Name: 遗传操纵鼠标的发展下丘脑通过在子宫内电穿孔 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 学习小鼠胚胎下丘脑在子宫内电穿孔技术，通过向第三脑室注射DNA溶液并施加电脉冲，实现基因功能的激活或抑制。该方法为神经发育研究提供了高效的遗传操作工具。

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本工作由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）资助。

1. 注射用 DNA 和玻璃微量移液管的制备
<ol>
	<li>高质量的玻璃微电极对于减少因羊水流失导致的早期高流产率至关重要。拉制玻璃微电极的操作步骤已有详细记录13,18,25。使用直径为1.2 mm的毛细管，在传统的Sutter P-97仪器中按以下参数拉制：P=500；Heat=300；Pull=40；Velocity=50；Time=50。拉制仪应配备3 mm的“槽型”灯丝（Sutter Instrument FT330B）。我们发现使用2 mm尺寸的灯丝所获得的结果不够理想。另一方面，对微电极尖端进行斜面打磨似乎并未改善实验效果。</li>
	<li>将纯化、无内毒素的质粒DNA溶解于含0.1%快绿（Fast Green）的磷酸盐缓冲液（PBS，细胞培养级）中，终浓度为1至2 μg/μl。快绿可使注射液在胚胎脑室中清晰可见。</li>
	<li>将10 μl DNA溶液吸入玻璃微电极中。</li>
	<li>将玻璃微电极连接至注射系统（Pico Pump）或口吸管装置。</li>
</ol>
2. 麻醉
在手术台上准备好加热垫和手术器械。打开冷光源以方便观察胚胎。使用玻璃珠灭菌器等工具对手术器械进行消毒。
本方案可采用三种不同的麻醉方法（参见讨论部分）。此处我们将描述我们认为最佳的一种方法，即使用异氟烷吸入进行麻醉诱导（流速0.5 L/min）和维持（流速1 L/min）。
<ol>
	<li>将怀孕的小鼠放入一个小型透明容器中（确保小鼠可见），并通过一段短管将该容器连接至Komesaroff Mark 5麻醉装置。</li>
	<li>向蒸发器中加入异氟烷，然后打开连接在装置上的氧气瓶。向盛有小鼠的容器内吹入一到两次异氟烷/氧气混合气体（0.5 L/min），观察小鼠是否进入麻醉状态。</li>
	<li>取出小鼠，用眼膏覆盖其眼睛以防止干燥，并立即在其头部佩戴气流麻醉面罩。</li>
</ol>
3. 剖腹手术
<ol>
	<li>将小鼠仰卧于加热垫上（否则其体温会迅速下降，降低复苏几率），用胶带将其四肢固定于两侧以固定身体。通过检查对反射刺激的反应是否消失来评估麻醉深度例如 脚趾或尾部施加牢固压力的夹捏）</li>
	<li>剃除腹部表面毛发，并使用聚维酮碘（Braunoderm）进行消毒。</li>
	<li>在腹部皮肤上做一个纵向切口（1至1.5 cm长），然后切开腹膜。将棉纱布置于切口周围。使一侧子宫角显露，用钝头镊子小心将其拉出，放置于经PBS冲洗过的纱布上。频繁用PBS冲洗子宫，以保持其始终湿润图2A 和 2B在整个操作过程中，应避免牵拉子宫阔韧带或子宫过紧，因为子宫内的高压会传递至胚胎，增加注射时液体流失的风险，从而导致流产。</li>
</ol>
4. 脑室 DNA 注射
<ol>
	<li>以能够观察到脑室的方式持握子宫。不要过度调整位置不利的胚胎——这样做只会增加流产的风险。</li>
