利用吗啉代寡核苷酸脑室微量注射技术对成年斑马鱼大脑进行基因表达的微操作

本实验的总体目标是将吗啉代寡核苷酸显微注射至成年斑马鱼脑的脑室中，以敲低放射状胶质细胞中基因的活性。该过程首先对斑马鱼进行麻醉，随后使用带倒钩的牙科针在覆盖视顶盖的颅骨上制造切口。

然后将吗啉代溶液通过切口部位注入脑室液中。最后，在荧光显微镜下检查注射的效率和准确性。最终，可通过组织切片和免疫组织化学染色检测到，通过吗啉代介导的基因敲低，成年斑马鱼大脑放射状胶质细胞中目标基因的蛋白质生成被高效且广泛地阻断。

与现有的转基因方法或基于电穿孔的递送方法相比，该技术的主要优势在于CVMI耗时更短，且在靶向整个放射状胶质细胞群体方面效率更高。同时，可对多个可调节基因进行敲低。在配制注射混合液时，首先配制500微摩尔的Morpholino储存液。

使用 PBS 配制 10 次注射液，将 9 微升稀释或未稀释的吗啉溶液与 1 微升荧光示踪染料混合，制备成 10 微升的注射混合液。在室温下保存。使用拉针仪根据以下参数制备玻璃注射毛细管。

打开气压源并将压力设置为 50 PSI 或 3.5 巴。调节显微注射器的设置如下：维持压力为 20 PSI，喷射压力为 10 PSI，周期值为 2.5，持续时间为 100 毫秒。

调节光闸范围。打开环形照明器，并将环形照明器置于显微镜载物台上。将毛细管支架放置在显微镜旁的合适位置。

将玻璃毛细管插入持针器中，并将注射角度调整为45度。使用寻端镊子折断玻璃毛细管的尖端，并校准喷口的压力输出。将针尖浸入鱼水中并施加持续的压力脉冲，此时产生的气泡应排列成单排，表明压力或喷口尺寸已达到最佳状态。

用注射液填充玻璃毛细管。避免产生气泡，施加压力以排除玻璃毛细管尖端与已加载注射液之间的空气。配制0.1%麻醉剂meab的茎溶液后，将所需数量的鱼类转移至含有鱼水的运输容器中。

通过将 200 毫升鱼用水与 5 毫升 MISP 储备液混合，配制麻醉剂工作液。用麻醉剂填充培养皿至一半，用于注射。将一条鱼置于麻醉剂中孵育，直至其停止活动。

然后使用网将鱼转移到含有麻醉剂的培养皿中。为便于进行切口，用镊子轻轻夹住鱼体，并将其头部略微向下倾斜。使用30号带倒刺针头的尖端，在颅骨上做一个小切口，注意不要刺入过深，以免损伤脑组织。

在继续握住鱼体的同时，将玻璃毛细管的尖端穿过切口部位约半毫米，注意避免接触脑组织，并将其朝向头部方向定位。注入溶液，溶液应立即扩散。将鱼转移至新鲜的养鱼用水中，使其恢复。

约30分钟后，重新麻醉斑马鱼，并在荧光显微镜下检查液体是否广泛分布，依据红色荧光进行判断。将斑马鱼放回鱼缸，并重新投入循环饲养系统中。

在用于行为学分析或如本处所示制备组织样本之前，准确的注射应使注入的溶液在脑内充分弥散，并有效靶向靠近脑室表面的细胞。然而，若玻璃毛细管刺入脑组织，则在注射部位会出现密集的荧光信号。如果注射量不足，则会观察到微弱的荧光信号。

该图显示，活体形态素（vivo morphos）可穿透心室表面数个细胞直径的深度，因此与对照组相比，能够高效靶向心室区细胞。针对PCNA的形态素注射可有效敲低心室区细胞中的基因表达。在这些免疫荧光图像中，BrdU与QCD免疫染色在A-B-R-D-U脉冲追踪实验后显示，使用反义形态素敲低PCNA会导致新生神经元显著减少，提示CVMI可用于敲低内源性基因，进而引发功能性后果。

因此，在该技术问世后，为神经科学领域的研究人员探索成年鱼类大脑中再生神经发生反应所涉及的分子机制铺平了道路。