Name: 对小鼠胰腺胰岛分离和细胞内cAMP的测定方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: 学习小鼠胰岛分离与细胞内cAMP测定方法，用于糖尿病研究中评估β细胞功能。该方案通过酶免疫分析法测量环磷酸腺苷水平，为理解胰岛生理机制及开发潜在治疗方法提供重要实验基础。

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我们感谢Renee L. Pasker和Harpreet K. Brar在本研究所述实验方案中提供的专业技术支持。此外，我们感谢杜克大学Christopher B. Newgard和威斯康星大学麦迪逊分校Alan D. Attie的指导，以及他们实验室成员的支持，这些支持为我们优化所述实验方案提供了必要的时间与资源。特别感谢Newgard实验室的Hans Hohmeier、Danhong Lu和Helena Winfield，以及Attie实验室的Mary Rabaglia，他们在讨论中提供了富有成效的建议与指导。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金DK080845和青少年糖尿病研究基金会594的资助。 
研究基金会资助 17-2011-608（授予 M.E.K.）

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作者无任何利益冲突需要披露。

随着糖尿病患病率预计将达到全球人口的7.7%，开发新型研究技术对于深入理解与有效治疗糖尿病至关重要18目前的胰岛分离是一种广泛应用且成熟的方案，用于 体外 实验已在此前略有修改的情况下进行过并已展示11,14,16尽管胰岛素分泌是分离胰岛的常见下游应用，但关注上游组分（如cAMP）可能有助于阐明增强胰岛素生成和分泌的机制。
安乐死方法的选择必须慎重考虑，以确保实验动物的人道待遇以及实验测量结果的完整性。对于胰岛分离，我们首选在麻醉状态下放血致死作为安乐死方法，因为该方法可在胰腺膨胀前使胰岛持续接受含氧血液灌注，时间最长。CO2 吸入法是一种较差的安乐死选择，因为按照人道操作规程进行时，会使胰岛暴露于缺氧血液中至少5-6分钟&#160;在开始操作前。在没有麻醉的情况下进行颈椎脱位，若有科学依据支持，可能是一种可接受的方法，但操作者必须对该安乐死方法以及小鼠解剖和胰腺灌注技术具有丰富经验，以确保人道处死并维持胰岛功能。本方案中选择在麻醉下进行放血处死，首选麻醉剂为 Avertin。选择 Avertin ...

严格维持正常血糖水平对于预防神经病变、肾病和视网膜病变等并发症至关重要，这些并发症均为1型和2型糖尿病病理过程的典型特征1。在1型和2型糖尿病中，β细胞功能下降及细胞数量减少均会扰乱血糖浓度2。1型糖尿病由免疫介导，其特征是胰岛素分泌β细胞遭到严重破坏；而2型糖尿病则表现为β细胞胰岛素分泌受损以及外周胰岛素信号传导障碍，二者共同导致高血糖、脂质代谢紊乱以及肝脏葡萄糖生成增加，最终引起β细胞总量减少以及单个β细胞胰岛素分泌能力下降3。深入理解1型和2型糖尿病进展过程中β细胞的内在机制，有望为开发预防和治疗这些疾病的新疗法提供依据。
体外 组织培养模型，例如永生化β细胞系INS-1和MIN6，可作为研究特定β细胞功能的有用工具。然而，胰岛内不同细胞类型之间的相互作用本身可能调控β细胞功能。例如，α细胞分泌的胰高血糖素可促进胰岛素分泌，而δ细胞分泌的生长抑素则抑制胰岛素分泌，这种旁分泌效应表明细胞间的空间邻近性在内分泌反应中的重要性。4此外，β细胞之间的间隙连接可增强胰岛素的释放5此外，尽管在构建能更准确地模拟分离胰岛对葡萄糖生理反应的胰岛素瘤细胞系方面已取得进展（例如，源自INS-1的832/13和832/3细胞系），它们对葡萄糖的响应性仍不同于正常大鼠胰岛6,7此外，这些克隆性胰岛素瘤细胞系对胰高血糖素样肽-1（GLP-1）激动剂的反应彼此之间可能存在显著差异，且与正常胰岛的反应也大不相同。6因此，永生化细胞系可能并非用于检测影响cAMP生成物质的最佳模型。
与胰岛素瘤来源的细胞系不同，仅在整体动物模型中研究β细胞功能也存在一系列复杂问题。使用内分泌组织时最大的挑战之一是精确测量所释放激素的浓度。具体而言，肝脏在胰岛素代谢中起主要作用，而胰腺的血流直接进入肝脏。因此，血浆胰岛素水平的测量可能无法准确反映胰腺本身分泌的胰岛素量，或不同处理对胰岛素分泌速率的影响8。此外，胰高血糖素的肾脏代谢可能限制了胰岛α细胞胰高血糖素输出的可靠性9。因此，分离原代小鼠胰岛进行体外（in vitro）实验，可更精确地理解胰岛对特定刺激的反应，从而补充体内（in vivo）所获得的测量结果。
目前用于分离小鼠胰岛的方案是一种已被多个研究团队广泛采用的成熟方法（可通过一些细微改进进一步提高成功率）10,11。此外，通过检测cAMP的生成水平，可直接评估β细胞对肠促胰岛素的反应性。结合cAMP测定，还可从同一批cAMP样品中定量分析蛋白质含量和胰岛素分泌水平，有助于判断β细胞功能缺陷位于cAMP通路的上游还是下游10。本方案中最终的cAMP含量测定与胰岛素分泌检测应用，是研究药物成分、膳食成分等因素对cAMP及胰岛素分泌影响的有力工具。除仅由葡萄糖刺激外，还可使用其他化合物来检测cAMP和胰岛素分泌的变化10,11。
最后，尽管胰岛素是我们从分离的胰岛中检测的主要激素，但也可通过瞬时刺激实验或定量培养基中的含量，检测其他激素（如胰高血糖素和生长抑素）以及细胞因子、二十碳衍生物和环磷酸腺苷等物质12。此外，尽管超出本文范围，采用所述的胶原酶分离法进行胰岛分离可有效保存胰岛，从而支持多种下游应用，包括胰岛移植、RNA提取用于定量实时PCR或微阵列分析、蛋白质提取用于Western blot检测、胰岛包埋与免疫荧光成像，以及通过[3H]-胸腺嘧啶掺入法评估胰岛细胞增殖，其中部分方法已在先前的JoVE文章中有所描述13-16。总体而言，遵循本方案中所述的胰岛分离流程，可为研究人员提供重要且有价值的信息，助力开发治疗手段并推动以增强β细胞功能为目标的药物发现。

