Name: 小鼠牙龈细胞的分离，处理和分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 学习从小鼠口腔中分离和处理牙龈组织以制备单细胞悬液的方法，用于流式细胞术分析和口腔免疫学研究。该技术可识别不同细胞群体并观察免疫刺激后的细胞变化。

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本研究获得了以色列科学基金会（AHH：编号1418/11；AW：编号1933/12）、德国-以色列青年研究人员基金会（GIF Young，授予AHH）以及希伯来大学-哈达萨牙科学院Dr. I. Cabakoff研究捐赠基金（授予AHH和AW）的资助。

提前准备：
<ul>
	<li>PBS + 2% FCS</li>
	<li>含 2 mg/ml II 型胶原酶和 1 mg/ml I 型 DNA 酶的 PBS + 2% FCS（每份样品 1 ml）</li>
	<li>灭菌外科器械</li>
	<li>0.5 M EDTA 溶液</li>
</ul>
1. 上颌牙龈切除术技术
<ol>
	<li>根据批准的IACUC指南实施小鼠安乐死。</li>
	<li>使用锐性/钝性直剪刀剪开口腔两侧，包括颊部和下颌支。</li>
	<li>向下牵拉下颌。</li>
	<li>用普通剪刀沿第三磨牙后方1 mm处的假想线剪开软组织和硬组织。剪刀方向应垂直于腭骨平面（图2A，蓝色线）。</li>
	<li>在切牙后方2 mm处切开软组织和硬组织（图2A，蓝色线）。</li>
	<li>向下牵拉口腔前部。此步骤后可观察到鼻腔。</li>
	<li>将剪刀平行于腭部放置，将一侧刀片插入鼻腔，另一侧刀片在前庭处进行切开，沿此方向剪至后方切口（图2A，绿色线）。在上颌骨两侧重复此操作。最终使上颌骨与颅骨其余部分完全分离（图2B）。</li>
	<li>取出上颌骨，沿中线缝合处剪开（图2，黑色虚线），并修剪每侧半上颌骨的腭侧组织，直至暴露牙槽骨。</li>
	<li>使用无齿Adson镊子从牙龈组织（两侧半上颌骨）的前缘开始剥离牙龈。</li>
	<li>将切除的牙龈组织置于含有PBS + 2% FCS的培养皿中。</li>
</ol>
2. 牙龈组织处理
<ol>
	<li>将切除的牙龈组织置于含有1 ml PBS + 2% FCS、2 mg/ml II型胶原酶和1 mg/ml I型DNA酶的组织培养皿（35 × 10 mm）中。</li>
	<li>用N将组织切碎&deg;15把无菌手术刀片</li>
	<li>将组织从培养皿转移至15 ml锥形试管中。</li>
	<li>用 1 ml PBS + 2% FCS 洗涤留在培养板上的组织/细胞，并转移至同一试管中。</li>
	<li>在37℃摇床培养箱中孵育20分钟 &deg;C，200 转/分钟（建议：提前预热培养箱）。</li>
	<li>加入20 &mu;0.5 M EDTA 溶液，37℃再孵育10分钟 &deg;C，200 rpm</li>
	<li>用 PBS + 2% FCS 将试管补至 12 ml，4 ℃离心 &deg;C，400 × g 离心 8 分钟（建议：预先将离心机预冷）。</li>
	<li>移除上清液，并用 2 ml PBS + 2% FCS 重悬细胞。</li>
	<li>使用70 μm细胞筛过滤样品 &mu;m 细胞滤筛，收集滤过液。</li>
	<li>4℃离心 &deg;C，320 × g，离心5分钟</li>
	<li>移去上清液，并用300 &mu;l PBS + 2% FCS</li>
	<li>计数细胞（约 5-10 x 105 预计从单侧上颌获取细胞。</li>
</ol>
3. 用于流式细胞术分析的细胞外和细胞内抗体染色
建议在通风橱内操作，并关闭灯光。保持细胞及所需所有材料处于持续低温环境至关重要。
<ol>
	<li>在总体积为 100 μl 的溶液中，每 1 × 106 个细胞加入 0.2–0.5 μg 所选抗体，对细胞外分子进行染色。</li>
	<li>短暂涡旋混匀。</li>
	<li>将离心管置于 4 °C 避光孵育 15 分钟。</li>
	<li>用 2 ml PBS + 2% FCS 洗涤细胞。</li>
	<li>在 4 °C 下以 320 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，并在涡旋振荡的同时逐滴加入 500 μl 冰冷的 BD Cytoperm/Cytofix 溶液重悬细胞。</li>
	<li>将离心管置于 4 °C 避光孵育 40 分钟。</li>
	<li>短暂涡旋混匀。</li>
	<li>用 1 ml 冰冷的 BD Perm/Wash 缓冲液洗涤细胞两次，每次在 4 °C 下以 800 × g 离心 7 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，保留约 300 μl 液体。</li>
	<li>在总体积为 100 μl 的溶液中，每 1 × 106 个细胞加入 1 μg 所选抗体，对细胞内分子进行染色。</li>
	<li>短暂涡旋混匀。</li>
	<li>将离心管置于 4 °C 避光孵育 30 分钟。</li>
	<li>用 1 ml 冰冷的 BD Perm/Wash 缓冲液洗涤细胞两次，每次在 4 °C 下以 800 × g 离心 7 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，加入 300 μl 冰冷的 BD Perm/Wash 缓冲液重悬细胞。</li>
	<li>短暂涡旋混匀。</li>
	<li>将细胞悬液过滤后转移至流式管中。</li>
	<li>将样品管置于避光、低温环境中，直至上机分析。</li>
</ol>

