遗传操纵鼠标的发展下丘脑通过在子宫内电穿孔
2013年7月24日
尽管下丘脑的功能和医学重要性，在子宫内遗传操纵其发展已经很少有人尝试。我们显示的详细步骤在子宫内电到老鼠的下丘脑和展示具有代表性的结果整体和局部（区域）下丘脑转。
该程序的总体目标是将血浆 DNA 转染到子宫内发育的小鼠胚胎的下丘脑中，以激活或抑制目标基因的功能。这是通过首先麻醉怀孕的小鼠并通过剖腹手术暴露子宫来实现的。第二步是将 DNA 溶液注射到胚胎大脑的第三脑室中。
接下来，将正极放置在子宫内的胎盘和胚胎头之间。将负极放置在子宫外表面并施加电脉冲。最后一步是在 6 天后取出转染的胚胎大脑。
最终，荧光显微镜用于分析转染细胞的表型改变、数量、形状、位置、标志物表达等。与病毒转染等现有方法相比，该技术的主要优点是：首先，它不需要特殊的预防措施，并且作为两个设施，其次可以靶向特定区域。第三，使用 Ute 电穿孔，可以更快地筛选候选基因。
通常，刚接触这种方法的人会很困难，因为将 DNA 溶液注入第三脑室并正确定位针状电极需要高级手动歪斜和一些经验。这种方法可以帮助回答下丘脑发育领域的问题，特别是与细胞迁移相关的问题，以及各个区域和细胞核的遗传特性。通过拉出一些优质的玻璃微量移液器开始此过程，因为它们对于降低由于羊水流失而导致的初始高流产率至关重要。
制备 DNA 时，将纯化的无内毒素血浆 DNA 溶解在含有 0.1% 固绿的 PBS 中，使终浓度为 1 至 2 μg/μL。快速绿色将使注射的溶液在胚胎脑室中可见。接下来，将 10 微升 DNA 溶液装入玻璃微量移液器中。
然后将玻璃微量移液器连接到注射系统或口腔移液器。在此步骤中，准备带有加热垫的手术台和手术器械打开冷光源以促进胚胎的可视化。然后使用玻璃珠消毒器对手术工具进行消毒。
接下来，用 isof fluorine 麻醉怀孕的小鼠。老鼠麻醉后，在其眼睛上涂抹软膏以防止干燥。随后将面罩戴在脸上以持续保持麻醉。
现在将鼠标放在加热垫上，腹部朝上。用胶带固定身体的四个肢体。通过捏住鼠标的尾巴进行反流，确保鼠标完全麻醉。
然后剃掉腹表，用碘溶液消毒。在腹部皮肤上做一个长约一到一厘米半的纵向切口。然后，切开腹膜。
接下来在切口周围放置棉纱布。用 PBS 冲洗纱布。用钝钳小心地拉出一个子宫角，露出它。
避免紧紧拉扯子宫肌层或子宫。由于子宫内的高压会增加注射时胚胎液流失的机会，从而导致流产。然后将子宫角放在 PBS 冲洗过的纱布上，每隔几分钟用 PBS 冲洗一次以保持湿润。
现在，在显微镜下，以可以看到脑室的方式握住子宫。不要广泛地重新定位位于不利位置的胚胎。这只会增加堕胎的机会。
从顶部观察胚胎的头部，找到左右皮质半球之间裂缝的间隙。半球很容易区分，它们内部的侧脑室通常可以感觉到形状较暗。如果发现胚胎完全适合 DNA 注射，则可以刺穿子宫壁并立即进入第三脑室。
将装有先前制备的 DNA 的玻璃微量移液器以 45 度角握在子宫壁上，并在半球间裂的喙端穿刺，渗透至约 1 毫米的深度。这样，玻璃微量移液器的尖端将进入大脑的第三脑室，而不是侧脑室。将大约 1 微升 DNA 溶液注入第三脑室后，绿色液体将充满心室，对同一子宫角的所有胚胎重复相同的程序。
这将使 DNA 溶液与脑室液均匀混合并到达整个神经上皮。现在打开 electro perter 并根据胚胎年龄调整设置。以不锈钢针电极为正极，以圆形扁平电极为负极，选择背朝上的胚胎进行电穿孔。
然后通过将针电极的尖端向下推入羊膜囊和胎盘之间的胚胎头部旁边的子宫壁，刺穿子宫壁。然后用另一只手的食指作为推力块。电极尖端约 5 毫米应位于羊膜囊和子宫壁之间，大约与中脑水平相同。
由于这是靶向电极，它的位置将决定下丘脑神经上皮的哪一部分最有可能被转染。接下来，用另一只手将圆形扁平电极放在子宫壁外的胚胎头部的另一侧。然后轻轻挤压电极之间的胚胎。
使用踏板开关施加电压。之后，慢慢地将针状电极从子宫中拉出，同时用另一只手的食指向后拉住子宫。如果羊水通过穿刺的壁流失，通常胚胎会流产。
在所有胚胎注射和电穿孔后，非常小心地将子宫放回小鼠的腹部，并像以前一样将它们完全定位。然后在闭合腹膜腔之前用生理盐水润湿腹膜腔。用外科猫肠缝合腹膜，然后用更耐用的缝合线缝合皮肤。
用碘溶液消毒腹部表面，皮下注射非甾体抗炎药以缓解疼痛。接下来，将母亲从麻醉机中取出，并将其放入笼子中，笼子由加热垫加热。监测鼠标直到它从麻醉中完全恢复，并每天检查它以确保它从手术中恢复并且没有任何感染或疼痛的迹象。
在此步骤中，根据所需的分析日期收获胚胎或产后。选择注射 DNA 并电穿孔的胚胎，并在该立体显微镜下解剖大脑。然后检查相应区域中的绿色荧光信号。
要分析所选胚胎的大脑，请将组织在 4% 石蜡醛中短时间固定。接下来，将其包埋在 aros 4% 或明胶白蛋白中。然后在颤音上切开大脑。
这些图显示了在子宫内转染血浆 DNA（在 E 12.5 处携带荧光报告基因、GFP 或 CFP）后的下丘脑。这是一个矢状面，显示从喙转染到小丘脑的下丘脑，这是横切面，标记细胞沿培养基侧轴处于不同水平。该矢状面显示特异性转染的体及其特征轴突树的标记，在该横切片的电游行侧显示对应于 E 12.5 出生的神经元的标记条带。
更仔细地分析各部分。准备了平行于从凹陷发出的放射状神经胶质突平面的水平切片。在 E 12.5 天转染的神经上皮细胞产生的 ambi O 神经元在 E 18.5 天通过抗 GFP 抗体鉴定。
在这个例子中，抗体标记了一组受限的 MBO 细胞。该组位于对应于 MB 神经元的两个未标记的外侧和内侧 MBO 区域之间，在 E 12.5 之前和之后出生，并与抗 neston 的抗体共染色。红色表示单独标记的神经元在神经上皮放射状胶质突上的迁移模式 一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 30 分钟内完成。