	<li>从上方观察胚胎头部，视觉上定位左右大脑皮层半球之间的缝隙或裂隙。这两个半球易于分辨，其内部的侧脑室（不应作为靶点）通常呈现为略深的区域。若发现胚胎方位完全适合进行DNA注射（图2C和2D），可直接刺穿子宫壁并进入第三脑室。将玻璃微量移液管与子宫壁呈45°角，在皮层半球间裂隙的头端穿刺进入约1 mm深度。通过这种方式，玻璃微量移液管的尖端将进入脑部的第三脑室（而非侧脑室）（图2C和2D）。对于方位欠佳的胚胎，可先在胚胎头部附近以45°角刺穿子宫壁，将微量移液管尖端置于皮层半球之间的正确位置，然后再穿刺进入脑组织。向第三脑室内注射约1 μl DNA溶液（成功的注射会使绿色液体充满脑室）。对同一子宫角内的所有胚胎重复相同操作。这有助于DNA溶液与脑室内液体充分混合，并均匀扩散至整个神经上皮。</li>
</ol>
5. 靶向下丘脑进行电穿孔
<ol>
	<li>打开电穿孔仪，根据胚胎发育天数调整参数（对于E12.5胚胎，使用5次方波脉冲，50 V，通电50毫秒/间歇950毫秒）。正极使用不锈钢针状电极（CUY550-10），负极使用圆形平板电极（CUY700P4L）。（电极尺寸必须小于胚胎，否则电流将绕过胚胎而无法通过胚胎内部，这一点至关重要。）</li>
	<li>选择背侧朝上的胚胎进行电穿孔即 朝向实验者）（大多数胚胎均为此朝向），剔除朝向不利的胚胎。此时可用经乙醇消毒的手指或戴手套接触子宫。然而，若使用镊子夹持子宫，会影响电穿孔过程中电流的流动。</li>
	<li>用针电极的尖端在胚胎头部位置，于羊膜囊与胎盘之间的子宫壁处向下穿刺。另一只手的食指作为抵住子宫壁的支撑点。此时，电极尖端约有5毫米应位于羊膜囊与子宫壁之间，高度大致与中脑水平相当。图2E 和 2F）。请注意，这是“靶向电极”，因此其位置将决定下丘脑神经上皮的哪个部分最有可能被转染。胚胎需在电极之间非常轻柔地“挤压”。</li>
	<li>另一只手将圆形平板电极置于子宫壁外，与胚胎头部相对的一侧图2E 和 2G).</li>
	<li>使用脚踏开关施加电压（50 V，开启50毫秒，关闭950毫秒，5次方波脉冲）。</li>
	<li>用另一只手的食指固定住子宫，同时缓慢将针电极从子宫中抽出——如果羊水从穿刺处流失，胚胎通常会发生流产。对所有胚胎重复此操作。</li>
	<li>将子宫角放回腹腔，并在另一侧子宫角重复注射和电穿孔操作。</li>
</ol>
6. 完成手术
<ol>
	<li>所有胚胎注射并电穿孔后，将子宫非常小心地放回腹腔，保持其原来的位置，并在关闭腹腔前用生理盐水湿润腹膜腔。</li>
	<li>使用外科肠线缝合腹膜（Vicryl Polyglactin 910, 5-0, Ethicon V4914）。皮肤缝合采用“间断缝合”方法，使用更坚固的缝线（Supramid Nylon, 6-0, Serag Wiessner TO 07171L）。</li>
	<li>用聚维酮碘（Braunoderm）消毒腹部表面，并皮下注射非甾体类抗炎药（e.g. 将Rimadyl溶于0.9% NaCl中，配制成1:10溶液，注射100 μl）或更优选择——阿片类药物如布托啡诺（Temgesic，在0.9% NaCl中按0.05至0.1 mg/kg体重剂量）以缓解疼痛。</li>
	<li>将母鼠从麻醉机中取出，置于由加热垫保温的笼子中。持续监测小鼠，直至其完全从麻醉中恢复。之后每日检查动物，确保其术后恢复良好，无感染或疼痛迹象。</li>
</ol>
7. 结果分析
<ol>
	<li>根据所需的分析时间点收集胚胎（或出生后样本）。出生后1至2天的小鼠通过断头法处死。</li>
	<li>根据先前的电穿孔标记分离每个胚胎。在体视显微镜下解剖脑组织，并在显微镜下检查目标区域是否存在绿色荧光信号（来自GFP报告基因）。</li>
	<li>所选脑组织可进行“新鲜”分析：将组织在4%多聚甲醛中短时间固定，包埋于4%琼脂糖或明胶-白蛋白中，然后使用振动切片机进行切片（图3）。如需更详细的免疫组织化学分析（图4），则先将脑组织在30%蔗糖溶液中进行冷冻保护，再包埋于OCT包埋剂（Tissue Tek）中，随后在恒冷切片机中切取20 μm厚的切片。</li>
</ol>

