Name: 组织工程生物反应器的双轴机械装载设计 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 学习双轴机械加载生物反应器的设计与操作方法，用于软骨组织工程研究。该装置可精确施加单轴或双轴机械应变，通过力反馈系统监测培养过程，促进细胞外基质分泌与组织强度提升，为功能性组织构建提供关键技术支持。

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本研究由美国退伍军人事务部研究与发展办公室（RR&amp;D 服务）、美国国立卫生研究院 COBRE 1P20RR024484、美国国立卫生研究院 K24 AR02128 以及美国国防部 W81XWH-10-1-0643 项目资助。

1. 双轴加载生物反应器设计
<ol>
 <li>该生物反应器采用 Thor-labs 公司（Newton, MA）生产的两个运动平台，专为精密激光导向应用设计，可对工程化组织施加单轴或双轴机械应变，具有精确的加载剂量（振幅和频率）控制能力，并适用于从单孔到24孔板等多种组织培养条件（图1）。</li>
 <li>双轴加载由两个 TravelMax 平台（LNR50SE）实现。这两个平台以正交方式安装，构成XZ方向配置。水平平台通过沿X轴振荡提供动态剪切运动，垂直平台通过沿Z轴振荡提供动态压缩加载。这些平台具有50 mm的行程范围，由步进电机驱动器（DRV014）独立驱动，并通过具备微步进功能的闭环步进电机控制器（BSC102）进行控制，可实现小于50 nm的步长精度。</li>
 <li>设备安装在一块刚性铝制基板上，尺寸为25 cm × 30 cm × 12.5 mm，作为机械部件组装平台以及组织培养板的安装基座。采用可调节的运动学限位装置将组织培养板固定在铝基板上。这些限位装置配有微调螺钉，可实现手动无法达到的精确定位。基板的模块化设计允许灵活布置这些限位装置，以适应不同尺寸和形状的培养板（如培养皿与多孔板）。</li>
 <li>一块定制加工的聚砜加载压头通过精密加工的直角支架连接至双轴移动平台。选用聚砜材料是因为其具有良好的生物相容性、易于加工以及易于灭菌的特点。</li>
 <li>平台的运动由 Thor-labs 公司的高级定位技术（APT）软件进行控制。步进电机驱动器与该软件配合使用，可独立且同时调节剪切和压缩载荷的频率与振幅参数。</li>
 <li>每个移动平台均配备线性光学编码器，提供位置反馈，并与控制软件集成。该编码器系统的双向重复精度为0.1 μm，分辨率为20 nm，在整个50 mm行程范围内可实现小于3 μm的位置精度。这些编码器向驱动电子系统提供必要的位置反馈，确保真正的纳米级定位能力，并直接输出绝对位置读数。</li>
 <li>为实现对压头与样品接触的检测及加载响应的评估所需的力反馈，在加载压头与移动平台之间安装了一个精密微型测力传感器（Honeywell 型号 31）（图2）。该测力传感器的全量程精度高达0.15%至0.25%。其显示单元（SC500）可提供最多五位小数的载荷测量值，并配有RS-232接口，便于在计算机上进行数据采集。</li>
</ol>
2. 细胞接种的琼脂糖构建物
<ol>
 <li>制备 4% 琼脂糖：在 50 ml 锥形瓶中，将 0.8 g 琼脂糖加入 20 ml DMEM（无添加剂）中，煮沸，随后置于 70 °C 烤箱中保温备用。</li>
 <li>调整细胞悬液体积，使其为所需接种细胞密度的两倍体积。将此细胞悬液与等体积的 4% w/v 琼脂糖混合，以获得含有目标接种密度的 2% 琼脂糖凝胶。</li>
 <li>将细胞悬液和一支 10 ml 移液管一同放入培养箱中预温。</li>
 <li>组装凝胶浇铸系统。将一块 1.5 mm 和一块 0.75 mm 间隔板叠放，形成厚度为 2.25 mm 的凝胶。也可使用其他尺寸的间隔板以制备不同厚度的凝胶。由于凝胶浇铸系统本身无法牢固固定这些板，必须用胶带将其严密固定，以防泄漏。</li>
 <li>下一步需在琼脂糖凝固前迅速将细胞悬液与预先制备的琼脂糖混合，并移入凝胶模具中。从烤箱中取出液态琼脂糖，插入无菌温度计。琼脂糖必须冷却至 42–43 °C 后方可与细胞混合。同时将细胞悬液升温至 37 °C。当琼脂糖温度降至 43 °C 时，迅速吸取所需体积的琼脂糖，立即吸取细胞悬液并上下吹打数次以充分混匀，随后立即将全部混合液移入凝胶模具中。</li>