看完这个视频，你应该对如何将 DNA 注入第三脑室以及如何将针头定位为胚胎、头部和胎盘之间的正极，以便有效地靶向下丘脑有一个很好的了解。遵循此过程。可以进行其他方法，如免疫组化或 inid 杂交，以回答有关转染神经元表型的其他问题。
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概述
本文介绍了一种在小鼠下丘脑中进行体内电穿孔的详细步骤。该方法旨在将等离子体DNA转染到小鼠胚胎的下丘脑中，以操纵基因功能。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 基因操作
- 发育生物学
背景
- 下丘脑在各种生理过程中起着至关重要的作用。
- 在这一领域中，体内基因操作还没有被充分探索。
- 电穿孔是一种将DNA引入细胞的技术。
- 本研究旨在增进对下丘脑发育的理解。
研究目的
- 将DNA转染到小鼠胚胎的下丘脑中。
- 激活或抑制特定基因功能。
- 为未来的研究提供详细的方法论。
使用的方法
- 对孕鼠进行麻醉并进行开腹术。
- 将DNA溶液注射到胚胎大脑的第三脑室中。
- 为电穿孔定位电极。
- 在六天后取出转染的胚胎大脑。
主要结果
- 成功地实现了下丘脑的转染。
- 展示了完全和部分（区域性）下丘脑转染。
- 该程序可以复制以进行进一步的研究。
- 结果表明体内基因功能操纵的潜力。
结论
- 该研究为下丘脑研究提供了一种新的方法。
- 体内电穿孔是一种可行的基因操作方法。
- 未来的研究可以在此方法基础上进行各种应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Targeted genetic manipulation of the developing hypothalamus enables mechanistic interrogation of neurodevelopmental pathways relevant to metabolic and behavioral disorders. This approach supports target validation by allowing precise spatiotemporal gene modulation in a physiologically intact embryonic system. It enhances predictive confidence in early discovery by linking genetic perturbation to phenotypic outcomes in a disease-relevant brain region.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of candidate genes in hypothalamic neuroepithelium to clarify role in developmental pathways.
- Operational Value: Provides a reproducible method for regional transfection without requiring germline mutant generation.
- Therapeutic Value: Supports target de-risking by linking gene function to cellular phenotypes such as migration and marker expression in situ.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates rapid screening of candidate genes via fluorescent reporter expression in transfected hypothalamic nuclei.
- Operational Value: Uses standardized electroporation parameters and histological readouts for consistent transfection assessment.
- Therapeutic Value: Enables quantitative analysis of transfected cell number, position, and morphology for phenotype-based hit evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models developmental gene regulation in a mammalian system with relevance to human hypothalamic disorders.
- Operational Value: Allows postnatal analysis of electroporated embryos to assess long-term cellular consequences of embryonic gene modulation.
