多光谱定量分析继荧光组织移植的细胞起源，类型和相互作用的可视化
2013年9月22日
复合组织群众，从机关到肿瘤，是由各种细胞成分的。我们阐明了利用多标记的荧光转基因小鼠与多参数免疫荧光染色结合组织随后光谱分离破译细胞起源以及基于蛋白表达细胞特征的细胞内表型的贡献。
以下程序的目标是使用多重细胞组成或模拟物的多光谱询问来确定各种骨髓常驻群体对肿瘤基质发展的贡献。这是通过首先移植带有表达 RFP 的骨髓干细胞的转基因 GFP 标记的受体小鼠来实现的。在第二步中，将感兴趣的肿瘤细胞注射到同一受体中，然后在植入后，将切除肿瘤切片，包埋在石蜡中并用免疫荧光抗体标记。
接下来，光谱库完成后，创建一个包含用于获取肿瘤切片图像的所有波长的光谱库。在最后一步对载玻片进行成像，进行数据分析以允许识别和关联感兴趣的细胞标志物的染色模式。最终，可以根据细胞外和细胞标志物的多重标记来识别新的细胞实体或表型，以更好地了解复杂组织（如肿瘤微环境）的组成。
与标准免疫荧光技术相比，该技术的主要优点是多光谱分析允许您在同一张载玻片上多路检测 7 个或多个荧光 4，从而可以更精确、更详细地询问肿瘤微环境或再生组织的细胞组成。虽然这种方法可以提供对肿瘤微环境起源和组成的见解，但它可以应用于其他系统，例如再生医学、发育生物学和免疫生物学。与 Dr.Spa 一起演示该程序的是我实验室的研究助理 Chris Booth 由于该机构的 IU Cook 限制，我们将讨论但不展示任何直接的鼠标作小鼠。
这些骨髓手术和我们的肿瘤植入技术可以在我们之前的工作中找到，例如 KID 和其他干细胞。2009 年开始从镜像后肢中分离骨髓细胞后，复苏将细胞悬浮在每只小鼠每 100 微升 PBS 200 万个细胞的浓度。使用加热灯扩张受辐照受体 GFP 小鼠的血管，并将小鼠置于尾静脉注射约束装置中。
使用 29 号针头斜面朝上，将细胞悬液系统注射到尾部或眶后静脉中。注射后使用无菌纱布对尾部施加轻微压力。在注射当天仅用 100 μL PBS 注射一只小鼠作为植入对照。
Re 以每 100 微升 100 万个细胞的浓度将感兴趣的肿瘤细胞悬浮在 PBS 中。用 70% 乙醇对腹部消毒后。用一只手通过颈部和尾巴的褶皱来束缚鼠标，然后用另一只手握住针斜面朝上，将肿瘤细胞注射到受体小鼠的腹膜腔中。
15 至 30 天后，对小鼠实施安乐死并从其腹部切除肿瘤。然后将肿瘤固定在 10% 福尔曼中 24 小时。然后将固定的组织切成 5 到 10 微米的切片，用于后续的染色程序。
用石蜡固定组织切片后，将样品在 56 摄氏度下烘烤 1 小时。然后按照以下顺序清洗玻片 最后一次乙醇洗涤后，用水冲洗玻片 2 分钟。慢慢浸入水中并将染色架升入和抬升 10 次。
接下来，将柠檬酸钠缓冲液放入微波炉中加热。将玻片在柠檬酸钠缓冲液中煮沸 20 分钟后，让样品在缓冲液中冷却 30 分钟。然后用离子水再洗涤 5 分钟。
然后轻拍载玻片，让任何大水滴滚落，注意不要使组织切片变干。使用疏水屏障笔标记肿瘤切片周围的切片，然后立即在样品上放置封闭缓冲液，以防止组织切片变干。一小时后，将玻片与目标一抗放在水分室盒中，在缓慢旋转的摇床上以 4 度孵育过夜。
第二天早上，在 PBST 中洗涤载玻片两次，每次 10 分钟，同时在清洗切片时轻轻摇晃。以 1：1000 抗体与封闭缓冲液的比例稀释二抗。然后在室温下，在用铝箔覆盖的水分室盒中孵育适当二抗中的切片，并在室温下缓慢旋转摇床上孵育。
在 PBST 中洗涤玻片两次，轻轻摇动 5 分钟，避光保存。然后用 DPI 对仅 dappy 玻片和分析玻片染色 1 分钟，在孵育过程中保持玻片被覆盖。将盖玻片放在每个样品上，用指甲硬化剂密封每个盖玻片的边缘。
现在要执行多光谱成像，请使用油物镜拍摄分析玻片的初始图像，以获得光谱库中每个光谱范围的适当曝光时间。例如，该表概述了基于实验中使用的 floor fours 数量建议的谱库方案。然后对本实验光谱库中背景载玻片的未染色载玻片进行成像。
下一张图像，未染色的载玻片，以实现光谱库的背景图像。现在对每个对照单层 4 染色玻片进行成像，将图像保存在用于每个玻片的二抗名称下。一旦 Suspectable 文库完成，在分析玻片上收集感兴趣区域的图像以分析肿瘤组织的图像。
首先，使用 inform 软件导入采集的细微差别图像的代表性分类。然后按照程序的指示打开安全光谱库。接下来，确定要分析的感兴趣组织区域。
根据 DAPI 染色鉴定单个细胞。细胞质将根据细胞核的形状自动识别。现在为每个荧光参数选择所需的荧光强度读数，然后匹配采集的图像，让软件使用建议的算法处理数据。
图像处理完成后，合并生成的文件。接下来，使用这种多光谱成像技术对这种转基因骨髓移植小鼠模型中的肿瘤进行分析和绘图，在骨髓移植 3 周后通过流式细胞术识别出源自骨髓的基质肿瘤成分。然后在使用单色对照玻片创建光谱库后，分析来自未标记注射的卵巢肿瘤的初始注射切片 6 周后，分析用 GFP DPI 和其他两种标志物染色的卵巢肿瘤切片的图像。
可以添加更多标记。例如，在这里，使用知情软件显示了具有六个标记物和一个核染色的肿瘤切片的光谱库和随附图像。肿瘤切片中感兴趣的组织区域是可分类的，如此处所示的代表性图像所示。
例如，这张图片演示了组织段的分类，然后是细胞的分割。基于核染色 dpi。然后可以在每个细胞的细胞核和细胞质中测量荧光标记的定量，并导出以供进一步分析。
组织分割算法能够根据组织结构而不是仅根据荧光染料鉴定进一步鉴定组织亚型，从而提供更强大的分析工具，将染色分类为不同的组织区域。在这张图片中，计算机经过训练，可以根据组织内的结构模式识别五个子区域。背景由空格定义。
溶血性肿瘤的定义是组织内红细胞的丰度。肿瘤由密集的细胞定义。脂肪由大的对称空细胞隔室定义，肌肉由横纹图案定义。
使用这种方法，可以根据确定的荧光强度阈值分析双阳性细胞群。例如，对于 GFP 阳性和 α 平滑肌肌动蛋白阳性细胞，如此处所示，有关四种颜色以外的其他光谱检测，请参阅链接的提示和技巧文档，了解如何对五个或更多探针进行多路复用。在尝试此过程时，请务必记住，图像质量在很大程度上取决于使用适当的单色对照幻灯片。
按照此程序，可以执行其他方法，如荧光原位杂交，以回答其他问题，如细胞区室和肿瘤微环境组织。看完这个视频，你应该对我们的模拟技术有很好的了解，即多细胞成分的多光谱询问，在完成这个视频时，你应该对如何在一张载玻片上识别多个细胞靶标有透彻的了解。如何统计 Unix 这些细胞靶标，并很好地了解肿瘤基质或再生组织或您感兴趣的组织的进化。
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概述
本研究通过多光谱探测复杂细胞组成来研究细胞对肿瘤基质发展的贡献。通过使用转基因小鼠和免疫荧光染色，研究旨在识别复杂组织环境中的新型细胞表型。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 肿瘤学
背景
- 复杂组织由各种细胞元素组成。
- 理解细胞表型对于肿瘤微环境研究至关重要。
- 多光谱成像技术增强了细胞分析。
- 转基因模型有助于研究特定细胞群体。
研究目的
- 确定骨髓驻留群体对肿瘤基质的贡献。
- 基于多重标记识别新型细胞实体。
- 增强对复杂组织组成的理解。
使用的方法
- 移植转基因GFP标记的小鼠，并注入RFP表达的骨髓干细胞。
- 在移植后向受体小鼠注射肿瘤细胞。
- 对切除的肿瘤切片进行免疫荧光标记。
- 创建用于成像分析的光谱库。
主要结果
- 识别与肿瘤基质相关的细胞标记。
- 通过多重标记发现新型细胞表型。
- 增强对肿瘤微环境组成的理解。
- 成功应用了多光谱成像技术。
结论
- 该研究为肿瘤基质的细胞动力学提供了见解。
- 多光谱技术对分析复杂组织有效。