 <li>静置凝胶 10–15 分钟使其固化，然后小心地将模具倾斜至水平位置。</li>
 <li>移除顶部玻璃板，使用活检打孔器打取凝胶圆片。可用无菌小刮勺小心挑取圆片。根据我们的经验，9 ml 凝胶足以制备超过一百个直径为 5 mm 的圆片。</li>
</ol>
3. 培养组织块
<ol>
 <li>在24孔非组织培养处理板的每个孔中放入一个圆盘。</li>
 <li>向每个孔中加入2 ml无血清软骨诱导分化培养基。</li>
 <li>将培养板放入培养箱（37 °C，5% CO2）中。</li>
 <li>更换培养基时，每隔2-3天每孔更换1 ml。</li>
</ol>
4. 机械加载样品的固定
<ol>
 <li>制备4%琼脂糖（不添加细胞悬液），其厚度应薄于待测样品本身（以防止加样时产生干扰）。推荐厚度为1.5–1.9 mm（适用于2.25 mm厚的样品）。</li>
 <li>琼脂糖凝固后，为24孔板打孔，制备直径16 mm的琼脂糖圆片。在每个圆片中央打一个直径5 mm的孔，用于放置样品。如需更换培养基时便于移液操作，可在圆片边缘再打一个直径5 mm的孔，用于放置移液枪头。</li>
 <li>制备好琼脂糖小室后，将其放入24孔板中，如图3所示。</li>
 <li>将琼脂糖小室置于24孔板中后，将样品压入每个小室中，样品应从琼脂糖小室顶部突出。</li>
</ol>
5. 机械加载
<ol>
 <li>对压头进行灭菌（图 2）。</li>
 <li>将铝板固定到载荷传感器上。将压头/载荷传感器/铝板组件固定到载物台上。</li>
 <li>打开步进电机控制器（背面开关）。</li>
 <li>启动计算机并打开“APT User”程序（图 4）。
 <ol>
 <li>左屏幕控制水平方向的步进电机，右屏幕控制垂直方向的步进电机。在每个屏幕中，“图形控制”选项卡用于手动定位，“运动序列”选项卡用于自动化操作。所有单位均为 mm。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>在两个屏幕中均进入“图形控制”选项卡，然后按下“回零/归零”按钮。两个步进电机的行程范围均为 50 mm。按下“回零/归零”按钮后，两个步进电机会移动至零位（最上端和最右端位置）。</li>
 <li>准备 24 孔板中的样品，通过从每个孔中移除部分培养基来进行加样前处理。每个孔中残留的培养基不应超过 1 ml，以防止加样过程中溢出。同时确保每个孔中保留足够的培养基以完全覆盖样品。
 <ol>
 <li>注意：为防止仪器故障，培养箱应保持在低湿度环境中。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>将 24 孔板放入生物反应器中，并小心地与压头对齐。
 <ol>
 <li>使用四个可调节的运动学定位器将板固定在生物反应器上。为便于压头对齐，左侧两个定位器已预先定位。拧紧右侧两个定位器以固定板，并确保板与生物反应器底座前缘齐平。</li>
 <li>在“图形控制”选项卡中，可通过单击位置框手动输入特定的步进电机位置。利用此功能缓慢降低压头并水平移动，以与板对齐。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>当压头接近样品时，开始以极小的步长（0.1 mm）逐步下移，直至达到预设的起始位置（见第 6 部分）。</li>
 <li>到达起始位置后，切换至“运动序列”选项卡，通过点击“加载”按钮载入所需的运动序列，然后点击“运行”开始实验（图 5）。参见第 7 部分：编写给药程序。</li>
 <li>完成加样后，手动抬高压头。若任何样品粘附在压头上，应使用无菌刮铲小心将其放回相应的孔中。</li>
 <li>从生物反应器中取出 24 孔板并更换培养基。</li>
 <li>小心地将压头从载荷传感器上卸下，然后关闭仪器。</li>
</ol>
6. 校准加载压头
为确保将正确的菌株应用于样品，每次实验开始前必须对每个压板进行仔细校准。
<ol>
 <li>执行步骤 5.1 至 5.8。</li>
 <li>手动将水平步进电机置于 25 mm 位置。</li>