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<li>Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., Michnick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+for+stable+expression+of+foreign+genes+in+mammalian+cells+by+use+of+the+untranslated+leader+sequence+from+EMC+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus.</a> Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Londrigan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+promoters+for+driving+efficient+transgene+expression+in+neonatal+porcine+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets.</a> Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

关于麻醉：由于 在子宫内 将电穿孔技术应用于下丘脑在技术上可能较为困难，且需要较长的麻醉时间，因此我们更倾向于通过给予氧气与异氟烷混合气体来诱导并维持麻醉。根据我们的经验，动物以这种方式至少可维持适宜的麻醉状态达一小时，母体恢复迅速，且胚胎存活率有所提高。其他麻醉方法也可选用。最简单的方法是通过腹腔注射“三联麻醉剂”来诱导和维持麻醉，剂量为每公斤体重2.5 ml，该混合液包含氯胺酮（25 mg/ml）、赛拉嗪（1.2 mg/ml）和乙酰丙嗪（0.35 mg/ml）溶于0.9%无菌NaCl溶液中。仅使用该混合液并按此处推荐剂量给药时，可诱导约30分钟的麻醉（在某些情况下可达45分钟），这通常已足够满足 在子宫内 在E12.5时期通过侧脑室注射对大脑皮层进行电穿孔。该方法的优势在于完全无需使用麻醉设备及其他辅助装置。然而，若手术时间较长，则不推荐采用此类腹腔麻醉，因为在已麻醉动物体内追加注射以延长麻醉时间常导致动物死亡。也可将腹腔麻醉与吸入麻醉联合使用，即首先注射“三联制剂”（如前所述）以诱导麻醉，随后通过吸入异氟烷/氧气维持麻醉状态。尽管采用此特定方法可按需维持麻醉时间，但孕鼠术后恢复情况不如单独使用吸...

