通过遗传操作调控小鼠发育期下丘脑 在子宫内 电穿孔

本实验的总体目标是将质粒DNA转染至子宫内发育中的小鼠胚胎下丘脑，以激活或抑制目的基因的功能。该过程首先通过剖腹手术使怀孕小鼠麻醉并暴露子宫，第二步是将DNA溶液注射到胚胎脑的第三脑室。

接下来，将正极电极置于子宫内胎盘与胚胎头部之间，负极电极置于子宫外表面，施加电脉冲。最后一步是在六天后取出转染的胚胎脑组织。

最终，使用荧光显微镜分析转染细胞的表型改变，包括细胞数量、形态、位置、标志物表达等。与现有的病毒转染等方法相比，该技术的主要优势在于：第一，无需特殊的防护措施；第二，能够实现对特定区域的靶向操作；第三，通过Ute电穿孔技术，候选基因的筛选速度更快。

通常，初次接触该方法的研究者会遇到困难，因为将DNA溶液注射到第三脑室并正确放置针电极需要较高的手动技巧以及一定的操作经验。该方法有助于解答下丘脑发育领域的相关问题，特别是有关细胞迁移以及各个区域和核团如何在遗传上被特异性指定的问题。开始实验前，应先拉制一些高质量的玻璃微毛细管，这对于降低因羊水流失导致的早期高流产率至关重要。

为制备DNA，将纯化的无内毒素血浆DNA溶解于含有0.1%快绿的磷酸盐缓冲液（PBS）中，终浓度为每微升1至2微克。快绿可使注射液在胚胎脑室中可见。接下来，将10微升DNA溶液吸入玻璃微量移液管中。

然后将玻璃微量移液管连接至显微注射系统或口吸移液装置。在此步骤中，准备好带有加热垫的手术台以及手术器械。打开冷光源以方便观察胚胎。随后使用玻璃珠灭菌器对手术工具进行消毒。

接下来，使用异氟烷麻醉一只怀孕的小鼠。小鼠麻醉后，将其眼睛涂抹眼膏以防止干燥。随后在其面部佩戴面罩，以持续维持麻醉状态。

现在将小鼠腹部朝上放置于加热垫上。用胶带固定其四肢以固定小鼠身体。通过捏其尾巴检查是否完全麻醉，以确认麻醉效果。

然后剃除腹部表面的毛发，并用碘溶液进行消毒。在腹部皮肤上做一个长约1至1.5厘米的纵向切口。随后，切开腹膜。

接下来，将纱布围绕切口放置。用 PBS 冲洗纱布。用钝头镊子小心地拉出一侧子宫角使其暴露。

避免用力牵拉子宫肌层或子宫。由于子宫内压力过高会增加注射时胚胎液流失的风险，从而导致流产。随后将子宫角置于经 PBS 浸润的纱布上，并每隔几分钟用 PBS 冲洗一次，以保持其湿润。

现在，在显微镜下，以能够观察到脑室的方式固定子宫。不要对处于不利位置的胚胎进行大幅度调整，这只会增加流产的风险。

从顶部观察胚胎的头部，找到左右皮层半球之间裂隙的缝隙位置。这两个半球易于分辨，其内部的侧脑室通常可被识别为颜色稍深的结构。若发现胚胎已处于适合DNA注射的理想方位，则可直接刺穿子宫壁并立即进入第三脑室。

用玻璃微量移液器吸取先前制备好的 DNA，将其以 45 度角对准子宫壁，在大脑半球间裂的头端处穿刺，穿透深度约为 1 毫米。通过这种方式，玻璃微量移液器的尖端将进入脑部第三脑室，而非侧脑室。随后向第三脑室注射约 1 微升的 DNA 溶液，在注射成功的情况下，绿色液体将充满脑室。对同一子宫角内的所有胚胎重复此操作。

这将使DNA溶液有足够时间与脑室液充分混合，并扩散至整个神经上皮。现在打开电穿孔仪，根据胚胎的发育时期调整参数设置。使用不锈钢针状电极作为正极，圆形平板电极作为负极，选择背侧朝上的胚胎进行电穿孔。

然后将针电极的尖端向下穿过子宫壁，在胚胎头部附近、羊膜囊与胎盘之间的位置刺入。接着用另一只手的食指作为顶推支点。电极尖端约有5毫米应位于羊膜囊与子宫壁之间，大致与中脑水平相当。

由于这是靶向电极，其位置将决定下丘脑神经上皮的哪个部分最有可能被转染。接下来，用另一只手将圆形平板电极放置在子宫壁外侧、胚胎头部的对侧。然后轻轻将胚胎夹在两个电极之间。

使用脚踏开关施加电压。随后，用另一只手的食指固定住子宫，同时缓慢将针电极从子宫中抽出。如果羊水通过穿刺孔流失，胚胎通常会发生流产。

所有胚胎注射和电穿孔完成后，非常小心地将子宫放回小鼠腹腔内，并将其恢复至最初的位置。然后在关闭腹腔前用生理盐水润湿腹膜腔。使用外科肠线缝合腹膜，再使用更耐张的缝线缝合皮肤。

用碘溶液对腹部表面进行消毒，并皮下注射非甾体类抗炎药以缓解疼痛。随后，将母鼠从麻醉机中取出，放入由加热垫保温的笼子中。密切监测小鼠，直至其完全从麻醉中恢复，并每天检查，确保其术后恢复良好，无感染或疼痛迹象。

在此步骤中，根据所需的分析时间点收集胚胎或新生鼠。挑选出已注射 DNA 并进行电穿孔的胚胎，在体视显微镜下解剖其脑组织，然后在相应区域检测绿色荧光信号。

为了分析所选胚胎的脑组织，先用4%多聚甲醛对组织进行短时间固定。接着，将其包埋于4%琼脂或明胶白蛋白中。然后在振动切片机上对脑组织进行切片。

这些图像显示了在 E 12.5 时期通过宫内转染携带荧光报告基因 GFP 或 CFP 的质粒 DNA 后的下丘脑。这是一张矢状切面图，显示下丘脑从头侧到尾侧的转染情况，而此处的横切面图则显示沿内侧-外侧轴不同水平的标记细胞。该矢状切面图显示了特异性转染的乳头体及其特征性的轴突树标记，而此横切面图的对侧则显示一条标记带，对应于 E 12.5 时期出生的神经元。

为了更仔细地分析切片，制备了与从乳头体隐窝发出的放射状胶质细胞突起平面平行的水平切片。通过抗GFP抗体，在E18.5日鉴定出E12.5日转染神经上皮后由其产生的ambi O神经元。

在此示例中，抗体标记了一组特定的 MBO 细胞。该细胞群位于两个未标记的外侧和内侧 MBO 区域之间，分别对应于在 E12.5 之前和之后出生的 MBO 神经元，并且与抗 nestin 抗体的共染色结果一致。红色显示了单个标记神经元沿神经上皮放射状胶质细胞突起迁移的模式。一旦掌握，若操作得当，该技术可在 30 分钟内完成。

观看本视频后，您应能充分掌握如何将 DNA 注射至第三脑室，以及如何将针头作为正极置于胚胎头部与胎盘之间，从而高效地靶向下丘脑。完成该操作后，还可采用免疫组织化学或原位杂交等其他方法，进一步探究转染神经元表型的相关问题。