 <li>小心降低压板，直至其刚好与生物反应器底部接触。此时载荷传感器将显示载荷增加。记录垂直步进电机的精确位置（应尽可能精确，因为所有压缩应变测量值都将基于此数值计算）。</li>
 <li>记录该位置。此数值将用于根据样品尺寸和目标应变编写给料程序。</li>
</ol>
7. 撰写给药方案
<ol>
 <li>该生物反应器能够同时或单独施加压缩应变和剪切应变。必须确定三个主要参数：预载压缩应变、动态应变幅值和加载频率。</li>
 <li>施加预载应变是为了防止压头从样品上抬起。</li>
 <li>选择样品的动态应变幅值和加载频率。</li>
</ol>
本研究中，我们将压缩应变和剪切应变定义如下： 
<img alt="材料科学中压缩和剪切应变的计算公式，展示相关方程。" fo:content-width="3.26in" fo:src="/files/ftp_upload/50387/50387eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50387/50387eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 1">
示例双向给药方案 
样品厚度：2.25 mm 
预载应变（压缩）：样品厚度的10%（0.225 mm） 
动态应变振幅（压缩）：10%（±样品厚度的5%） 
频率（压缩）：1 Hz 
动态应变振幅（剪切）：样品厚度的25%（0.5625 mm）：剪切应力为 
由平板水平移动施加到样品上。 
频率（剪切）：0.5 Hz 
典型的给药方案为每天3小时的负荷期。
在此示例中，动态载荷和剪切载荷是同时施加的，而非依次施加。我们认为这种加载模式能更好地模拟人体膝关节内的复杂受力环境。
<ol start="4">
 <li>选定给药方案后，必须编写一个压缩运动序列程序。</li>
 <li>运动序列正如其名，即步进电机在指定加速度和最大速度下所要移动到的一系列位置列表。</li>
 <li>根据给药方案和压板校准值（来自第6部分）计算所需的垂直位置。</li>
 <li>以下提供了压板1的示例计算：</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>与校准值的差值</td>
 <td>垂直位置</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>压板校准值（接触生物反应器底部）</td>
 <td>0 mm</td>
 <td>29.7700 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>压板接触样品时（样品厚度为 2.25 mm）</td>
 <td>4.4140 mm</td>
 <td>25.3560 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>应变（厚度的 5%）</td>
 <td>4.3015 mm</td>
 <td>25.4705 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>应变（厚度的 10%）</td>
 <td>4.1890 mm</td>
 <td>25.5810 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>应变（厚度的 15%）</td>
 <td>4.0765 mm</td>
 <td>25.6955 mm</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
<ol start="8">
 <li>位置计算完成后，通过调整加速度和最大速度值来获得正确的频率。相应地，应选择合适的循环次数（例如 10,800 个循环，1 Hz，持续 3 小时。</li>
 <li>示例动态压缩运动序列程序（10% 预压缩，10% 动态应变幅度，1 Hz）图5)</li>
 <li>动态剪切运动序列程序：循环次数应根据所需的频率和持续时间进行选择（例如 5,400 个循环，0.5 Hz，持续 3 小时。</li>
 <li>示例动态剪切位移序列程序（10% 预压缩，0.5625 mm（厚度的25%）动态剪切应变振幅，0.5 Hz）图5).</li>
</ol>