对小鼠胚胎大脑进行遗传操作是研究发育调控的首选方法。然而，构建突变小鼠品系的过程耗时且昂贵。一种在哺乳动物大脑发育中的神经元内引入特定遗传改变的有力方法是子宫内电穿孔（in utero electroporation）。该技术的基本原理是通过电脉冲将DNA转染至胚胎大脑的神经上皮，随后让胚胎继续存活一段时间，之后收集大脑并检测可能出现的新的、具有信息价值的表型。通过这种方法，实验人员几乎可以立即验证假设，而无需等待漫长的突变小鼠制备周期。	
	将DNA转染到发育中的胚胎始于鸡胚的in ovo电穿孔技术1。小鼠中的关键概念验证实验最初在体外培养中完成2。随后不久，该技术首次在小鼠体内（in utero）应用的报道相继出现3,4。	
	主要问题是如何在不杀死胚胎或母体的情况下，对子宫内发育的胚胎大脑进行转染。in utero 所需的手术操作（剖腹手术、注射、电穿孔）需要较长的学习训练周期。一旦掌握手术技术，使胚胎存活率达到可接受水平后，下一个关键问题是：哪些脑区可以被靶向？不出所料，最早发表的关于in utero电穿孔技术的研究成果均集中于皮层发育5-9。目前大多数使用该技术的文献仍以皮层为主要研究对象，因为小鼠发育中大脑最易于进行手术操作的区域就是大脑皮层（图1）。皮层内in utero电穿孔的操作流程已有文字描述10和视频演示11-14。该技术的一种改进版本可用于靶向端脑的腹侧区域——基底神经节15。	
	除了端脑之外，间脑（传统上分为丘脑和下丘脑）是前脑中较难到达的一个区域。仅有少数论文报道了针对其背侧最易接近部分——丘脑的靶向操作16-19。	
	下丘脑是前脑最腹侧的部分，因此也是从背侧表面（皮层）位置最深的部分图1）。这一区域对于致力于对小鼠大脑进行遗传操作的研究人员而言，仍然是一个巨大的挑战 在子宫内据我们所知，仅有极少数文章报道了相关结果 在子宫内 转染小鼠下丘脑 20,21然而，下丘脑的功能重要性不容低估，因为它调控着摄食与饮水、交配、繁殖及育幼等行为。22此外，下丘脑发育的改变可能导致成年后出现肥胖、高血压、糖尿病和性早熟等疾病。23在发育过程中能够对下丘脑进行遗传学改造，将为理解其功能提供一种极为强大的工具。	
	我们在此使用的妊娠小鼠开腹手术基本外科方案与其他方案中所述相似11,13,14,24。为完整起见，我们将在下文简要描述。然而，本操作的关键在于麻醉方式、注射部位、电极类型，以及正极相对于胚胎头部的插入方式和位置。我们倾向于通过气体吸入而非单纯的腹腔注射进行麻醉诱导与维持，因为前者能够满足困难手术所需的较长麻醉时间。异氟烷吸入麻醉可实现更快的苏醒，通常母鼠在术后数分钟内即可恢复正常行为。使用玻璃微量移液管注射DNA溶液时，最方便的注射位点是侧脑室，但该位置完全不适用于下丘脑的电穿孔。直接注入第三脑室对于靶向深部间脑结构至关重要。自E12.0或E12.5起，使用市售的标准电极即可实现下丘脑的转染。我们发现日本千叶市Nepa Gene公司生产的部分电极特别适用于此目的。	
	通过我们的操作，可实现下丘脑神经上皮的全层转染或根据电极方向决定的部分区域转染。本文通过转染哺乳体—— arguably 所有下丘脑核团中最深且位置最隐匿的核团——来演示该技术。此外，我们还展示了在细胞分辨率水平上对转染细胞进行的详细组织学分析。	
	A comparison of 在子宫内 电穿孔与其他小鼠发育期脑部转染方法的比较 在子宫内 可在讨论部分找到。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>乙酰丙嗪</td><td>赛诺菲有限公司</td><td></td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Baxter</td><td>HDG9623</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Pharma GmbH</td><td></td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>快绿</td><td>Fluka</td><td>44715</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rimadyl</td><td>辉瑞</td><td></td><td>非甾体抗炎</td></tr><tr><td>Braunoderm</td><td>布劳恩</td><td>3887138</td><td>聚维酮碘</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>丁丙诺啡（Temgesic）</td><td>Essex Pharma</td><td></td><td>阿片类镇痛药</td></tr><tr><td>眼膏</td><td>泛眼科学</td><td>7136926</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>拜耳</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&lt;强&gt;设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>麻醉设备 Komesaroff Mark-5</td><td>Medical Developments Australia</td><td>ACN 004 903 682</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>毛细管拉制仪 P-97</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Compresstome</td><td>Precisionary Instr.</td><td>VF-300</td><td>振动切片机类型装置</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>蔡司</td><td>LSM700</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>电穿孔仪</td><td>Nepa Gene Co. Ltd.</td><td>CUY21EDIT</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>电极 1</td><td>Nepa Gene Co. Ltd.</td><td>CUY550-10</td><td>不锈钢针电极，10 mm 尖端，0.5 mm 直径</td></tr><tr><td>电极 2</td><td>Nepa Gene Co. Ltd.</td><td>CUY700P4L</td><td>直径4 mm圆形铂金盖板</td></tr><tr><td>光纤冷光源</td><td>Leica</td><td>KL2500 LCD</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>哈佛仪器</td><td>GC120T-15</td><td>1. 外径2 mm × 内径0.94 mm</td></tr><tr><td>玻璃珠灭菌器</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST250</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>加热垫</td><td>哈佛仪器</td><td>py872-5272</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>注射装置</td><td>World Precision Instruments</td><td>Pneumatic Pico Pump PV820</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>涂有缝合线的Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>V4914</td><td>腹膜缝合</td></tr><tr><td>缝合线 Supramid</td><td>Serag Wiessner</td><td>TO07171L</td><td>皮肤缝合</td></tr></tbody></table>