<ol><li>Arizon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans+cells+down-regulate+inflammation-driven+alveolar+bone+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).</li>
<li>Listgarten, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of periodontitis.</a> J. Clin. Periodontol. 13, 418-430 (1986).</li>
<li>Kinane, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causation+and+pathogenesis+of+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontol%22%5BJournal%5D)">Causation and pathogenesis of periodontal disease.</a> Periodontol. 25, 8-20 (2000).</li>
<li>Jotwani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+dendritic+cells+infiltrate+the+T+cell-rich+region+of+oral+mucosa+in+chronic+periodontitis%3A+in+situ%2C+in+vivo%2C+and+in+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies.</a> J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).</li>
<li>Graves, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor+antagonists+inhibit+the+progression+of+inflammatory+cell+infiltration+toward+alveolar+bone+in+experimental+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis.</a> J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).</li>
<li>Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+chemokine+%28MCP-1%2C+MIP-1alpha%2C+MIP-1beta%2C+IP-10%2C+RANTES%29-positive+cells+and+chemokine+receptor+%28CCR5%2C+CXCR3%29-positive+cells+in+inflamed+human+gingival+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues.</a> Cytokine. 20, 70-77 (2002).</li>
<li>Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans+cell+dynamics+in+human+gingiva+during+experimentally+induced+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Buccale%22%5BJournal%5D)">Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation.</a> J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).</li>
<li>Cochran, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+bone+loss+in+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Inflammation and bone loss in periodontal disease.</a> J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).</li>
<li>Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response%3A+the+key+to+bone+resorption+in+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease.</a> J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).</li>
<li>Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+to+study+host-bacteria+interactions+involved+in+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis.</a> Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

从单只小鼠获取的上颌牙龈组织足以用于分析T细胞和B淋巴细胞亚群，以及它们表达细胞外和细胞内分子的能力，正如我们先前所述1。然而，如果关注的是稀有细胞群体（例如树突状细胞DCs），建议合并2-3只小鼠的组织。值得注意的是，如有需要，可同时剥离腭侧和牙龈组织，随后再切除牙龈组织（对步骤1.8-1.9的修改）。还应指出，下颌牙龈组织也可采集；但其分离过程更为复杂，可能混入其他组织，从而干扰后续分析。
研究牙龈中免疫细胞的常用技术包括免疫组织化学和免疫荧光。这些技术能够可视化目标分子/细胞在牙龈组织中的分布情况，但为了研究特定区域，需要对大量视野进行筛查。尽管由于牙龈组织处理过程的限制，某些细胞的生理定位无法通过流式细胞术确定，但该方法仍具有多项优势：（1）流式细胞术是一种快速且简便的大规模细胞分析方法；（2）可减少因组织异质性导致的分析误差；（3）能够分析稀有细胞群体；（4）可同时分析多个变量；（5）可区分活细胞与死细胞；（6）允许对获得的细胞进行功能分析。
在实验性牙周病过程中对牙龈组织进行流式细胞术分析的能...