<ol><li>Drachman, D. B., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+movement+in+embryonic+joint+development%5BTitle%5D)+AND+%22Devl.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of movement in embryonic joint development.</a> Devl. Biol. 14, 401-420 (1966).</li>
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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

我们设计了一种加载装置，能够对用于移植的组织工程构建物施加单轴或双轴机械应变。该装置可作为生物反应器使用 体外 工程化生物复合材料的培养，或作为测试装置用于描述天然组织或其他处理前后的力学特性。该装置可对工程化组织构建体施加双轴机械载荷，载荷剂量（振幅和频率）控制精确，并可适用于从单孔到24孔板的多种组织培养条件。
	施加剪切载荷为此系统的构建带来了一系列独特的挑战。为了最大化营养物质的传递，最初将构建物置于24孔板的各个孔中且未加约束。这对于动态压缩并不构成问题，因为预设的压缩应变可确保样品与压头之间的接触不会丧失。然而，当在实验方案中加入剪切应变后，未受约束的样品会在孔板底部滑动，部分样品甚至与压头失去接触。此外，在双轴加载方案中，样品容易发生翻转，导致加载不一致。我们通过制备琼脂糖微孔来固定样品，从而解决了这一问题，具体操作如文中所述。这些琼脂糖微孔可在不影响样品营养供应的前提下，实现样品的稳定双轴加载。
	与被广泛研究的压缩式生物反应器20,21不同，我们的装置能够在多个轴向上施...

我们设计了一种加载式生物反应器，能够对用于移植的组织工程复合材料施加单轴或双轴机械应变。该装置主要作为关节软骨组织工程替代物的生物反应器而设计，也可用于人体其他承重组织。本生物反应器的设计理念源于 Drachman 和 Sokoloff 1，首次观察到因缺乏运动导致麻痹的鸡胚关节软骨出现异常形成。类似地，体育锻炼对正常肌肉和骨骼的发育至关重要。基于这一理念，许多研究团队已探究了不同形式的物理刺激在发育过程中对组织和器官的影响。 体外 培养调控细胞-生物材料复合物及组织外植体的生化与力学特性 2-7功能性组织工程的概念涉及 体外 利用机械刺激增强组织的功能特性， 即 使组织能够承受预期的机械性能 体内 应力与应变 8,9大量研究报道了利用剪切和压缩的力学加载来刺激工程化关节软骨构建物。Mauck 等 10 表明，即使在缺乏通常被认为至关重要的生长因子的情况下，单纯的机械负荷也能诱导间充质干细胞的软骨形成。在组织培养过程中施加间歇性机械负荷（如压缩或剪切力）已被证明可调节软骨和骨的形成，但最佳的负荷剂量因细胞和组织特性而异 11.
	关节软骨最重要的功能是能够承受关节内的压缩力和剪切力，因此必须具备较高的压缩模量和剪切模量。工程化软骨因缺乏功能性力学强度和生理性的超微结构，导致新生软骨发生退变破坏。 体内 以及关节内软骨替代策略的失败。尽管压缩和剪切力已被普遍证实可调节并改善关节软骨生物复合物的力学强度，但联合应用这两种力学刺激的方法仍较为罕见。 6,12-15. Wartella 和 Wayne 16 设计了一种生物反应器，可施加拉伸和压缩力以生成半月板软骨替代物。Waldman 等人 15 设计了一种装置，用于对在多孔聚磷酸钙基质中培养的软骨细胞施加压缩和剪切力。Bian 等. 17 表现出与天然软骨相匹配的力学性能 体外 成年犬软骨细胞在凝胶中的培养及双轴力学加载（压缩变形加载与滑动接触加载）的应用。 
	双轴力学加载生物反应器最初由我们实验室的 Danielle Chu 设计，其总体目标是诱导组织工程软骨构建物发生形态学适应，从而获得比现有材料更高的压缩模量和剪切模量18。我们相信，这项研究将显著增进我们对如何调控机械转导以工程化临床相关组织的深入理解。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DMEM，高糖，丙酮酸钠</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖 II 型</td><td>Sigma</td><td>CAS 39346-81-1</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-谷氨酰胺 100X</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>ITS+ 预混液</td><td>BD Biosciences</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素 B</td><td>Invitrogen</td><td>041-95780</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma</td><td>A-2218</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸溶液 100x</td><td>Sigma</td><td>M-7145</td><td></td></tr><tr><td>L-脯氨酸</td><td>Sigma</td><td>P-5607</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma</td><td>D-2915</td><td></td></tr><tr><td>重组人转化生长因子 &amp;#946;1</td><td>R&amp;D Systems</td><td>240-B-010</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>31 型载荷传感器（1000 g）</td><td>Honeywell</td><td>AL311</td><td></td></tr><tr><td>31 型载荷传感器（1000 g）</td><td>Honeywell</td><td>AL311</td><td></td></tr><tr><td>单通道显示器</td><td>Honeywell</td><td>SC500</td><td></td></tr><tr><td>带步进执行器的 50 mm 线性编码 Travelmax 平台</td><td>Thorlabs</td><td>LNR50SE/M</td><td></td></tr><tr><td>双通道步进电机控制器</td><td>Thorlabs</td><td>BSC102</td><td></td></tr><tr><td>50 mm 梯形步进电机驱动器（2 个）</td><td>Thorlabs</td><td>DRV014</td><td></td></tr><tr><td>可调式运动学定位器（4 个）</td><td>Thorlabs</td><td>KL02</td><td></td></tr><tr><td>精密直角板</td><td>Thorlabs</td><td>AP90/M</td><td></td></tr><tr><td>垂直安装支架</td><td>Thorlabs</td><td>LNR50P2/M</td><td></td></tr><tr><td>实心铝制光学平台板</td><td>Thorlabs</td><td>MB3030/M</td><td></td></tr><tr><td>凝胶制备系统，含 1.5 mm 和 0.75 mm 间隔板</td><td>BioRad</td><td>#1653312 和 #1653310</td><td></td></tr><tr><td>一次性活检打孔器，5 mm</td><td>Miltex, Inc.</td><td>33-35</td><td></td></tr><tr><td>16 mm 空心打孔器</td><td>Neiko Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>非组织培养处理的 24 孔平底板</td><td>BD Biosciences</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>超防潮聚砜片（用于加载压头）</td><td>McMaster-Carr</td><td>86735k19</td><td>定制加工</td></tr></tbody></table>

