Name: 使用在体内影像监测进展的实验小鼠巨细胞病毒感染的新生儿 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: 了解如何使用体内成像技术监测实验小鼠巨细胞病毒在新生小鼠中的感染动态。该方法利用荧光素酶重组病毒实时追踪病毒在中枢神经系统和腹腔中的复制与传播过程。

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我们感谢斯特拉斯堡IBMC的Lee Tuddenham提供MCMV-Luc的扩增与滴定，以及斯特拉斯堡INSERM U748的Thomas Baumert允许使用病毒学研究所的动物实验设施。本研究得到法国国家健康与医学研究院（INSERM）、斯特拉斯堡大学和法国国家科研署（ANR-08-MIEN-005-01）的经费支持。同时感谢Sonia Beroud和Laetitia Lelieur在硕士项目期间的初期参与。

1. 病毒悬液的制备
<ol>
	<li>从 Ulrich Koszninowski 实验室获取表达荧光素酶的 MCMV Smith 菌株（MCMV-Luc 15）。在此重组病毒中，荧光素酶基因被插入 MCMV 基因组的 ie2 位点。</li>
	<li>为扩增 MCMV-Luc，使用不同感染复数（MOI，0.001 至 1）的 MCMV 感染小鼠骨髓基质细胞系（M2-10B4，ATCC #CRL-1972）16。具体操作：在无血清培养基中，于 37 °C 条件下将病毒加入培养的细胞中。1 小时后，移除上清液，并替换为添加了 10% 胎牛血清（FCS）的 DMEM 培养基。5 天后，收集培养上清液，并将等份样品储存于 -80 °C，以备后续使用。</li>
	<li>通过噬斑测定法对病毒悬液进行滴度测定。
	<ol>
		<li>将 3T3 细胞（ATCC #CRL-1658）以每孔 40,000 个细胞的密度接种于 24 孔板中，每孔加入 1 ml 含 10% FCS、青霉素（200 IU/ml）和链霉素（200 mg/ml）的 DMEM 培养基，于 37 °C 培养 24 小时。</li>
		<li>取一份 MCMV 悬液，在 DMEM 中进行连续梯度稀释（10-1 至 10-8），吸除细胞培养基后，每孔加入 200 μl 稀释液以感染靶细胞（3T3）。于 37 °C 孵育 1 小时。随后每孔加入 1 ml 上层培养基（含 3% FCS 的 DMEM，2%（v/v）庆大霉素，200 IU/ml 青霉素，200 mg/ml 链霉素，8 g/L 羧甲基纤维素），于 37 °C 继续孵育 5 天。</li>
		<li>每孔加入 200 μl 10% 甲醛溶液（稀释甲醛时应在通风橱内操作，以避免吸入有毒气体），室温孵育 6 小时以固定细胞。用移液器吸除培养基与固定液，每孔加入 200 μl 细胞染色液（1% 结晶紫（w/v）溶于 20% 乙醇）。使用前将染色液按 1:9 体积比用 milli-Q 水稀释。室温孵育 2 分钟，将培养板在水中浸泡清洗 3–4 次，晾干后用双目光学显微镜计数噬斑数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 MCMV-Luc 用 DMEM 稀释至每 50 μl 含 50 PFU，并置于冰上保存以备后续使用。使用较高剂量的病毒感染会导致新生小鼠在达到 2–3 周龄前死亡。根据我们的经验，每只新生小鼠注射 500 PFU 后，均会在 5 至 7 天内致死。</li>
</ol>
2. 新生儿注射
<ol>
	<li>当有新生小鼠（4至20小时龄）可用时，应戴手套操作窝仔及笼内粪便，然后在小心抓取幼鼠前避免引入“外来”气味，以防引起母鼠应激并导致其弃仔。</li>
	<li>使用胰岛素注射器（29 G）进行腹腔注射，操作如图1A所示。用手指夹住幼鼠背部皮肤，使其腹部朝上，将针头从腋下前方插入，并轻轻皮下推进至腹腔（略低于脐部）。目前我们注射1%亚甲蓝（溶于DPBS中），通过观察存活情况来练习该技术，以便在进行病毒感染实验前熟练掌握。由于亚甲蓝在注射过程中清晰可见，建议先进行此项“训练性”注射，以确保病毒悬液准确注入腹腔。</li>
	<li>清除可能出现的微量血液，然后将幼鼠放回笼中。</li>
</ol>
3. 体内 成像
<ol>
	<li>第7天，以与之前所述相同的注意事项处理新生小鼠。每只动物腹腔注射麻醉剂混合物（4 mg/ml 氯胺酮，0.8 mg/ml 赛拉嗪）和荧光素（0.15 mg/g 体重），体积为50 μl。动物平均体重为1–2 g，每只动物的麻醉剂剂量为：氯胺酮40 μg，赛拉嗪8 μg。等待12–15分钟，直至荧光素发光达到峰值。该时间需预先确定，具体取决于荧光素供应商和所使用的成像系统。</li>
	<li>在幼鼠处于麻醉状态时，对其进行标记以便后续识别，并采集一小块组织样本，以备将来在使用突变动物时进行基因分型。</li>
	<li>将幼鼠放入成像系统中，采集其全身发出的光信号。感染后第7天，病毒已在肝脏、肾脏、肺和唾液腺等靶器官中大量复制，因此曝光时间应较短。在本实验中，我们采集10至20秒的图像（图1B）。成像设备的采集室平台需加热，以避免麻醉动物体温过度下降。此外，可在一次采集过程中先获取多只动物的低分辨率图像，然后将平台升高，使其更接近相机镜头，以便聚焦于某一只动物的特定部位或解剖后分离的器官。软件必须支持快速调整参数（曝光时间、样品与镜头距离、灵敏度），对定义的兴趣区域进行定量分析，并支持后续导出静态图像。</li>
	<li>若仅需采集头部的光信号，可将侧卧的新生小鼠身体部分用厚而深色的纸张覆盖，以屏蔽肝脏、肺和唾液腺等高病毒复制器官所发射的光子，然后进行5至10分钟的图像采集（图1C）。以相同条件采集动物对侧的图像。</li>
	<li>将幼鼠放回笼中，并在上方放置加热灯，防止麻醉后的新生小鼠体温过度下降。定期监测麻醉后的恢复情况。使用上述剂量时，麻醉通常持续30分钟。</li>
	<li>在第9、11和14天重复相同操作。在第11天和第14天，调整麻醉剂剂量（6 mg/ml 氯胺酮，1.2 mg/ml 赛拉嗪）。</li>
</ol>