<table><tbody><tr><td>胶原酶来自 &lt;em&gt;Clostridium histolyticum&lt;/em&gt; 适用于分离活性胰岛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9378</td><td></td></tr><tr><td>Hanks平衡盐溶液 10X</td><td>英杰（吉比科）</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640（粉末）</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7888</td><td></td></tr><tr><td>3/0 丝线缝合线</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>0.8 mm 镊子&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>弯头剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-10</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-T&amp;uuml;宾根弹簧剪 - 直头/锐利/8.5 cm/5 mm 刃口</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>5 ml BD Luer-Lok 注射器</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>1 ml BD 注射器</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>30 G BD 针头 1/2&quot; 长度</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>27 G BD 针头 1/2&quot; 长度</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>磨刀石</td><td>Fine Science Tools</td><td>29008-01</td><td></td></tr><tr><td>2-2-2-三溴乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基-2-丁醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240486-100mL</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（KH₂PO₄）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠（NaHCO₃）&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9397</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>英杰（吉伯科）</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清（H.I. FBS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30088.03HI</td><td></td></tr><tr><td>3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5879-100MG</td><td></td></tr></tbody></table>

一种小鼠胰岛分离及细胞内camp测定方法

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

血糖水平失控是糖尿病的典型特征，可导致神经病变、肾病和视网膜病变等并发症。随着免疫介导的1型糖尿病和与肥胖相关的2型糖尿病患病率不断上升，旨在阐明糖尿病病理生理机制及治疗作用机制的研究变得至关重要。胰岛β细胞负责在血糖浓度升高时适当分泌胰岛素。除了葡萄糖和其他营养物质外，β细胞还可受到特定激素——即肠促胰岛素（incretins）的刺激；这类激素在进食后由肠道分泌，并作用于β细胞表面的受体，从而增加细胞内环磷酸腺苷（cAMP）的生成。β细胞功能下降、细胞数量减少以及对肠促胰岛素反应性降低已被充分证实参与2型糖尿病的病理生理过程，且与1型糖尿病的关联也日益受到关注。本小鼠胰岛分离及cAMP测定方案可作为研究疾病进展机制和治疗干预手段的工具，尤其适用于探索通过调节细胞内cAMP生成而发挥作用的肠促胰岛素受体或相关受体介导的机制。尽管本文仅描述cAMP的测定方法，但所介绍的胰岛分离方案可获得高纯度的胰岛样本，亦可用于多种下游应用，包括葡萄糖刺激的胰岛素分泌、[3H]-胸腺嘧啶掺入、蛋白质丰度检测以及mRNA表达分析。