用于组织工程的双轴机械加载生物反应器设计

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

我们设计了一种加载装置，能够对用于移植的组织工程复合材料施加单轴或双轴机械应变。该装置主要作为生物反应器，模拟组织所处的天然机械应变环境，同时配备有载荷传感器，可用于提供力反馈或对构建物进行力学测试。该装置可对工程化软骨构建物施加高精度剂量（包括幅度和频率）的双轴机械加载，并且结构紧凑，可置于标准组织培养孵育箱内使用。装置可直接在组织培养板中对样本进行加载，兼容多种规格的培养板。该装置采用专为精密导向激光应用制造的部件设计而成。双轴加载通过两个正交的运动平台实现，每个平台具有50 mm的行程范围，并由步进电机驱动器独立驱动。驱动器具备闭环控制和微步进功能，可实现小于50 nm的步进尺寸。聚砜材质的加载压板与双轴移动平台相连接。平台的运动由Thorlabs高级定位技术（APT）软件控制，该软件与步进电机驱动器配合使用，可独立且同时调节剪切和压缩载荷的频率与幅度参数。位置反馈由线性光学编码器提供，其双向重复精度为0.1 μm，分辨率为20 nm，从而在整个50 mm行程范围内实现小于3 μm的定位精度。这些编码器向驱动电子系统提供必要的位置反馈，以确保真正的纳米级定位能力。为了提供力反馈以检测接触状态并评估加载响应，在加载压板与移动平台之间安装了一个高精度微型载荷传感器。该载荷传感器的满量程精度高达0.15%至0.25%。

通过使用接种了2000万个细胞/ml软骨细胞的琼脂糖凝胶，并在单轴（压缩）或双轴（压缩和剪切）力学负荷条件下培养，对装置进行了测试。原代猪软骨细胞从2至4月龄猪的关节软骨中分离获得。直径5 mm、厚度1.5 mm的样品在24孔板中培养，每孔加入2 ml明确定义的软骨诱导培养基（高糖DMEM，1% ITS+ Premix，100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素，2 mM L-谷氨酰胺，2.5 μg/ml两性霉素B，50 μg/ml抗坏血酸，0.1 mM非必需氨基酸（NEAA），0.4 mM脯氨酸），培养条件为37 °C、5% CO2。在培养的前10天中添加10-7 M地塞米松和10 ng/ml TGF-β1。样品在培养第10至30天期间每天加载3小时。单轴加载参数为10%压缩峰-峰值振幅、1 Hz；双轴加载参数为0.15 mm（厚度的10%）压缩和0.075 mm剪切峰-峰值振幅、1 Hz。动态应变振幅和加载频率的选择依据已发表的研究17,19。在培养30天结束时，评估了工程化软骨的生化和力学性能。
本研究采...