<ol><li>Loewendorf, A., Benedict, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+host+innate+and+adaptive+immune+defenses+by+cytomegalovirus%3A+timing+is+everything%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Intern.+Med%22%5BJournal%5D)">Modulation of host innate and adaptive immune defenses by cytomegalovirus: timing is everything.</a> J. Intern. Med. 267, 483-501 (2010).</li>
<li>Lischka, P., Zimmermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+strategies+to+combat+cytomegalovirus+infections+in+transplant+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Antiviral strategies to combat cytomegalovirus infections in transplant recipients.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 8, 541-548 (2008).</li>
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<li>Koontz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+development+of+the+brain+after+focal+herpesvirus+infection+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Altered development of the brain after focal herpesvirus infection of the central nervous system.</a> J. Exp. Med. 205, 423-435 (2008).</li>
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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。	
	伦理声明	
	动物饲养于斯特拉斯堡免疫学与血液学研究所的动物饲养设施中，环境为无病原体条件。小鼠操作及实验程序均依照法国实验动物保护法进行。该实验程序已获得法国下莱茵省省府兽医服务部门批准，许可编号为 A-67-345。

使用 体内 利用成像技术监测新生小鼠中MCMV-Luc的播散情况，我们观察到病毒在突变动物中扩散至大脑，而野生型则无此现象。对动物进行进一步解剖以及 离体 脑部成像证实了中枢神经系统中存在发光病毒。此外，我们还对脑组织薄切片进行了免疫组织化学染色（结果未显示），使用针对MCMV E1早期蛋白的特异性抗体，观察到MCMV确实存在于与发光信号相同的位置，表明对整体活体麻醉动物发出的光进行宏观可视化，实际上反映了病毒实际感染的特征 体内.
此类分析已广泛应用于成年动物，例如通过植入发光细胞来监测肿瘤生长。在本案例中，挑战在于使用新生动物，由于技术原因，无法在成像室内对它们使用异氟烷气体麻醉。因此，我们不得不采用氯胺酮/赛拉嗪注射，并根据新生动物体型小的特点调整了剂量。同时，我们小心处理幼崽，以避免其母体排斥的风险。通过遵循本文所述的关键性操作建议和剂量方案，新生动物麻醉成为一种可行的替代方案，能够实现长时间的静止状态，从而满足成像实验所需的条件 体内 成像
...

