一种小鼠胰岛分离及细胞内cAMP测定方法

本实验的总体目标是分离健康的胰岛，以检测在不同实验处理条件下环磷酸腺苷（cyclic AMP）生成量的差异。该过程首先通过充盈胰腺，然后在第二步中将其取出。通过一系列离心和洗涤步骤，最终分离出健康的胰岛。

接下来，将存活的眼状结构转移至新鲜的胰岛培养基中，并在其中孵育过夜。最后一步中，将这些眼状结构暴露于所需的实验处理条件下，并进行环磷酸腺苷（cAMP）检测。最终，通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测眼状结构在不同处理条件下环磷酸腺苷（cAMP）生成水平的变化。

通常，初学者会遇到困难，因为要实现胰腺的充分膨胀需要大量练习。首先，用五毫升胶原酶溶液预装一支注射器和导管。将一根钝化的30号针头连接到导管上，并将装有导管的注射器置于冰上。

将小肠移至小鼠右侧后，找到od括约肌，该括约肌位于胆总管末端，并展开延伸至小肠，形成一个白色三角形。一旦定位到该括约肌，取一把5号杜蒙镊子，将镊尖尽可能靠近小肠处轻轻滑入胆总管下方，注意不要刺穿胆管。

穿过小肠和结缔组织后，用杜蒙镊的尖端夹住缝线，将其拉至胆总管下方。尽可能靠近奥狄括约肌结扎胆总管，确保打结紧实以防止渗漏。接着，抓住缝线的两端，将其向尾侧拉动，使胆总管受到一定张力。

然后用非持物手，用显微剪刀在肝叶分叉前的最后一段胆总管上做一小切口，同时用手拉紧两端的结扎线以使胆总管绷紧。从冰桶中取出注射器和套管。将注射器放置一旁，将预先准备好的钝化30号针头插入切口处。

胆总管。注意不要刺穿胆管壁。获得完整的胰腺膨胀是最困难的部分。

我们使用一根能够形成良好密封的针头。如果第一根针头无法形成良好密封，则换用更大的针头，例如27号针头。现在缓慢下压注射器的推杆，以脉冲方式逐渐释放压力，直至胰腺的首段开始膨胀。

随后施加轻柔而持续的压力，直至胰腺不再膨胀。成功的灌注应使外分泌组织均匀分布，且位于胃上方的胰腺部分应已充盈膨胀。切除胰腺时，用一只手持镊子夹住od括约肌处的小肠。

用另一只手将弯头剪刀的闭合尖端插入，以分离部分胰腺与小肠。将尖端沿小肠向下移动至粉红色结缔组织处。然后夹住靠近小肠与胃连接处的小肠部位，将胰腺从小肠其余部分剪下。

尽可能多地抓取胰腺并轻轻提起。使用弯剪，剪除胰腺与胸腔之间的剩余连接组织。

为完全去除胰腺，将每份取出的胰腺分别置于约2.5毫升胶原酶溶液中，并存放在冰上的单个50毫升锥形管内以清洗胰腺。首先，将每份胰腺转移至含有25毫升胶原酶的新50毫升锥形管中。

然后将胰腺放入含有50毫升锥形管的容器中，直立置于37摄氏度的摇动水浴箱内，水浴箱应能够以220至250转/分钟的振荡速度运行，但此时摇床应关闭。现在对每个50毫升锥形管通入95%氧气和5%二氧化碳混合气体，持续5分钟。

使用移液管将每个试管盖紧，并将其水平放置于水浴摇床中，试管需位于水面以下。从第6分钟开始，每隔一分钟摇动试管一次，每次在220至250转/分钟的条件下摇动20秒，持续至最多16分钟。摇动结束后，立即在室温下以400至500 ×g离心，离心机达到最高速度后立即关闭。

