小鼠牙龈细胞的分离、处理与分析
2013年7月2日
本研究描述了一种高效分离和处理小鼠口腔牙龈组织以制备单细胞培养物的技术。所获得的细胞可进一步用于流式细胞术分析和分子生物学研究。
本实验的总体目标是精确分离和处理牙龈组织，以便进行后续的流式细胞术分析。首先通过外科手术精细地分离牙龈组织，随后对切除的组织进行处理，以制备单细胞悬液。
然后进行细胞外和细胞内抗体染色。最后，通过流式细胞术分析样本。最终，可通过流式细胞术分析获得结果，显示牙龈中不同的细胞群体以及组织在受到免疫刺激后发生的细胞变化。
与OC化学或单荧光等传统方法相比，该技术的主要优势在于其能够快速、简便地分析大量细胞，可同时检测多个变量，并能分选不同类型的细胞用于后续实验。该方法有助于回答免疫学领域的关键问题，例如在牙周炎实验模型中，微生物如何影响牙龈稳态，以及其与炎症诱导的骨质流失之间的关系。我们最初是在研究RI细胞在牙周炎过程中的作用时，提出了该方法的构想。该方法的可视化演示至关重要，因为GVA基因加速技术由于MU一处J gva区域体积微小且操作通路相对不便，学习起来较为困难。
首先，根据文本方案准备培养基溶液和灭菌的外科手术器械。按照所在机构动物护理与使用委员会批准的方法处死小鼠后，使用锋利的直剪刀沿口腔两侧剪开，包括颊部和下颌支，并用标准剪刀将下颌向下牵拉，使剪刀方向垂直于腭骨平面。沿第三磨牙后方一毫米处的假想线剪开软组织和硬组织。
接下来，在切牙后方两毫米处的软组织和硬组织内做一切口。然后用剪刀平行于腭部向下牵拉口腔前部，以暴露鼻腔。将一把剪刀插入鼻腔，另一把用于在前庭处做切口，并向后延伸至之前的切口。
在上颌骨的另一侧重复切口，以将其从颅骨上分离。然后沿中线将其切开，并使用镊子和剪刀去除每侧半上颌骨的腭部组织，暴露牙槽骨。剥离前缘的牙龈组织，并将其放入含有 PBS 和 2% 胎牛血清（FCS）的培养皿中；处理牙龈时，将其转移至含有 1 毫升 PBS、2 毫克/毫升 II 型胶原酶以及 1 毫克/毫升 DNase 的培养皿中。
使用15号无菌手术刀片进行切碎。在将组织转移至15毫升锥形试管之前，充分剪碎组织。用1毫升含胎牛血清的磷酸盐缓冲液（PBS-FCS）冲洗培养板上残留的组织细胞，并将其转移至试管中。
将组织置于预热的摇床培养箱中，在37摄氏度、200转/分钟条件下孵育20分钟。然后加入20微升0.5摩尔的EDTA，继续孵育10分钟。接着加入P-B-S-F-C-S缓冲液至12毫升，于4摄氏度、400 × g离心8分钟。
去除上清液后，用2毫升的PBS-FCS重悬细胞。将样本在4°C、320×g离心5分钟后，通过70微米细胞筛过滤。再用300微升的PBS-FCS重悬细胞。
最后，在通风橱内于低温且关闭灯光的条件下操作，将细胞用总体积为 100 微升的溶液重悬，每 1 × 10⁶ 个细胞加入 0.2 至 0.5 微克的每种选定抗体，短暂涡旋混匀。将样品在 4°C 避光孵育 15 分钟后，加入 2 毫升 P-B-S-F-C-S，于 320 × g、4°C 离心 5 分钟。为固定细胞，吸除上清液，然后在涡旋振荡的同时，逐滴加入 500 微升预冷的 BD Cytofix/Cytoperm 溶液，重悬细胞。
将试管在避光条件下于4°C孵育40分钟。孵育后涡旋振荡，短暂混匀，然后加入1毫升BD破膜洗液缓冲液，在4°C、800 × g条件下离心7分钟。重复洗涤一次后，吸除上清液，仅保留300微升洗涤缓冲液。
然后，在100微升的总体积中对细胞进行胞内染色，每1×10⁶个细胞加入1微克所选抗体。短暂涡旋混匀，在避光条件下孵育30分钟。按照之前方法洗涤细胞两次，弃去所有上清液后，将细胞重悬于300微升新鲜的冷BD破膜洗涤缓冲液中。
短暂涡旋后，将悬液过滤至传真管中。在进行传真分析前，将试管置于冰上或冰箱中避光保存。牙龈细胞来自两只未经处理的小鼠。
使用LSR II流式细胞仪进行检测，并通过FlowJo软件进行分析。此处展示的侧向散射光和前向散射光图显示了细胞的分布情况。为便于比较，图中标示了用于鉴定淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞和粒细胞的设门策略。
该图展示了实验性牙周炎背景下，经口服灌胃感染牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）21天后，从小鼠分离的牙龈细胞的流式分析图。与本图中所示的未处理小鼠相比，感染小鼠中多种免疫细胞群体的数量增加可被清晰检测到。经处理的牙龈组织中的免疫细胞通过圈选表达造血细胞标志物CD45的细胞来鉴定。