人巨细胞病毒（HCMV/HHV-5）属于β-疱疹病毒科。HCMV是一种普遍存在的机会性病原体，通常在生命早期以无症状感染的形式获得1。与其他所有疱疹病毒一样，HCMV可在宿主体内终身潜伏，其病毒复制受到宿主免疫系统的严密控制。病毒再激活事件主要发生在免疫功能低下者中，例如接受抗排斥药物治疗的移植患者2。在成人中，HCMV还与胶质母细胞瘤相关3。此外，HCMV也是免疫系统尚未发育成熟的新生儿的重要病原体4-6。发育中的胎儿或新生儿发生原发性感染可导致严重后果。HCMV感染是发达国家先天性出生缺陷和儿童疾病最常见的感染性病因。据估计，新生儿HCMV感染的发生率约为所有活产婴儿的0.5%-1%，其中5%-10%将出现小头畸形或小脑发育不全等严重症状。此外，约10%的亚临床感染婴儿日后将出现后遗症，导致智力障碍、听力损失、视力缺陷或癫痫发作7,8。	
	与其他人类疱疹病毒（如单纯疱疹病毒1型，HSV-1/HHV-1）不同，后者可接种于小鼠 通过 不同的注射途径 9，巨细胞病毒的复制具有物种特异性。这一特性严重阻碍了对人巨细胞病毒（HCMV）致病机制的研究，目前这些研究依赖于不同的动物模型（小鼠、大鼠、豚鼠、恒河猴）及其各自宿主特异性的巨细胞病毒。所有巨细胞病毒在基因组大小与结构、组织嗜性以及基因表达调控方面均表现出显著相似性，并在其相应宿主中引发类似的病理变化。尽管HCMV与小鼠巨细胞病毒（MCMV）在基因组上存在差异（人类病毒中约50%的开放阅读框在小鼠巨细胞病毒中可被识别），但小鼠模型近年来被证明具有显著优势，主要原因是可利用该模型检测突变株控制病毒复制的能力 体内这促使了一项遗传筛选，从而能够估算在成年阶段表达的、构成对该病毒“抗性组”的小鼠基因数量 10总体而言，这表明感染MCMV的小鼠是研究成年个体中宿主与病毒相互作用的一个理想模型。然而，先天性CMV感染的研究更为复杂，因为人类与小鼠胎盘层次结构的差异阻碍了病毒在小鼠中从母体向胎儿的传播。最近，通过在妊娠第12.5天直接将MCMV注射至胎盘，成功实现了新生小鼠的脑部感染，并导致其出现听力损伤。 11然而，目前大多数研究采用腹腔注射4-20小时龄新生鼠的方法，以实现病毒的全身性播散，可能引起血源性脑部感染，该模型相较于颅内注射更具相关性。本方案为理解巨细胞病毒（CMV）的致病机制提供了重要见解，尤其证明了鼠巨细胞病毒（MCMV）感染新生鼠后，可在炎性病灶内的神经元和胶质细胞中复制，而这些病灶伴有单核细胞（如巨噬细胞）的浸润 12本报告还描述了小脑形态发生异常，伴随颗粒神经元增殖与迁移减少，以及多个干扰素刺激基因的诱导表达。同一研究团队还报道了CD8+T细胞在中枢神经系统中控制MCMV感染的关键作用。 13分析微生物致病效应时，一个需要重点考虑的方面是感染的动态过程。对于小鼠巨细胞病毒（MCMV）而言，尤其重要的是探索并量化病毒向发育中脑组织的播散进程，以理解并预测未来神经生物学损伤的程度。传统上，量化感染进展需要定期处死感染动物，以测定病原体在脑等难以直接取样的组织中的滴度。然而，此类方案目前正面临动物福利改进需求以及“3R原则”（减少、优化、替代）的挑战。 14使用 体内 成像技术可能显著减少实验所需的动物数量 体内 感染实验。本文报道并描述了新生小鼠腹腔注射MCMV-Luc后病毒向脑组织扩散的时间过程分析。利用同一批动物，我们对病毒传播进行了追踪和监测 体内 两周内病毒强烈复制的位点。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂/材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3523A</td><td></td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319112</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射针头</td><td>VWR</td><td>613-4897</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>CentraVet</td><td>Ket 201</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪/Vetranal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46995</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>DUTSCHER</td><td>P0436500</td><td></td></tr><tr><td>荧光素</td><td>Caliper</td><td>760504</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1272</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>羧甲基纤维素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4888</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>结晶紫</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3886</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>IVIS 50</td><td>Caliper/Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用 体内 利用成像技术监测新生小鼠巨细胞病毒感染进展