为了在分离过程中获得较高的胰岛产量，应严格遵循本方案中所述的手术技术。尽管此处介绍的技术需根据每个实验室的具体情况进行调整，但仍有一些关键步骤可确保分离成功。为了便于暴露胆总管，建议将小鼠的器官移至右侧（图1）。此外，这样做可减少限制胰腺膨胀的重量，从而使胰腺以较小的阻力充分膨胀。另一个提高胰岛产量的关键步骤是在靠近奥迪括约肌处结扎胆总管（图2A-C）。若结扎位置距离奥迪括约肌过远，可能导致胰腺主导管进入的胶原酶溶液量减少，从而造成胰腺部分膨胀。同时，应打紧结，以防止胶原酶溶液流入肠道。
在胆总管上做切口时，应距离肝脏分叉处足够远，但又要足够近，以实现胰腺的最大程度膨胀（图3）。若切口过于靠近分叉处，胶原酶溶液可能流入肝脏。当胶原酶溶液进入肝脏时，肝脏会失去深红色，开始变为灰白色。若出现此情况，应拔出针头，并尝试在距离肝脏更远处重新进行插管。此外，胆总管的切口应仅穿透管壁一半左右（约50%）。若将管壁完全剪断，将难以在针尖周围封闭胆管。恰当的切口可使胆管在针头周围完全闭合，从而产生...

检测 体外 利用分离的小鼠胰岛研究β细胞功能是糖尿病病理生理学和治疗学研究的重要组成部分。尽管许多&#160;下游应用可选，本方案特别描述了细胞内环磷酸腺苷（cAMP）的测定，作为决定β细胞功能的关键参数。