牙龈是包绕牙齿颈部并覆盖牙槽突的软组织（图1）。牙龈是一种咀嚼黏膜，可进一步分为黏膜上皮和结缔组织（也称为黏膜下层或固有层）。牙龈与邻近牙齿的解剖结构为细菌提供了驻留并形成菌斑（生物膜）的环境，持续刺激局部免疫系统。因此，牙龈内可发生炎症反应，在某些情况下这种反应具有破坏性，即称为牙周病2。通常，由菌斑引起的牙周疾病可分为牙龈炎和牙周炎。牙龈炎是一种局限于牙龈的局部炎症反应，具有可逆性。而牙周炎则是一种不可逆的破坏性过程，其特征是牙周附着装置（包括牙槽骨、牙周膜、牙骨质和牙龈）遭到破坏3。
牙龈被认为在牙周病过程中既作为效应部位，也作为诱导部位4。人类研究表明，针对牙菌斑，免疫效应细胞和分子会动态地浸润或离开牙龈组织5-7。这一活动被证实对牙周组织破坏起着重要作用8,9。尽管这些研究为该病理过程提供了宝贵的信息，但使用人体组织存在重大的伦理、技术和实验局限性。实验模型的发展使得通过使用转基因小鼠和体内干预手段进行因果关系实验成为可能10。因此，在过去二十年中，我们对牙周病相关机制的认识显著增加。然而，由于牙周病的复杂性，关于促进组织破坏的局部免疫反应性质仍存在持续争论。此外，我们对牙周病期间牙龈中核心免疫细胞功能的理解仍显不足。因此，研究疾病靶组织——牙龈中发生的病理性炎症事件至关重要。

<table><tbody><tr><td>II型胶原酶</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>CLS-2</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>SIGMA</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>SIGMA</td><td>E6758-100G</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）</td><td>SIGMA</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Biological Industries</td><td>04-121-1</td><td>热灭活</td></tr><tr><td>真空驱动过滤器</td><td>Jet Biofil</td><td>FPE-204-500</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 聚苯乙烯圆底管</td><td>BD Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>SPL Lifesciences</td><td>93070</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿 35&amp;#215;10 mm</td><td>NUNC</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm</td><td>BD</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD11c 抗体</td><td>Biolegend</td><td>117305</td><td>克隆株 N418</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD45.2 抗体</td><td>Biolegend</td><td>109819</td><td>克隆株 104</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD4 抗体</td><td>Biolegend</td><td>100413</td><td>克隆株 GK1.5</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD8a 抗体</td><td>Biolegend</td><td>100733</td><td>克隆株 53-6.7</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD3 抗体</td><td>Biolegend</td><td>100214</td><td>克隆株 17A2</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD326 (Ep-CAM) 抗体</td><td>Biolegend</td><td>118219</td><td>克隆株 G8.8</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD207 (Langerin) 抗体</td><td>Imgenex</td><td>DDX0362D</td><td>克隆株 929F3.01</td></tr><tr><td>抗小鼠 I-A&lt;sup&gt;d&lt;/sup&gt; (MHC-II) 抗体</td><td>Biolegend</td><td>115010</td><td>克隆株 39-10-8</td></tr><tr><td>LSR II 流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 软件 v 7.6.5</td><td>Tree Star</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠牙龈细胞的分离、处理与分析