这些细胞进一步被分选为图中所示的CD3阳性T细胞。中性粒细胞则根据LY6G和CD11B分子的表达情况进行鉴定。最后，通过圈选MHC II类分子阳性且CD11C阳性的细胞，并结合EPAM和RIN（CD207）的表达，鉴定朗格汉斯细胞及上皮内的树突状细胞亚群。一旦掌握该技术，若操作得当，整个流程可在三小时半至五小时内完成。
其他方法（如实时 PCR）可用于回答更多问题，例如单细胞基因表达。在该技术建立之后，为免疫学领域的研究人员探索牙龈 GVA 在牙周研究领域中对任何刺激的局部反应开辟了道路。该技术使我们能够阐明免疫细胞和非免疫细胞在实验性牙周炎发病机制中对 G GVA 所起的作用。
观看本视频后，您应能够充分掌握如何分离和处理尿液来源的GVA，以获得单细胞悬液，并进一步对其进行胞外和胞内病毒染色，用于流式细胞术分析。
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概述
本研究描述了一种高效分离和处理小鼠口腔牙龈组织以制备单细胞培养物的技术。所获得的细胞可用于流式细胞术分析和分子生物学研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 免疫学
背景
- 牙龈组织对于理解口腔健康至关重要。
- 单细胞培养可实现对细胞的详细分析。
- 流式细胞术是分析细胞群体的有力工具。
- 免疫损伤可能影响牙龈中的细胞组成。
研究目的
- 分离牙龈组织以进行后续分析。
- 制备单细胞悬液用于流式细胞术。
- 研究免疫暴露后的细胞变化。
使用的方法
- 牙龈组织的外科分离。
- 处理切除的组织以制备单细胞悬液。
- 使用抗体进行细胞外和细胞内染色。
- 通过流式细胞术分析样本。
主要结果
- 鉴定牙龈中的不同细胞群体。
- 观察免疫损伤后的细胞变化。
- 流式细胞术为细胞动态提供了详细见解。
- 研究结果有助于理解牙龈对免疫挑战的应答机制。
结论
- 该技术可实现牙龈细胞的高效分离与分析。
- 流式细胞术适用于研究牙龈中的细胞反应。
- 研究结果可能为未来口腔免疫学研究提供参考。
常见问题
行业重要性概述
精确分离和流式细胞术分析小鼠牙龈细胞，可实现对疾病相关口腔组织中免疫细胞群体的高分辨率分析。该技术有助于对牙周病及骨重塑相关免疫通路进行机制性去风险化和靶点验证。该方法可提高针对口腔与骨-免疫相互作用的早期发现和转化研究的预测可信度。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可在炎症条件下对牙龈组织中免疫细胞的动态变化进行分析。
- 支持对与口腔和骨疾病模型相关的免疫靶点进行功能验证。
- 通过区分朗格汉斯细胞和调节性T细胞等稀有细胞群体，有助于揭示作用机制并降低研发风险。
- 提供定量数据，用于指导免疫调节策略的研发管线筛选与优先级排序。
筛选与检测方法开发
- 生成经过验证的单细胞悬液，适用于多参数流式细胞术检测。
- 支持小量组织样本中免疫细胞表型分析的检测标准化与可重复性。
- 可在临床前模型中实现对实验干预下细胞反应的可扩展性分析。
- 为后续分子分析（包括基因表达谱分析）提供样本制备支持。
转化与临床前研究
- 与牙周炎和骨丢失的疾病相关模型相一致，有助于转化生物标志物的发现。
- 从发现阶段的免疫谱型分析延续至治疗假设的临床前验证。
- 通过实现体内稳健的免疫监测，支持基于风险调整的推进决策。
- 促进局部免疫反应及其对组织重塑影响的探索。
流程与工作流整合
该方法通过实现对口腔炎症和骨重塑小鼠模型中免疫细胞的分析，融入了从发现到临床前研究的连续过程。
- 发现生物学：支持对驱动牙周病和骨质流失的免疫机制进行假设验证。
- 筛选：提供可重复、定量的流式细胞术结果，用于免疫细胞亚群分析。
- 分析：提供多参数数据，用于比较不同实验条件下的免疫应答。
- 转化研究：在相关疾病模型中，将早期发现成果与临床前生物标志物及疗效研究相衔接。
- 企业级复用：建立可重复使用的平台，用于口腔与骨骼研究流程中的免疫细胞分离与分析。
运营与企业影响
- 科学价值：提高免疫靶向研究的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：标准化从难以处理的组织来源中分离和分析免疫细胞的方法。
- 战略价值：通过在研发早期实现可靠的免疫谱型分析，提升项目推进或终止决策的准确性，并提高资金使用效率。
- 项目组合影响：支持对免疫调节和骨靶向治疗项目的优先级排序，使其更符合风险调整后的战略目标。
实施注意事项
- 需要具备小鼠手术技术和流式细胞术分析的专业知识。
- 需要使用细胞分选和多参数分析的专用仪器设备。
- 需要跨团队统一组织处理和染色方案的标准操作流程。
- 可能需要根据不同的小鼠品系或疾病模型进行调整。
- 由于小鼠牙龈组织体积小且难以获取，限制了实验通量。
