通过过继性转移致糖尿病性CD4+ T细胞在小鼠中加速诱导1型糖尿病

本实验的总体目标是通过将转基因小鼠的致糖尿病T细胞转移至缺乏内源性T细胞和B细胞的小鼠体内，快速诱导小鼠产生1型糖尿病。首先，从小鼠供体中分离脾脏和淋巴结，并纯化CD4阳性T细胞。随后，将纯化的供体T细胞过继性转移至非肥胖型糖尿病严重联合免疫缺陷受体小鼠体内。

然后监测受体小鼠的1型糖尿病发生情况。最终，该方案可用于研究糖尿病的发病机制，并可用于探究治疗干预措施。与其他方法相比，将BDC 2.5 CD4阳性T细胞转移至非辐射预处理受体小鼠这一技术的主要优势在于能够快速且可重复地诱导1型糖尿病的发生。

对于致糖尿病性 CD4 阳性 T 细胞的供体，使用经尿液葡萄糖检测确认无糖尿病的 6 周龄雌性糖尿病易感 BDC2.5 小鼠。摘除脾脏和淋巴结时，先用 70% 乙醇浸湿毛发，然后剪开皮肤并将其向后剥离，直至前肢肌肉暴露。在前肢基部附近，每侧应可见两个淋巴结。用小镊子小心夹住每个淋巴节点，修剪周围结缔组织以将其移除。

接下来，使用小剪刀在腹膜上做一个一英寸长的切口。现在轻轻抓住脾脏的中部，仔细修剪掉结缔组织及附着的脂肪。

然后将脾脏、脂肪组织以及淋巴结置于冰上含有10毫升DMEM的容器中。用无菌10毫升注射器活塞末端轻轻将淋巴器官组织通过70微米细胞滤筛，以获得单细胞悬液。

用一毫升 DMEM 多次冲洗每个滤器，以最大程度回收细胞。然后将收集的细胞转移至一个 15 毫升的锥形管中，在室温下以 400 ×g 离心 7 分钟。随后在细胞沉淀中加入 3 毫升 CK 缓冲液并重悬细胞。

室温孵育5分钟。为裂解红细胞，加入12毫升DMEM，通过离心沉淀细胞。用10毫升DMEM洗涤细胞沉淀一次。

接下来，将细胞悬浮于5 mL染色缓冲液中，使用相差显微镜和血细胞计数器对活细胞数量进行计数。每种染色对照取约1 × 10⁶个细胞。同时，使用小鼠单克隆抗体对细胞进行染色，以分选未活化的转基因CD4阳性T细胞。

将所有样品置于 4°C 避光孵育 30 分钟。随后用三倍染色体积的 fax 缓冲液洗涤细胞，并将细胞重悬于 fax 缓冲液中，分选样品的细胞浓度为每毫升 1×10⁷ 至 2×10⁷ 个细胞，单染对照为 300 µL。接下来，将细胞样品通过带有 35 µm 细胞滤网帽的离心管过滤。

为去除细胞团块，需在经过培训的操作人员协助下，使用细胞分选仪对样品进行处理。整个过程（包括仪器准备时间）预计需要约三小时，以分选大约1.5×10⁸个总数的转基因初始CD4阳性T细胞。每只小鼠可获得约2.5×10⁶个细胞，分选速率为每秒约2×10⁴个事件，适用于BD Fox Aria等仪器。将分选后的细胞收集至3 mL DMEM中。

记录分选细胞的绝对数量，并以400 × g离心七分钟。将细胞沉淀重悬于无菌磷酸盐缓冲液中，用于过继性T细胞转移。使用1 mL注射器和18号针头，轻柔地重悬经fax纯化的CD4阳性T细胞。

用1毫升注射器吸取细胞悬液，然后安装27½号针头备用。固定接受移植的小鼠，用70%乙醇擦拭其尾部以消毒注射部位。随后将每只小鼠接种1×10⁶个纯化的CD4阳性T细胞，注射至尾部侧静脉之一。

进行尾静脉注射时，切勿用力推动针栓。如果针头确实在静脉内，注射时几乎不会遇到阻力。在T细胞转移后的第五天开始，每天监测受体小鼠是否出现1型糖尿病症状。

根据试剂制造商的说明，使用试剂条检测尿液中的葡萄糖含量。请注意，若小鼠连续两次尿液葡萄糖读数超过每分升250毫克，则视为糖尿病。在典型实验中，每只BDC 2.5供体小鼠在细胞分选后可获得约2.5 × 10⁶个未受刺激的转基因CD4阳性T细胞；在过继转移致糖尿病的CD4阳性T细胞后，需监测小鼠的尿液葡萄糖浓度。

少量来自BDC 2.5供体小鼠的细胞过继转移可在第11天使所有非免疫排斥受体小鼠全部诱发1型糖尿病。操作得当的情况下，该技术从器官 harvesting 到T细胞转移可在约8小时内完成。