通过遗传操作调控小鼠发育期下丘脑 在子宫内 电穿孔

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

对发育中哺乳动物大脑特定区域进行遗传学改造是一种非常强大的实验方法。然而，培育新的小鼠突变体通常耗时较长且令人困扰。已有研究表明，能够进入发育中小鼠大脑的特定区域 在子宫内 术后生存情况良好是可能的。然而，有关该手术方法的报道几乎仅限于发育中大脑最表层且最容易触及的区域， 即 大脑皮层。丘脑是一个更狭窄且位置更偏内侧的区域，其靶向操作已被证明更为困难。对更深层核团（尤其是下丘脑核团）进行转染极具挑战性，因此相关研究成果极少。本文中，我们展示了一种通过电穿孔技术靶向整个下丘脑神经上皮或其部分区域（下丘脑区域）进行转染的操作流程。本方法的关键在于延长麻醉时间、向第三脑室注射以及选择合适类型并准确定位电极。此外，我们还展示了靶向最深部下丘脑核团——乳头体，并对其进行后续组织学分析的结果。

根据大鼠的出生日期分析，大多数下丘脑神经元的生成时间在E11.5至E15.2之间，这一时期对应于发育周期相对较短的小鼠胚胎期26，并已转换至小鼠发育时间轴27,28。下丘脑神经发生的高峰期出现在E12.529-31。因此，在本研究选定的转染时间点（E12.5），在任意给定的吻侧-尾侧水平上，均可标记到大量下丘脑神经元。
在 E18.5 时期对较厚的振动切片机切片进行分析（图 3A 和 3B）显示，下丘脑神经上皮的整个头-尾向延伸区域均可被电穿孔标记（图 3A）。在任一特定发育阶段，所有中-侧向水平的神经元均可被标记（图 3B），这与谱系研究结果一致32。乳头体（MBO）是起源于前脑最腹侧且最尾端区域一个隐窝内衬神经上皮的神经元核团。这一位置使得乳头体在原则上极难靶向。功能上，乳头体是记忆巩固的关键结构，其病理性退化可导致顺行性遗忘症33。...

尽管下丘脑在功能和医学上具有重要意义， 在子宫内 其发育过程的遗传操作鲜有尝试。本文展示了一种详细的实验流程 在子宫内 电穿孔转染小鼠下丘脑，并展示全脑及部分（区域）下丘脑转染的代表性结果。