- Therapeutic Value: Supports biomarker alignment by enabling co-labeling of transfected cells with lineage or migration markers.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven gene screening in a physiologically contextualized embryonic brain model prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target validation through region-specific gene manipulation in the developing hypothalamus.
- Screening: Enables assay-ready transfection with fluorescent reporters for automated or manual phenotypic scoring.
- Analytics: Generates quantitative readouts on transfected cell distribution, morphology, and marker expression for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects embryonic genetic manipulation to postnatal phenotypic analysis, supporting developmental-to-adult disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative gene screening across multiple targets in the same embryonic system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by enabling direct observation of gene function in hypothalamic cell migration and specification.
- Operational Value: Standardizes surgical and electroporation steps to improve reproducibility and reduce embryo loss across users.
- Strategic Value: Accelerates target evaluation timelines by bypassing lengthy mutant generation pipelines.
- Portfolio Impact: Informs go/no-go decisions through early phenotypic screening of genetic targets in a disease-relevant neural substrate.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, embryonic handling, and precise electrode placement for successful transfection.
- Dependent on specialized instrumentation including glass micro pipettes, electroporator, stereo microscope, and histological processing tools.
- Necessitates standardized protocols for DNA preparation, injection volume, and electrical pulse parameters to ensure consistency.
- Must account for variability in embryonic orientation and uterine horn handling to maintain transfection efficiency and survival rates.
- Limited to embryonic stages where hypothalamic neuroepithelium is accessible via third ventricle injection, restricting postnatal application.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:06
Preparation of DNA and Glass Micropipettes for Injection
2:57
Laparotomy
4:33
DNA Injection into the Brain Ventricle
5:59
Targeting the Hypothalamus for Electroporation
7:17
Finishing the Surgery
8:28
Analyzing the Results
9:18
Results: Hypothalamus Transfection by In utero Electroporation
10:54
Conclusion
