负三分之一稀释液，高速涡旋 30 秒后，在 96 孔板混合物中加入 50 微升至 450 微升 PBS，轻轻上下移液 10 次，重复 10 次，直到稀释至 5.0 倍 10 至负 6 完成。使用火焰灭菌的弯曲玻璃棒将每个稀释液中的 100 微升均匀分布在含有氯霉素的 PDA 板的琼脂表面，以抑制细菌生长。将板直立存放 30 分钟，让液体浸入。

然后用多聚体密封板，以避免孢子从未鉴定的分离株中逸出。将倒置板在 20 摄氏度下在黑暗中孵育 5 天，以允许快速和缓慢生长的真菌在生物安全柜中形成菌落。使用单个无菌牙签检查稀释板中是否有单个分离的菌落。

轻轻触摸菌落，然后依次触摸真菌基本培养基、真菌基本培养基加塑料和葡萄糖基本培养基板的琼脂，以将琼脂珠接种在塑料薄膜上。用牙签在琼脂点的表面轻轻摩擦，然后在塑料薄膜上滑动。重复接种来自同一源菌落的细胞，直到有四个。

将板在 20 摄氏度下在黑暗中孵育 5 天后，在每个板上复制条纹。比较板以识别在覆盖物上生长的分离物，而不是在除琼脂外不添加碳的最小培养基上生长。这些是潜在的覆盖物降解剂。

GMM 板应包含最多的生长物，因为它是阳性对照板，其中培养基含有葡萄糖。此时土壤分离物可能不完全纯净，因此请使用无菌牙签从真菌中刮下接种物，定植覆盖物并将其划线以分离到马铃薯葡萄糖琼脂上，然后密封板并孵育五天。孵育 5 天后，将出现单个孤立的菌落。

确认这些新纯化的菌落在平板生物测定中显示出覆盖物定植，类似于在原始可能不纯分离株中观察到的覆盖物定植。一旦通过平板生物测定确定了潜在的覆盖降解剂，在最终确认测定中使用液体生物测定进行验证，甚至覆盖下也缺乏琼脂。在这种严格制备的培养基中，碎片确实是微生物生长的唯一碳源，从表面受感染的覆盖物开始测定到真菌培养基，对于每个微生物分离物的重复，缺乏任何其他添加碳。

准备三管进行接种。一个，一个实验管，里面有 5 毫升最低培养基，这里标记为 FMM，其中包含预定大小的覆盖物块。二，阴性对照，含 5 毫升无碳源的最低培养基。

三，阳性对照，含 5 毫升葡萄糖液体。这里标记为 GMM。此外，准备一个包含每个待测覆盖物的最小培养基的复制管，但不要接种。

该对照管将在生长和收集新鲜孢子后揭示因污染而导致的任何微生物生长。根据文本方案，在无菌转移罩中，用一百万个孢子或酵母细胞接种先前制备的培养管，密封瓶盖并在黑暗中孵育，不要在 20 摄氏度下摇晃。每周观察样品的生长情况。

接种后的第一周内，可以看到覆盖物块上真菌的菌丝生长，尤其是在覆盖物块的边缘，浮游酵母通过 600 纳米的光密度读数监测生长，因为丝状真菌可能会直接附着在覆盖物上。通过眼睛评估生长情况，并在仅最小培养基对照中通过光学显微镜和/或扫描电子显微镜进行确认。寻找太小而无法记录光密度变化的微小白色弯曲。

使用光谱光度法。使用粘贴移液器吸出弯曲并使用差分干涉观察它们。在平板生物测定中从称为 Weed Guard plus 的纤维素覆盖物（我们的阳性对照）和称为 Biore 的淀粉基塑料覆盖物中分离出三种潜在的覆盖物降解分离物后，对比显微镜检查。

它们在液体生物测定中孵育 68 天，并在进行扫描电子显微镜检查之前收获。不出所料。除 XX 和 YY 外，所有样品均观察到真菌 hyphy，其中在我们的纤维素对照覆盖物上观察到分离物的杆状细胞。

在 FMM 中未观察到生长，仅在 FMM 对照中观察到生长，如此处所示，在联合国接种的杂草防护剂和覆盖物的对照中，植物来源纤维的残留气管元素只能检测到一些纤维上成行可见的轻微麻点标记，尽管在我们的纤维素对照覆盖物的所有三个接种样品中都观察到真菌 hyphy。仅在 SS 样品中清晰可见气管元件，这表明纤维素材料的消化显示分离物 SS 下方的木质化气管元件是使用 18 s 核糖体初步鉴定的，DNA 为淀粉基塑料覆盖物的苏打水。分离株 在最小培养基中未观察到显著生长，仅对照在分离株培养管中旋转时可见单一白色规格，使用微分干涉对比显微镜观察分离株 vv 的 VV 和 ZZ。

规格是一个孢子团，可能是最初接种时残留的。对于 isolate zz.肿块由直径约 0.2 毫米的松散 hyphy 网组成，表明原始孢子接种物已经发芽，但尚未长出此处所示的肿块。

正如在联合国接种的淀粉基塑料覆盖物的对照中所看到的，观察到凹凸不平的质地。白色特征的身份尚不清楚，但在此处显示的由孤立 VV 定植的电影中不存在它们。白色颗粒和凸起在被分离 zz 定植的薄膜中都消失了。

此外，后一个样本显示 BDM 表面分离株上均匀出现裂缝。使用 at s 核糖体 DNA 分别作为青霉菌和 ACE 在次序内初步鉴定 VV 和 ZZ。虽然这种方法可以提供有关农业塑料覆盖物生物降解的见解，但它也可以应用于在环境中存在生物降解问题的任何其他塑料。

例如，可能最终进入海洋环境的塑料。这些用于食品工业吗？我。