对发育中哺乳动物大脑特定区域进行遗传学改造是一种非常强大的实验方法。然而，生成新的小鼠……

本实验的总体目标是将质粒DNA转染至子宫内发育中的小鼠胚胎下丘脑，以激活或抑制目的基因的功能。该过程首先通过剖腹手术使怀孕小鼠麻醉并暴露子宫，第二步是将DNA溶液注射到胚胎脑的第三脑室。接下来，将正极电极置于子宫内胎盘与胚胎头部之间，负极电极置于子宫外表面，施加电脉冲。最后一步是在六天后取出转染的胚胎脑组织。最终，使用荧光显微镜分析转染细胞的表型改变，包括细胞数量、形态、位置、标志物表达等。与现有的病毒转染等方法相比，该技术的主要优势在于：第一，无需特殊的防护措施；第二，能够实现对特定区域的靶向操作；第三，通过Ute电穿孔技术，候选基因的筛选速度更快。通常，初次接触该方法的研究者会遇到困难，因为将DNA溶液注射到第三脑室并正确放置针电极需要较高的手动技巧以及一定的操作经验。该方法有助于解答下丘脑发育领域的相关问题，特别是有关细胞迁移以及各个区域和核团如何在遗传上被特异性指定的问题。开始实验前，应先拉制一些高质量的玻璃微毛细管，这对于降低因羊水流失导致的早期高流产率至关重要。为制备DNA，将纯化的无内毒素血浆DNA溶解于含有0.1%快绿的磷酸盐缓冲液（PBS）中，终浓度为每微升1至2微克。快绿可使注射液在胚胎脑室中可见。接下来，将10微升DNA溶液吸入玻璃微量移液管中。然后将玻璃微量移液管连接至显微注射系统或口吸移液装置。在此步骤中，准备好带有加热垫的手术台以及手术器械。打开冷光源以方便观察胚胎。随后使用玻璃珠灭菌器对手术工具进行消毒。接下来，使用异氟烷麻醉一只怀孕的小鼠。小鼠麻醉后，将其眼睛涂抹眼膏以防止干燥。随后在其面部佩戴面罩，以持续维持麻醉状态。现在将小鼠腹部朝上放置于加热垫上。用胶带固定其四肢以固定小鼠身体。通过捏其尾巴检查是否完全麻醉，以确认麻醉效果。然后剃除腹部表面的毛发，并用碘溶液进行消毒。在腹部皮肤上做一个长约1至1.5厘米的纵向切口。随后，切开腹膜。接下来，将纱布围绕切口放置。用 PBS 冲洗纱布。用钝头镊子小心地拉出一侧子宫角使其暴露。避免用力牵拉子宫肌层或子宫。由于子宫内压力过高会增加注射时胚胎液流失的风险，从而导致流产。随后将子宫角置于经 PBS 浸润的纱布上，并每隔几分钟用 PBS 冲洗一次，以保持其湿润。现在，在显微镜下，以能够观察到脑室的方式固定子宫。不要对处于不利位置的胚胎进行大幅度调整，这只会增加流产的风险。从顶部观察胚胎的头部，找到左右皮层半球之间裂隙的缝隙位置。这两个半球易于分辨，其内部的侧脑室通常可被识别为颜色稍深的结构。若发现胚胎已处于适合DNA注射的理想方位，则可直接刺穿子宫壁并立即进入第三脑室。用玻璃微量移液器吸取先前制备好的 DNA，将其以 45 度角对准子宫壁，在大脑半球间裂的头端处穿刺，穿透深度约为 1 毫米。通过这种方式，玻璃微量移液器的尖端将进入脑部第三脑室，而非侧脑室。随后向第三脑室注射约 1 微升的 DNA 溶液，在注射成功的情况下，绿色液体将充满脑室。对同一子宫角内的所有胚胎重复此操作。这将使DNA溶液有足够时间与脑室液充分混合，并扩散至整个神经上皮。现在打开电穿孔仪，根据胚胎的发育时期调整参数设置。使用不锈钢针状电极作为正极，圆形平板电极作为负极，选择背侧朝上的胚胎进行电穿孔。然后将针电极的尖端向下穿过子宫壁，在胚胎头部附近、羊膜囊与胎盘之间的位置刺入。接着用另一只手的食指作为顶推支点。电极尖端约有5毫米应位于羊膜囊与子宫壁之间，大致与中脑水平相当。由于这是靶向电极，其位置将决定下丘脑神经上皮的哪个部分最有可能被转染。接下来，用另一只手将圆形平板电极放置在子宫壁外侧、胚胎头部的对侧。然后轻轻将胚胎夹在两个电极之间。使用脚踏开关施加电压。随后，用另一只手的食指固定住子宫，同时缓慢将针电极从子宫中抽出。如果羊水通过穿刺孔流失，胚胎通常会发生流产。所有胚胎注射和电穿孔完成后，非常小心地将子宫放回小鼠腹腔内，并将其恢复至最初的位置。然后在关闭腹腔前用生理盐水润湿腹膜腔。使用外科肠线缝合腹膜，再使用更耐张的缝线缝合皮肤。用碘溶液对腹部表面进行消毒，并皮下注射非甾体类抗炎药以缓解疼痛。随后，将母鼠从麻醉机中取出，放入由加热垫保温的笼子中。密切监测小鼠，直至其完全从麻醉中恢复，并每天检查，确保其术后恢复良好，无感染或疼痛迹象。在此步骤中，根据所需的分析时间点收集胚胎或新生鼠。挑选出已注射 DNA 并进行电穿孔的胚胎，在体视显微镜下解剖其脑组织，然后在相应区域检测绿色荧光信号。为了分析所选胚胎的脑组织，先用4%多聚甲醛对组织进行短时间固定。接着，将其包埋于4%琼脂或明胶白蛋白中。然后在振动切片机上对脑组织进行切片。这些图像显示了在 E 12.5 时期通过宫内转染携带荧光报告基因 GFP 或 CFP 的质粒 DNA 后的下丘脑。这是一张矢状切面图，显示下丘脑从头侧到尾侧的转染情况，而此处的横切面图则显示沿内侧-外侧轴不同水平的标记细胞。该矢状切面图显示了特异性转染的乳头体及其特征性的轴突树标记，而此横切面图的对侧则显示一条标记带，对应于 E 12.5 时期出生的神经元。为了更仔细地分析切片，制备了与从乳头体隐窝发出的放射状胶质细胞突起平面平行的水平切片。通过抗GFP抗体，在E18.5日鉴定出E12.5日转染神经上皮后由其产生的ambi O神经元。在此示例中，抗体标记了一组特定的 MBO 细胞。该细胞群位于两个未标记的外侧和内侧 MBO 区域之间，分别对应于在 E12.5 之前和之后出生的 MBO 神经元，并且与抗 nestin 抗体的共染色结果一致。红色显示了单个标记神经元沿神经上皮放射状胶质细胞突起迁移的模式。一旦掌握，若操作得当，该技术可在 30 分钟内完成。观看本视频后，您应能充分掌握如何将 DNA 注射至第三脑室，以及如何将针头作为正极置于胚胎头部与胎盘之间，从而高效地靶向下丘脑。完成该操作后，还可采用免疫组织化学或原位杂交等其他方法，进一步探究转染神经元表型的相关问题。