我们设计了一种新型机械负荷生物反应器，可在将软骨生物复合材料移植到关节软骨缺损部位之前，对其施加单轴或双轴机械应变。

我们设计了一种加载装置，可对用于……的组织工程生物复合材料施加单轴或双轴机械应变。

以下实验的总体目标是制备可用于移植的功能性组织工程生物复合材料。通过在三维生物材料复合物中对细胞施加精确的单轴或双轴机械应变，以提供生物物理刺激，从而实现这一目标。第二步，生物反应器配备负载传感器，可在加载过程中提供力反馈并对生物复合材料进行力学测试。接下来，将生物复合材料培养数周，以诱导其生化成分和强度在宏观尺度上的变化，获得的结果显示出不同类型负荷对糖胺聚糖和胶原含量、支架、厚度以及平衡模量的显著影响。尽管该方法可为双轴负荷对工程化软骨组织的影响提供见解，但也可应用于其他承重较低的组织，如骨和肌腱，表明该操作流程具有广泛适用性。本实验操作将由本实验室的Amy May和Rob Stefani进行演示。开始该操作前，按照图示设置双轴生物反应器。生物反应器的底部由一块尺寸为25厘米×30厘米×12.5毫米的铝板构成。可变的定位选项可实现对不同形状和大小的组织培养板进行灵活安装。接下来，确保将载物台安装在底座上，使水平载物台仅沿x轴方向振荡，以提供动态剪切力。垂直载物台通过仅沿 Z 轴振荡提供动态压缩。下一步是制备定制的聚砜加压板。聚砜材料是理想选择，因其具有良好的生物相容性、易于加工且易于灭菌。通过精密加工的直角支架将培养板与双轴移动平台连接。固定在底板上的运动学限位器配有微调螺钉，可实现手动无法达到的培养板精确定位。接下来，将步进电机执行器连接到每个平台上，以便为软件提供位置反馈。此处所示的步进电机执行器具有0.1微米的双向重复精度和20纳米的分辨率，在50毫米的行程范围内可实现小于3微米的定位精度。通过Thor Labs的先进定位技术软件控制载物台的运动。该软件可独立且同时调节剪切和压缩载荷的频率与振幅参数。接下来，在加载铂金片与移动平台之间放置一个微型五磅力传感器，以提供必要的力反馈，用于检测铂金片与构建物之间的接触，并评估加载响应。确保测力计的精度在满量程的0.15%至0.25%之间，并且测力计的显示单元配备RS 232端口，以便在计算机上进行数据采集。为了将样品固定在24孔板的孔内，使用带有1.5毫米间隔垫片的凝胶制备系统，制备厚度为1.5毫米的琼脂糖凝胶模具。组装完成后，在两块玻璃板之间倒入4%琼脂糖溶液，并让混合物冷却。然后移除顶层平板，从农杆菌平板上打取直径为16毫米的菌饼。对每个菌饼，在其中打一个孔，用于放置样品。将制备好的菌饼放入24孔板的各个孔中。然后将直径5毫米、厚2.25毫米的组织构建物压入每个凝胶支架中。样品应从每个气溶胶支架的顶部突出。接着，向每个孔中加入1.5毫升培养基，并盖上盖子。然后将培养板放回培养箱，直至准备进行样品加载。开始对组织构建物进行机械加载时，需将铝板固定到载荷传感器上，并始终将无菌铂金组件连接到垂直载物台上。培养箱应以低湿度条件运行，以防止仪器故障。接下来，打开步进电机控制器和计算机。启动高级定位技术用户程序，并在两个屏幕上进入图形控制选项卡。按下回零按钮，使两个步进电机回到零位，该位置定义为最顶部和最右侧的位置。通过从每个孔中移除部分培养基来准备上样样品，以防止机械上样过程中发生溢出。接下来，将24孔板放入生物反应器中，并使用四个可调节的运动学定位器小心地将孔板与铂金表面（platin）对齐，确保孔板已正确对齐。在图形控制选项卡中，将孔板前端与生物反应器底座前端齐平。手动微调。通过单击位置框水平移动以调节对齐。当板与孔板的孔对齐后，开始缓慢放下板，直至其首次接触到样品。到达起始位置后，切换到运动序列选项卡，通过点击“加载”按钮载入所需的运动序列，或按照本视频配套文字方案中的说明创建您自己的程序。然后点击“运行”以启动程序。软件将控制电机对样品施加设定的处理程序。程序结束后，手动抬起培养板，使其完全脱离组织培养板的顶部。然后从生物反应器中取出24孔轮板并更换培养基。最后，小心地将铂金从负荷传感器上取下，然后关闭仪器。本视频中描述的双轴生物反应器的使用对组织工程构建物中细胞分泌的糖胺聚糖和胶原蛋白量具有显著影响。条件培养每周进行五天，每天三小时，施加10%的压缩应变和5%的剪切应变，频率为1赫兹。培养30天后，经双轴加载处理的软骨细胞所分泌的糖胺聚糖和胶原蛋白量显著高于对照组样本，而单轴加载仅显著增加了糖胺聚糖的分泌量。此外，双轴加载形成的组织更厚，但对组织的弹性没有影响。采用此给药方案，在经过30天的力学刺激和培养后，对组织构建物的横截面进行染色，以检测软骨的典型标志物，包括番红O和II型胶原。三个不同组别分别为：无刺激组、单轴加载组和双轴加载组。尽管所有组别对阿尔新蓝、番红O染色均呈阳性，但与无负荷组和单轴加载组相比，双轴加载的样品显示出更多的II型胶原。观看本视频后，您应能够充分理解如何对正在发育的组织工程构建物施加单轴或双轴负荷。