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

人巨细胞病毒（HCMV 或 HHV-5）是一种对免疫功能低下个体具有生命威胁的病原体。在先天性或新生儿感染情况下，该病毒可侵入发育中的大脑并进行复制，可能导致严重的神经系统损伤，包括耳聋和智力障碍。尽管症状可能十分严重，但目前尚无可用疫苗，也缺乏特异性的抗病毒治疗手段，限制了临床干预能力。此外，由于关于中枢神经系统（CNS）感染期间分子事件的观察大多来源于对感染儿童的尸检，目前仍缺乏对该过程的精确描述。已有多种动物模型（如恒河猴巨细胞病毒模型）被建立，为研究巨细胞病毒在中枢神经系统中的致病机制提供了重要线索。然而，尽管恒河猴与人类在进化上较为接近，该模型仍受限于通过颅内接种感染动物的方式，该方法虽可稳定诱导中枢神经系统感染，但存在操作局限性。此外，伦理方面的考量也推动了替代模型的开发，其中新生小鼠感染小鼠巨细胞病毒（MCMV）的模型近年来取得了显著进展。例如，已有研究报道，向 Balb/c 品系新生小鼠腹腔注射 MCMV 后，病毒可在大脑特定区域感染神经元和胶质细胞。这些发现提示，小鼠实验性接种可能模拟 HCMV 感染儿童所引发的神经功能缺陷。然而，对新生小鼠 MCMV 感染的动态分析难以开展，因为传统方法需在不同时间点处死大量动物，以检测病毒载量和/或免疫相关参数。为克服这一瓶颈，并为后续研究稀有突变动物模型提供可能，我们应用了 体内 利用成像技术对新生C57Bl/6小鼠外周注射表达荧光素酶的重组MCMV后，进行病毒在脑内传播的时间进程分析。

一个代表性实验如图1所示。将50 PFU的MCMV-Luc经腹腔注射入新生小鼠体内（图A显示了使用亚甲蓝进行类似注射，以可视化针头的皮下路径），随后对幼鼠进行麻醉，并同时给予0.3 mg的荧光素酶底物（荧光素，Caliper）。15分钟后，将动物仰卧置于IVIS 50（活体成像系统，Caliper）的采集室中，对整个动物发出的光信号进行10秒曝光采集。图B展示了使用专用分析软件（Living Image 3.2，Caliper）在第7、9、11和14天获取的快照图像。这些图像采用相同的参数进行校准：最大发射值设定为每秒107个光子（p/sec），最小值设定为每秒106个p/sec。从这些图像可以看出，整个动物体内的总体病毒滴度随时间推移而下降。使用相同软件对发光信号进行定量分析也证实了这一观察结果（未显示）。接下来，我们用一张厚而深色的纸覆盖动物全身（头部除外），以阻止肺、肝、肾和唾液腺等器官发出的光子被数码相机检测到。这使得可以延长曝光时间（本实验中为5分钟），并在左耳区域发现一个微弱的信号点，其强度从第7天到第14天逐渐增强（图C）。此外，在动物的下颌和鼻...

人巨细胞病毒（HCMV）感染新生儿是导致智力障碍的重要原因，然而病毒引发致病的分子机制仍不甚清楚。为了研究脑部感染的动态过程，我们改进了整体动物 体内 利用成像技术对感染荧光素酶重组病毒的新生儿进行时间过程分析。