一种小鼠胰岛分离及细胞内cAMP测定方法

血糖失控是糖尿病的典型特征，可导致神经病变、肾病和视网膜病变等并发症。随着……

本实验的总体目标是分离健康的胰岛，以检测在不同实验处理条件下环磷酸腺苷（cyclic AMP）生成量的差异。该过程首先通过充盈胰腺，然后在第二步中将其取出。通过一系列离心和洗涤步骤，最终分离出健康的胰岛。接下来，将存活的眼状结构转移至新鲜的胰岛培养基中，并在其中孵育过夜。最后一步中，将这些眼状结构暴露于所需的实验处理条件下，并进行环磷酸腺苷（cAMP）检测。最终，通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测眼状结构在不同处理条件下环磷酸腺苷（cAMP）生成水平的变化。通常，初学者会遇到困难，因为要实现胰腺的充分膨胀需要大量练习。首先，用五毫升胶原酶溶液预装一支注射器和导管。将一根钝化的30号针头连接到导管上，并将装有导管的注射器置于冰上。将小肠移至小鼠右侧后，找到od括约肌，该括约肌位于胆总管末端，并展开延伸至小肠，形成一个白色三角形。一旦定位到该括约肌，取一把5号杜蒙镊子，将镊尖尽可能靠近小肠处轻轻滑入胆总管下方，注意不要刺穿胆管。穿过小肠和结缔组织后，用杜蒙镊的尖端夹住缝线，将其拉至胆总管下方。尽可能靠近奥狄括约肌结扎胆总管，确保打结紧实以防止渗漏。接着，抓住缝线的两端，将其向尾侧拉动，使胆总管受到一定张力。然后用非持物手，用显微剪刀在肝叶分叉前的最后一段胆总管上做一小切口，同时用手拉紧两端的结扎线以使胆总管绷紧。从冰桶中取出注射器和套管。将注射器放置一旁，将预先准备好的钝化30号针头插入切口处。胆总管。注意不要刺穿胆管壁。获得完整的胰腺膨胀是最困难的部分。我们使用一根能够形成良好密封的针头。如果第一根针头无法形成良好密封，则换用更大的针头，例如27号针头。现在缓慢下压注射器的推杆，以脉冲方式逐渐释放压力，直至胰腺的首段开始膨胀。随后施加轻柔而持续的压力，直至胰腺不再膨胀。成功的灌注应使外分泌组织均匀分布，且位于胃上方的胰腺部分应已充盈膨胀。切除胰腺时，用一只手持镊子夹住od括约肌处的小肠。用另一只手将弯头剪刀的闭合尖端插入，以分离部分胰腺与小肠。将尖端沿小肠向下移动至粉红色结缔组织处。然后夹住靠近小肠与胃连接处的小肠部位，将胰腺从小肠其余部分剪下。尽可能多地抓取胰腺并轻轻提起。使用弯剪，剪除胰腺与胸腔之间的剩余连接组织。为完全去除胰腺，将每份取出的胰腺分别置于约2.5毫升胶原酶溶液中，并存放在冰上的单个50毫升锥形管内以清洗胰腺。首先，将每份胰腺转移至含有25毫升胶原酶的新50毫升锥形管中。然后将胰腺放入含有50毫升锥形管的容器中，直立置于37摄氏度的摇动水浴箱内，水浴箱应能够以220至250转/分钟的振荡速度运行，但此时摇床应关闭。现在对每个50毫升锥形管通入95%氧气和5%二氧化碳混合气体，持续5分钟。使用移液管将每个试管盖紧，并将其水平放置于水浴摇床中，试管需位于水面以下。从第6分钟开始，每隔一分钟摇动试管一次，每次在220至250转/分钟的条件下摇动20秒，持续至最多16分钟。摇动结束后，立即在室温下以400至500 ×g离心，离心机达到最高速度后立即关闭。接下来，在不扰动沉淀物的情况下，使用真空抽滤装置从每根试管中吸除约 22.5 毫升胶原酶溶液。然后将沉淀物重悬于 12.5 毫升 HBSS 中，并轻轻涡旋振荡试管以充分分散沉淀。在洗涤细胞并加入更多 HBSS 涡旋混匀后，将每份细胞悬液通过 1000 微米滤网，收集至新的 50 毫升锥形管中。再次离心细胞悬液后，使用真空抽滤装置小心吸除所有HBSS，注意不要扰动沉淀。待HBSS完全去除后，向每支试管中加入4.8毫升25%F细胞溶液。涡旋振荡以充分分散沉淀，然后沿50毫升锥形管管壁缓慢加入2.4毫升23%20.5%和11%的Fial溶液，同时旋转锥形管。为确保在离心FI细胞悬液后形成均匀的分层，将全部FI细胞悬液转移至一个新的50毫升锥形管中，注意留下外分泌组织的沉淀。向新管中加入冰冻HBSS，直至液面达到50毫升刻度线。然后盖紧管盖，轻轻倒置管子4至6次。将FI悬液与HBSS混合。使用真空抽滤装置小心吸除大部分HBSS与FI的混合液，注意不要扰动松散的沉淀物。然后将沉淀转移至新离心管中。使用移液管将眼状结构转移到含有眼状结构培养基的培养皿中，注意避免转移ASIN艺术组织碎片。将培养皿置于带有背光的解剖显微镜上。健康的外植体应呈球形，中心为金棕色至深棕色。与ASIN或组织相连、外观暗淡且呈灰色的外植体不应使用，应予以丢弃。此外，经过过夜培养后出现深色坏死中心的较大外植体也应丢弃，因其功能不正常。如果眼状体样本中含有大量碎片，需将眼状体手动挑选两次至新鲜培养基中，并在消化缓冲液中加入DNA，以减少眼状体聚集。开始此步骤时，先轻轻晃动培养皿，使眼状体集中至培养皿中央。使用P20移液器将眼状体转移至一个新的直径15毫米、长60毫米的聚苯乙烯培养皿中，该培养皿内含有5毫升预孵育溶液，用于洗去眼状体上含葡萄糖的培养基。然后使用P20移液器将至少13个肠段转移至含有1毫升新鲜充气的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液的各个微量离心管中，保持各管之间肠段大小的一致性。将样品在37摄氏度、5% CO₂条件下孵育45分钟后，迅速涡旋混匀，并在室温下将离心管放入台式离心机，以7,000至7,500 ×g离心。如果下游应用需要检测胰岛素或其他代谢物，可使用P1000移液器吸取部分培养基至微量离心管中保存。若无需收集刺激后的培养基，则可将其弃去。使用 P 1000 移液器吸出每个微量离心管中的大部分 Krebs 液，使眼状结构沉淀上残留约 10 至 15 微升 Krebs 液。然后使用 P 20 移液器吸除靠近沉淀的剩余液体。最后，当残留的 Krebs 液少于 10 至 15 微升时，将眼状结构沉淀在液氮中进行速冻。然后将速冻的沉淀物在零下80摄氏度保存，直至检测环磷酸腺苷（cyclic AMP）。通常情况下，某种试剂对环磷酸腺苷生成的影响与其对胰岛素分泌的影响直接相关。在本实验中，采用11.1毫摩尔葡萄糖刺激来自野生型或基因敲除小鼠的分离眼状体（eyelets），并检测细胞内环磷酸腺苷。环磷酸腺苷（cAMP）的生成量通过总细胞蛋白进行归一化测定。分泌的胰岛素采用标准胰岛素ELISA法检测，并同样以总细胞蛋白进行归一化。正如预期，环磷酸腺苷生成量的变化与葡萄糖刺激的胰岛素分泌增强呈直接相关。观看本视频后，您应能够分离、培养并测定健康小鼠眼球中环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的水平。

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对小鼠胰腺胰岛分离和细胞内cAMP的测定方法

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一种小鼠胰岛分离及细胞内cAMP测定方法

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