通过过继性转移致糖尿病性CD4+ T细胞在小鼠中加速诱导1型糖尿病

本实验的总体目标是通过将转基因小鼠的致糖尿病T细胞转移至缺乏内源性T细胞和B细胞的小鼠体内，快速诱导小鼠产生1型糖尿病。首先，从小鼠供体中分离脾脏和淋巴结，并纯化CD4阳性T细胞。随后，将纯化的供体T细胞过继性转移至非肥胖糖尿病严重联合免疫缺陷（NOD-scid）受体小鼠体内。

然后监测受体小鼠1型糖尿病的发生情况。最终，该方案可用于研究糖尿病的发病机制，并相较于其他方法更有效地探究治疗干预措施。与其它方法相比，将BDC 2.5 CD4阳性T细胞转移至非肥胖糖尿病小鼠受体的主要优势在于能够快速且可重复地诱导1型糖尿病的发生。

对于致糖尿病性 CD4 阳性 T 细胞的供体，使用经尿糖检测确认无糖尿病的 6 周龄雌性 BDC 2.5 前糖尿病小鼠。去除脾脏和淋巴结时，先用 70% 乙醇浸湿皮毛，然后剪开皮肤并牵拉皮肤直至前肢肌肉暴露。在前肢基部附近，每侧应可见两个淋巴结。用小型镊子小心夹住每个淋巴结，并修剪周围结缔组织将其摘除。

接下来，使用小剪刀在腹膜上做一个一英寸长的切口。现在轻轻抓住脾脏的中部。仔细修剪掉结缔组织和附着的脂肪。

然后将脾脏、腹膜及脾脏和淋巴结放入冰上预冷的10毫升DMEM中。用无菌10毫升注射器活塞末端，轻轻将淋巴器官组织通过70微米细胞筛网，以获得单细胞悬液。

用一毫升 DMEM 多次冲洗每个滤网，以最大程度回收细胞。然后将收集的细胞转移至一个 15 毫升的锥形管中，在室温下以 400 ×g 离心七分钟。最后在室温下用三毫升 CK 缓冲液重悬细胞沉淀。

现在将每种样品在室温下孵育五分钟。为了裂解红细胞，加入12毫升DMEM，通过离心收集细胞。用10毫升DMEM洗涤细胞沉淀一次。

接下来，将细胞悬浮于5 mL染色缓冲液中，使用相差显微镜和血细胞计数板对活细胞数量进行计数。每项染色对照中取约1 × 10⁶个细胞。同时使用小鼠单克隆抗体对细胞进行染色，以分选非活化的转基因CD4阳性T细胞。

将所有样品置于四摄氏度避光孵育30分钟。随后用三倍染色体积的fax缓冲液洗涤细胞，并将细胞重悬于fax缓冲液中，浓度为每毫升1×10⁷至2×10⁷个细胞用于分选样品，每管300微升用于单染对照。接下来，将细胞样品通过带有35微米滤网帽的细胞筛滤管。

为去除细胞团块，需在训练有素的操作人员协助下使用细胞分选仪处理样品。整个过程（包括准备时间）大约需要三小时，以分选约1.5×10⁸个转基因的初始CD4阳性T细胞。每只小鼠可获得约2.5×10⁶个细胞，分选速度在BD Fox Aria等仪器上约为2×10⁴个事件每秒。将分选后的细胞收集至3 mL DMEM培养基中。

记录分选后细胞的绝对数量，并以400 ×g离心7分钟。将细胞沉淀重悬于无菌磷酸盐缓冲液中，用于过继性T细胞转移。使用1毫升注射器和18号针头，轻柔地重悬经流式分选获得的CD4阳性T细胞。

用1毫升注射器吸取细胞悬液，准备注射时，在注射器上安装一根27½号针头。固定接受移植的小鼠，用70%乙醇擦拭其尾部以消毒注射部位。随后，将每只小鼠注射1×10⁶个纯化的CD4阳性T细胞，注射部位为尾侧静脉之一。

进行尾静脉注射时，切勿用力推动针栓。如果针头确实在静脉内，注射时几乎不会遇到阻力。在T细胞转移后的第五天开始，每天监测受体小鼠是否出现1型糖尿病的症状。

根据试剂制造商的说明，使用试剂条测量尿液中的葡萄糖含量。请注意，若小鼠连续两次尿液葡萄糖读数超过250毫克/分升，则视为糖尿病。在典型实验中，每只BDC 2.5供体小鼠在细胞分选后可获得约2.5 × 10⁶个未致敏的转基因CD4阳性T细胞；在过继转移致糖尿病的CD4阳性T细胞后，需监测小鼠的尿液葡萄糖浓度。

从BDC 2.5供体小鼠转移少量细胞可在第11天使所有非免疫抑制受体小鼠全部诱发1型糖尿病。若操作得当，该技术从器官采集到T细胞转移可在约八小时内完成。