人巨细胞病毒（HCMV 或 HHV-5）是一种对免疫功能低下个体具有生命威胁的病原体。在先天性或新生儿感染情况下，该病毒……

本实验的总体目标是通过对新生小鼠进行活体成像，研究发光型巨细胞病毒的播散情况。首先，从病毒储备液中配制适当浓度的病毒稀释液。随后，将发光型小鼠巨细胞病毒（MCMV）注射至新生小鼠的腹腔内。注射后不同时间点，对仔鼠进行麻醉，并注射荧光素酶底物 Lucifer，随后进行活体成像。最终，通过活体成像显示并定量分析病毒在腹腔及中枢神经系统中的复制与播散情况。与现有的方法（如动物安乐死后对器官进行病毒过滤）相比，该技术的主要优势在于耗时更短、资源消耗更少。本次实验操作将由我实验室的技术员Mr. Il Macan进行演示。本研究中使用的病毒为表达荧光素酶的MCMV毒株，该毒株来源于Ulrich Kowski实验室。为了扩增该病毒株，将病毒加入无血清培养基中培养的细胞，在37摄氏度条件下孵育。一小时后，移除上清液，并更换为添加了10%胎牛血清的DMEM培养基。五天后收集培养物，并将分装样品储存在-80摄氏度条件下。保存至后续使用。通过噬斑实验测定病毒悬液滴度后，将样品稀释至每50微升含50 pfu的DMEM中，并置于冰上直至使用。注射操作应在出生后4至20小时内的新生小鼠中进行。在接触幼鼠前，需戴手套操作鼠窝及粪便。为避免引入可能刺激母鼠产生应激反应的外来气味而进行练习注射，可用胰岛素注射器吸取1%亚甲蓝溶液（溶于DPBS中）。准备就绪后，如图所示，用手抓住新生鼠背部皮肤，使其腹部朝上。将针头从四肢下方刺入，轻轻推入皮下，进入腹腔。当针尖到达正确位置后，注入蓝色甲基染料。接着，缓慢拔出针头，并擦去注射部位的任何血液。注射完成后，将新生幼鼠放回其原代饲养笼中。成功完成练习注射后，使用先前制备的病毒悬液重复此操作。在注射后第七天采集图像，操作新生小鼠时需谨慎，操作方法如前所述。每只小鼠注射麻醉剂与荧光素（Lucifer）的混合物后，等待12至15分钟，使荧光素达到最大发光强度。确保成像设备采集室平台已预热，以维持小鼠正常体温。待幼鼠麻醉并标记以供识别后，即可将其放入成像系统中。首先，进行全身体发光信号的采集。由于病毒已在多个靶器官中复制，曝光时间应较短。此处采集时间为10至20秒。在一次成像过程中，先对多个动物进行低分辨率成像会很有帮助，然后移动平台靠近目标，以便在解剖后聚焦于某一个动物的特定部位或分离的器官。若仅需获取头部的光信号，可用厚的深色纸张遮盖身体其余部分以屏蔽光子，随后在相同条件下进行5到10分钟的成像，并对动物的对侧重复此操作。成像完成后，将幼鼠放回加热的笼子中，以在麻醉状态下维持其体温。这些图像分别是在感染后的第7、9、11和14天采集的，动物体内的总体病毒滴度随时间推移呈下降趋势。在此示例中，身体被覆盖，仅头部暴露。这显示出在左耳水平处存在一个微弱的信号点，其强度在第7天至第14天之间逐渐增强，表明MCMV向脑部的播散可以在活体中进行动态观察。通过此方法，可

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使用包被的生物发光细菌建立新生小鼠感染模型

本视频演示了脑室内注射以研究小鼠巨细胞病毒（MCMV）在新生小鼠脑组织中的分布。经基因工程改造后可表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）以便观察的MCMV，被注射至幼鼠脑的侧脑室。注射后的病毒通过脑脊液循环，感染脑室周围区域的细胞，包括边缘带、脉络丛和室下区。...

通过脑室内注射分析新生小鼠脑内小鼠巨细胞病毒分布

本文展示了一种通过向新生小鼠脑内脑室内注射腺相关病毒实现广泛神经元转导的技术。该方法可快速、简便地实现病毒递送的转基因在生命全程中的持续表达。...

新生小鼠脑室内病毒注射以实现持续且广泛的神经元转导

儿科疾病的动物模型可能出现早期发病和快速进展的病情。对幼年小鼠模型进行具有临床相关性的治疗给药在技术上可能较为困难。本方案描述了一种针对出生后前两天内的新生小鼠进行的无创静脉注射方法。...

新生小鼠静脉注射

在此，我们介绍一种向新生小鼠脑内进行脑室内和血管内注射病毒颗粒或荧光微珠的简单方法。通过显微镜观察或 原位 杂交。...

新生小鼠脑室内及血管内注射病毒颗粒与荧光微珠

新生小鼠感染发光的 E. coli O1:K1:H7...

一种革兰氏阴性菌败血症的新生儿影像学模型

建立小鼠阴道上行感染、早产及新生儿发病模型

本方案展示了通过颞静脉注射将儿童肿瘤细胞经静脉递送至新生小鼠，从而实现对生命早期抗肿瘤免疫反应的精确且可重复的建模。该方法可用于评估在新生儿期施加干预措施（如免疫调节或治疗）所产生的影响。...

一种用于评估生命早期免疫活性抗肿瘤细胞的新生儿静脉移植模型

了解如何使用体内成像技术监测实验小鼠巨细胞病毒在新生小鼠中的感染动态。该方法利用荧光素酶重组病毒实时追踪病毒在中枢神经系统和腹腔中的复制与传播过程。

使用体内利用成像技术监测新生小鼠巨细胞病毒感染进展

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使用 体内 利用成像技术监测新生小鼠巨细胞病毒感染进展

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