- 未来的研究可以在这些发现的基础上探索治疗靶点。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative multispectral analysis of fluorescent tissue transplants enables precise deconvolution of cellular origins and phenotypes within complex tissue environments, such as the tumor microenvironment. This approach enhances predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking by allowing multiplexed, quantitative assessment of cell lineage contributions and interactions. The method supports critical inflection points in discovery and translational research pipelines by providing robust, reproducible cellular composition data for portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous interrogation of cellular contributions to tissue development and disease models.
- Supports functional target validation by distinguishing cell lineages and their roles in tumor stroma formation.
- Facilitates mechanistic de-risking through multiplexed identification of novel cellular phenotypes.
- Improves predictive confidence for advancing targets with complex cellular interactions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, multiplexed tissue systems for downstream screening workflows.
- Standardizes quantitative readouts of cell origin and marker expression across multiple fluorophores.
- Enables reproducible, high-content analysis for compound evaluation in disease-relevant systems.
- Supports scalability and platform reuse by accommodating seven or more markers per slide.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by tracing bone marrow-derived and stromal cell contributions in vivo.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling longitudinal tracking of cellular dynamics.
- De-risks translational advancement by quantifying cell-type specific responses within the tumor microenvironment.
- Supports biomarker alignment through multiplexed immunohistochemistry and spectral unmixing.
Pipeline & Workflow Integration
This multispectral methodology integrates from early discovery through preclinical research, bridging hypothesis testing, target validation, and translational continuity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven analysis of cell lineage contributions and tissue architecture.
- Screening: Delivers multiplexed, quantitative outputs for assay standardization and reproducibility.
- Analytics: Provides high-content, statistically robust measurements of cellular markers and tissue segmentation.
- Translational Research: Enables tracking of cell fate and interactions in disease-relevant in vivo models.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, reusable platform for multiplexed tissue analysis across diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in complex tissue systems.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of multiplexed tissue analysis.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by providing robust cellular composition data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multispectral imaging, immunofluorescence, and spectral unmixing software.
- Demands access to advanced imaging instrumentation and computational analysis infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of controls and spectral libraries.
- Adaptable to various tissue and disease models with appropriate marker selection.
- Image quality and quantitative accuracy depend on optimal control slide preparation and spectral calibration.