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遗传操纵鼠标的发展下丘脑通过<em&gt;在子宫内</em&gt;电穿孔

子宫内活体注射与电穿孔转染胚胎小鼠新皮层是一种强大的技术，可用于操控单个神经前体细胞……...

E15小鼠胚胎的子宫内脑室内注射与电穿孔技术

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小鼠 在子宫内 电穿孔：可控时空基因转染

体外电穿孔转染中期小鼠胚胎菱脑唇下部

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利用可视化与遗传学操作技术研究小鼠大脑皮层和海马中的树突及树突棘 在子宫内 电穿孔

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利用双侧子宫内电穿孔技术研究基因对啮齿类动物行为影响的实验流程

在本实验方案中，我们描述了如何在E7.5时期向小鼠羊膜腔注射慢病毒，从而实现整个神经板的均匀转导，同时对胚胎存活率或发育过程造成极小的不利影响。...

小鼠胚胎7.5天在体纳米注射靶向神经板（NEPTUNE）技术

学习小鼠胚胎下丘脑在子宫内电穿孔技术，通过向第三脑室注射DNA溶液并施加电脉冲，实现基因功能的激活或抑制。该方法为神经发育研究提供了高效的遗传操作工具。

通过遗传操作调控小鼠发育期下丘脑在子宫内电穿孔

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