design-biaxial-mechanical-loading-bioreactor-for-tissue

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

组织工程生物反应器的双轴机械装载设计

我们课题组开发了一种生物反应器培养系统，可模拟心血管系统的生理脉动应力，用于再生可植入的小直径血管移植物。...

使用脉动生物反应器构建基于生物材料的血管移植物

已设计出一种循环压力生物反应器，可对心脏瓣膜组织施加生理和病理条件下的压力。LabVIEW...

设计一种用于循环压力生物反应器的装置 离体 主动脉心脏瓣膜的研究

静电纺丝支架可在制备后进行加工，以用于组织工程应用。本文介绍了制备复杂结构支架的方法（通过连续纺丝）、制备更厚支架的方法（通过多层叠加并采用热处理或蒸汽退火）、实现无菌性的方法（无菌制备或制备后灭菌），以及获得适宜生物力学性能的方法。...

组织工程用静电纺丝纤维的后期加工处理

本文介绍了一种新型拉伸平台，可用于研究单个细胞对复杂各向异性双轴机械变形的响应，并量化生物组织的力学特性。...

一种用于细胞与组织力学生物学研究的新型拉伸平台

本研究介绍了一种通过直接培养胶原蛋白、平滑肌细胞和内皮细胞来快速制备活体血管组织的技术。此外，还描述了一种用于工程化血管组织力学表征的新方案。...

用于血管组织再生的三维细胞化胶原凝胶的构建

本文介绍了一种纯单轴加载装置的构建方案。通过采用关键的设计要素，确保获得准确且可重复的测试结果。...

单轴加载机器开发中的设计要素应用

三维单轴机械刺激生物反应器系统是肌腱来源干细胞向肌腱特异性分化及新生肌腱形成的理想生物反应器。...

应用三维单轴机械刺激生物反应器系统诱导肌腱来源干细胞的肌腱向分化

本实验方案的目标是在管状电纺支架中建立人巨噬细胞与肌成纤维细胞的动态共培养体系，利用可分离剪切应力与周期性拉伸的生物反应器，研究材料驱动的组织再生过程。...

一种多信号生物反应器，用于在流动和拉伸条件下评估生物材料的炎症反应与再生能力

利用干细胞衍生的心肌细胞生物工程构建的三维心脏组织已成为研究健康与疾病状态下人类心肌的有前景模型 体外...

设计生物反应器以提高工程化心肌组织的数据采集效率与模型通量

本方案介绍了新开发的3D打印生物反应器的组装与操作方法 离体 灌注条件下血管的培养。该系统设计易于被其他用户采用，具有实用性、经济性，并可适应不同的实验应用，如基础生物学和药理学研究。...

体外 3D打印生物反应器中大血管的灌注培养

学习双轴机械加载生物反应器的设计与操作方法，用于软骨组织工程研究。该装置可精确施加单轴或双轴机械应变，通过力反馈系统监测培养过程，促进细胞外基质分泌与组织强度提升，为功能性组织构建提供关键技术支持。

用于组织工程的双轴机械加载生物反应器设计

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