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

我们开发了一种精确分离和处理小鼠牙龈组织的方法，用于流式细胞术和分子研究。牙龈是一种独特且重要的组织，可用于研究免疫机制，因为它参与了宿主对可能引起牙周病的口腔生物膜的免疫反应。此外，由于牙龈与牙槽骨组织位置邻近，也可用于研究炎症条件下的骨重塑过程。我们的方法能够获得大量免疫细胞，使得即使稀有细胞群体（如朗格汉斯细胞和调节性T细胞）也能被分析，正如我们先前研究所证实的那样1。利用小鼠研究牙周病过程中涉及的局部免疫反应具有优势，原因在于存在多种可获得的免疫学和实验工具。然而，由于小鼠体积较小且牙龈部位相对难以接近，许多研究避免了对该关键组织的检测。本文所述方法有助于促进牙龈组织的分析，有望加深我们对口腔免疫系统及其在牙周病中作用的理解。

展示了对牙龈细胞进行流式细胞术分析的示例。将来自2只小鼠的牙龈细胞混合后，在LSR II流式细胞仪上检测，并使用FlowJo软件进行分析。图3A显示了来自未处理小鼠的牙龈细胞在侧向散射（SSC）与前向散射（FSC）图中的分布情况。图中注明了用于鉴定（i）淋巴细胞、（ii）单核细胞/树突状细胞以及（iii）粒细胞的设门策略。为便于比较，我们还展示了一张FACS图，显示在实验性牙周炎模型中，经口服灌胃P. gingivalis感染21天后从小鼠分离的牙龈细胞（如我们先前所述）（图3B）。与未处理小鼠相比，感染小鼠中多种免疫细胞群体的增加可被明显检测到。接下来，我们通过设门CD45阳性细胞（造血细胞标志物）来鉴定处理后的牙龈组织中的免疫细胞（图4A）。这些细胞进一步分为表达CD3的T细胞（图4B）。我们还根据Ly6G和CD11b分子的表达鉴定牙龈中性粒细胞（图4C）。最后，通过设门MHC II类分子+CD11c+细...