接下来，在不扰动沉淀物的情况下，使用真空抽滤装置从每根试管中吸除约 22.5 毫升胶原酶溶液。然后将沉淀物重悬于 12.5 毫升 HBSS 中，并轻轻涡旋振荡试管以充分分散沉淀。在洗涤细胞并加入更多 HBSS 涡旋混匀后，将每份细胞悬液通过 1000 微米滤网，收集至新的 50 毫升锥形管中。

再次离心细胞悬液后，使用真空抽滤装置小心吸除所有HBSS，注意不要扰动沉淀。待HBSS完全去除后，向每支试管中加入4.8毫升25%F细胞溶液。涡旋振荡以充分分散沉淀，然后沿50毫升锥形管管壁缓慢加入2.4毫升23%20.5%和11%的Fial溶液，同时旋转锥形管。

为确保在离心FI细胞悬液后形成均匀的分层，将全部FI细胞悬液转移至一个新的50毫升锥形管中，注意留下外分泌组织的沉淀。向新管中加入冰冻HBSS，直至液面达到50毫升刻度线。然后盖紧管盖，轻轻倒置管子4至6次。

将FI悬液与HBSS混合。使用真空抽滤装置小心吸除大部分HBSS与FI的混合液，注意不要扰动松散的沉淀物。然后将沉淀转移至新离心管中。

使用移液管将眼状结构转移到含有眼状结构培养基的培养皿中，注意避免转移ASIN艺术组织碎片。将培养皿置于带有背光的解剖显微镜上。

健康的外植体应呈球形，中心为金棕色至深棕色。与ASIN或组织相连、外观暗淡且呈灰色的外植体不应使用，应予以丢弃。此外，经过过夜培养后出现深色坏死中心的较大外植体也应丢弃，因其功能不正常。

如果眼状体样本中含有大量碎片，需将眼状体手动挑选两次至新鲜培养基中，并在消化缓冲液中加入DNA，以减少眼状体聚集。开始此步骤时，先轻轻晃动培养皿，使眼状体集中至培养皿中央。使用P20移液器将眼状体转移至一个新的直径15毫米、长60毫米的聚苯乙烯培养皿中，该培养皿内含有5毫升预孵育溶液，用于洗去眼状体上含葡萄糖的培养基。

然后使用P20移液器将至少13个肠段转移至含有1毫升新鲜充气的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液的各个微量离心管中，保持各管之间肠段大小的一致性。将样品在37摄氏度、5% CO₂条件下孵育45分钟后，迅速涡旋混匀，并在室温下将离心管放入台式离心机，以7,000至7,500 ×g离心。如果下游应用需要检测胰岛素或其他代谢物，可使用P1000移液器吸取部分培养基至微量离心管中保存。若无需收集刺激后的培养基，则可将其弃去。

使用 P 1000 移液器吸出每个微量离心管中的大部分 Krebs 液，使眼状结构沉淀上残留约 10 至 15 微升 Krebs 液。然后使用 P 20 移液器吸除靠近沉淀的剩余液体。最后，当残留的 Krebs 液少于 10 至 15 微升时，将眼状结构沉淀在液氮中进行速冻。

然后将速冻的沉淀物在零下80摄氏度保存，直至检测环磷酸腺苷（cyclic AMP）。通常情况下，某种试剂对环磷酸腺苷生成的影响与其对胰岛素分泌的影响直接相关。在本实验中，采用11.1毫摩尔葡萄糖刺激来自野生型或基因敲除小鼠的分离眼状体（eyelets），并检测细胞内环磷酸腺苷。

环磷酸腺苷（cAMP）的生成量通过总细胞蛋白进行归一化测定。分泌的胰岛素采用标准胰岛素ELISA法检测，并同样以总细胞蛋白进行归一化。正如预期，环磷酸腺苷生成量的变化与葡萄糖刺激的胰岛素分泌增强呈直接相关。

观看本视频后，您应能够分离、培养并测定健康小鼠眼球中环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的水平。