荧光组织移植后用于可视化细胞来源、类型及相互作用的定量多光谱分析

以下实验的目的是通过多光谱分析多重细胞组分或其模拟物，以确定各种骨髓驻留细胞群体对肿瘤基质发育的贡献。该目标首先通过将表达RFP的骨髓干细胞移植到转基因GFP标记的受体小鼠体内来实现。第二步，将感兴趣的肿瘤细胞注射至同一受体小鼠体内，待移植成功后，切除肿瘤组织，进行切片、石蜡包埋，并使用免疫荧光抗体进行标记。

接下来，在完成所有用于获取肿瘤切片图像的波长光谱库后，将对切片进行成像。最后一步是进行数据分析，以识别并关联感兴趣细胞标志物的染色模式。最终，可通过细胞外和细胞内标志物的多重标记，识别出新的细胞实体或表型，从而更深入地理解肿瘤微环境等复杂组织的组成。

与标准免疫荧光技术相比，该技术的主要优势在于多光谱分析能够实现在同一张切片上对七种或更多荧光染料进行多重检测，从而更精确、更详细地分析肿瘤微环境或再生组织中的细胞组成。尽管该方法可用于揭示肿瘤微环境的来源与组成，但它也可应用于其他系统，例如再生医学、发育生物学和免疫生物学。本实验操作由本实验室研究助理 Chris Booth 与 Dr. Spa 共同演示。由于本机构的 IACUC 相关规定，我们将对此进行讨论，但不会展示任何对小鼠的直接操作过程。

这些骨髓操作及我们的肿瘤移植技术可在我们先前的研究中找到，例如 kid 及其他干细胞研究。2009年，在从对侧后肢分离骨髓细胞后，将细胞重悬于每只小鼠100微升PBS中，浓度为200万个细胞。使用加热灯扩张经照射的GFP受体小鼠的血管，并将小鼠置于尾静脉注射固定装置中。

使用29号针头，针尖斜面向上，将细胞悬液系统性地注射到尾静脉或眶后静脉。注射后用无菌纱布对尾部施加轻压。在注射当天，用100微升PBS仅注射一只小鼠作为植入对照。

将目标肿瘤细胞在 PBS 中重悬，浓度为每 100 微升含 100 万个细胞。用 70% 乙醇对腹部进行消毒后，用一只手抓住小鼠颈部背侧皮肤和尾巴以固定小鼠，另一只手持针头，针尖斜面朝上，将肿瘤细胞注射到受体小鼠的腹腔内。

15至30天后，处死小鼠并从其腹部切除肿瘤。随后将肿瘤组织置于10%福尔马林中固定24小时。然后将固定后的组织切成5至10微米厚的切片，用于后续染色操作。

将组织切片固定于石蜡后，在 56 摄氏度下烘烤样本一小时。随后按照以下顺序清洗载玻片。最后一次乙醇洗涤后，将载玻片在水中冲洗两分钟，缓慢地将染色架浸入和取出水中 10 次。

接下来将柠檬酸钠缓冲液放入微波炉中加热。将载玻片在柠檬酸钠缓冲液中煮沸20分钟后，让样本在缓冲液中冷却30分钟。然后用去离子水再洗涤5分钟。

然后轻敲载玻片，使较大的水滴滚落，注意不要将组织切片完全干燥。使用疏水屏障笔在肿瘤切片周围标记区域，随后立即在样本上加封闭缓冲液，以防止组织切片干燥。室温孵育一小时后，将载玻片置于湿盒中，在4°C、缓慢旋转摇床中与目标一抗于4°C过夜孵育。

第二天早晨，将载玻片在PBST中清洗两次，每次10分钟，清洗过程中轻轻振荡。将二抗按1:1000的抗体与封闭缓冲液比例稀释。然后将组织切片置于适当的二抗溶液中，放入用铝箔包裹的湿盒内，在室温下于缓慢旋转摇床上孵育2小时。

用 PBST 轻轻振荡洗涤载玻片两次，每次五分钟，并避光保护。然后将 dappy 仅载玻片和分析用载玻片用 DPI 染色一分钟，孵育期间保持载玻片覆盖。为每个样本加盖盖玻片，并用指甲油封固每张盖玻片的边缘。

现在进行多光谱成像时，使用油镜对分析切片拍摄初始图像，以确定光谱库中每个光谱范围的合适曝光时间。例如，下表列出了根据实验中使用的荧光染料种类数量建议的光谱库方案。然后，对未染色切片进行成像，作为本实验光谱库中的背景切片。

下一个图像，采集未染色切片以获得光谱库的背景图像。现在对每个单染对照的四张染色切片进行成像，并以每张切片所使用的二抗名称命名保存图像。一旦光谱库构建完成，采集分析切片上感兴趣区域的图像，以分析肿瘤组织的图像。

首先，使用 inform 软件导入一组具有代表性的已获取的 nuance 图像。然后按照程序指示打开安全光谱库。接下来，确定待分析的感兴趣组织区域。

根据 DAPI 染色识别单个细胞。细胞质将根据细胞核的形态自动识别。现在选择每种荧光参数所需的荧光强度读数，然后匹配获取的图像，使软件使用指定算法处理数据。

图像处理完成后，合并生成的文件。接下来，利用该多光谱成像技术分析并绘制此转基因骨髓移植小鼠模型中的肿瘤图像，通过流式细胞术在骨髓移植后三周识别出来源于骨髓的间质性肿瘤成分。随后，在初次注射六周后，利用单色对照切片建立光谱库，对未标记注射的卵巢肿瘤切片进行分析，并对经GFP DPI及另外两种标记物染色的卵巢肿瘤切片图像进行分析。

可以添加更多标记物。例如，此处使用智能软件展示了包含六种标记物及一种核染色的肿瘤切片的光谱库及其对应的图像。如图中所示的代表性图像，肿瘤切片内的感兴趣组织区域可被分类。

例如，该图像展示了组织片段的分类，随后进行细胞的分割。根据细胞核染色的 dpi。然后可在每个细胞的细胞核和细胞质中测量荧光标记的定量结果，并导出以进行进一步分析。

该组织分割算法能够基于组织结构而不仅仅依赖荧光染料的识别，进一步鉴定组织亚型，从而提供一种更强大的分析工具，将染色结果划分为不同的组织区域。在本图像中，计算机经过训练，可根据组织内的结构模式识别出五个亚区域。背景由空白区域定义。

溶血性肿瘤的特征是组织内存在大量红细胞。肿瘤的特征是细胞密度高。脂肪的特征是具有大的对称性空泡状细胞结构，而肌肉则具有横纹状结构。

利用该方法，可根据确定的荧光强度阈值分析双阳性细胞群体。例如，对于绿色荧光蛋白（GFP）阳性及α-平滑肌肌动蛋白阳性的细胞，如本图所示可实现四色以上的额外光谱检测，有关五种或更多探针的多重检测，请参见相关提示与技巧文档。在进行该实验操作时，需牢记图像质量在很大程度上依赖于所使用的正确单色对照切片。

完成此操作后，可进一步采用其他方法（如荧光原位杂交）来回答更多问题，例如细胞区室和肿瘤微环境组织的相关研究。观看本视频后，您应能充分理解我们的模拟技术、多细胞组分的多光谱检测方法；完成本实验后，您将全面掌握如何在一张切片上识别多个细胞靶标，如何对这些细胞靶标进行计数，并深入理解肿瘤间质或再生组织，或您所关注的特定组织的演化过程。