本研究描述了一种高效分离和处理小鼠口腔牙龈组织以制备单细胞培养物的技术。所获得的细胞可进一步用于流式细胞术分析和分子生物学研究。

我们开发了一种精确分离和处理小鼠牙龈组织用于流式细胞术和分子研究的技术。牙龈是一种独特的……

本实验的总体目标是精确分离和处理牙龈组织，以便进行后续的流式细胞术分析。首先通过外科手术精细地分离牙龈组织，随后对切除的组织进行处理，以制备单细胞悬液。然后进行细胞外和细胞内抗体染色。最后，通过流式细胞术分析样本。最终，可通过流式细胞术分析获得结果，显示牙龈中不同的细胞群体以及组织在受到免疫刺激后发生的细胞变化。与OC化学或单荧光等传统方法相比，该技术的主要优势在于其能够快速、简便地分析大量细胞，可同时检测多个变量，并能分选不同类型的细胞用于后续实验。该方法有助于回答免疫学领域的关键问题，例如在牙周炎实验模型中，微生物如何影响牙龈稳态，以及其与炎症诱导的骨质流失之间的关系。我们最初是在研究RI细胞在牙周炎过程中的作用时，提出了该方法的构想。该方法的可视化演示至关重要，因为GVA基因加速技术由于MU一处J gva区域体积微小且操作通路相对不便，学习起来较为困难。首先，根据文本方案准备培养基溶液和灭菌的外科手术器械。按照所在机构动物护理与使用委员会批准的方法处死小鼠后，使用锋利的直剪刀沿口腔两侧剪开，包括颊部和下颌支，并用标准剪刀将下颌向下牵拉，使剪刀方向垂直于腭骨平面。沿第三磨牙后方一毫米处的假想线剪开软组织和硬组织。接下来，在切牙后方两毫米处的软组织和硬组织内做一切口。然后用剪刀平行于腭部向下牵拉口腔前部，以暴露鼻腔。将一把剪刀插入鼻腔，另一把用于在前庭处做切口，并向后延伸至之前的切口。在上颌骨的另一侧重复切口，以将其从颅骨上分离。然后沿中线将其切开，并使用镊子和剪刀去除每侧半上颌骨的腭部组织，暴露牙槽骨。剥离前缘的牙龈组织，并将其放入含有 PBS 和 2% 胎牛血清（FCS）的培养皿中；处理牙龈时，将其转移至含有 1 毫升 PBS、2 毫克/毫升 II 型胶原酶以及 1 毫克/毫升 DNase 的培养皿中。使用15号无菌手术刀片进行切碎。在将组织转移至15毫升锥形试管之前，充分剪碎组织。用1毫升含胎牛血清的磷酸盐缓冲液（PBS-FCS）冲洗培养板上残留的组织细胞，并将其转移至试管中。将组织置于预热的摇床培养箱中，在37摄氏度、200转/分钟条件下孵育20分钟。然后加入20微升0.5摩尔的EDTA，继续孵育10分钟。接着加入P-B-S-F-C-S缓冲液至12毫升，于4摄氏度、400 × g离心8分钟。去除上清液后，用2毫升的PBS-FCS重悬细胞。将样本在4°C、320×g离心5分钟后，通过70微米细胞筛过滤。再用300微升的PBS-FCS重悬细胞。最后，在通风橱内于低温且关闭灯光的条件下操作，将细胞用总体积为 100 微升的溶液重悬，每 1 × 10⁶ 个细胞加入 0.2 至 0.5 微克的每种选定抗体，短暂涡旋混匀。将样品在 4°C 避光孵育 15 分钟后，加入 2 毫升 P-B-S-F-C-S，于 320 × g、4°C 离心 5 分钟。为固定细胞，吸除上清液，然后在涡旋振荡的同时，逐滴加入 500 微升预冷的 BD Cytofix/Cytoperm 溶液，重悬细胞。将试管在避光条件下于4°C孵育40分钟。孵育后涡旋振荡，短暂混匀，然后加入1毫升BD破膜洗液缓冲液，在4°C、800 × g条件下离心7分钟。重复洗涤一次后，吸除上清液，仅保留300微升洗涤缓冲液。然后，在100微升的总体积中对细胞进行胞内染色，每1×10⁶个细胞加入1微克所选抗体。短暂涡旋混匀，在避光条件下孵育30分钟。按照之前方法洗涤细胞两次，弃去所有上清液后，将细胞重悬于300微升新鲜的冷BD破膜洗涤缓冲液中。短暂涡旋后，将悬液过滤至传真管中。在进行传真分析前，将试管置于冰上或冰箱中避光保存。牙龈细胞来自两只未经处理的小鼠。使用LSR II流式细胞仪进行检测，并通过FlowJo软件进行分析。此处展示的侧向散射光和前向散射光图显示了细胞的分布情况。为便于比较，图中标示了用于鉴定淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞和粒细胞的设门策略。该图展示了实验性牙周炎背景下，经口服灌胃感染牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）21天后，从小鼠分离的牙龈细胞的流式分析图。与本图中所示的未处理小鼠相比，感染小鼠中多种免疫细胞群体的数量增加可被清晰检测到。经处理的牙龈组织中的免疫细胞通过圈选表达造血细胞标志物CD45的细胞来鉴定。这些细胞进一步被分选为图中所示的CD3阳性T细胞。中性粒细胞则根据LY6G和CD11B分子的表达情况进行鉴定。最后，通过圈选MHC II类分子阳性且CD11C阳性的细胞，并结合EPAM和RIN（CD207）的表达，鉴定朗格汉斯细胞及上皮内的树突状细胞亚群。一旦掌握该技术，若操作得当，整个流程可在三小时半至五小时内完成。其他方法（如实时 PCR）可用于回答更多问题，例如单细胞基因表达。在该技术建立之后，为免疫学领域的研究人员探索牙龈 GVA 在牙周研究领域中对任何刺激的局部反应开辟了道路。该技术使我们能够阐明免疫细胞和非免疫细胞在实验性牙周炎发病机制中对 G GVA 所起的作用。观看本视频后，您应能够充分掌握如何分离和处理尿液来源的GVA，以获得单细胞悬液，并进一步对其进行胞外和胞内病毒染色，用于流式细胞术分析。

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Research

科研

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Immunology and Infection

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