成像和胚胎斑马鱼脑血管结构的三维重建

该程序的总体目标是评估胚胎斑马鱼的脑血管结构。这是通过首先收集受精斑马鱼卵并设置处理条件来实现的。三天生长期后，将斑马鱼处死固定，并在将标本安装在盖玻片上之前小心地去除一只眼睛。

然后通过共聚焦显微镜对脑血管系统进行成像。最后，使用开源软件生成脉管系统的 3D 渲染。最终，重建分析用于确定治疗条件对血管分支和密度的影响。

在发育中的斑马鱼脑中。该技术评估胚胎斑马鱼的整个血管系统。它使我们能够在器官系统水平上研究 β 淀粉样蛋白的生物学特性。

这种方法的视觉演示至关重要，因为解剖和图像分析很难学习，因为它们在技术上具有挑战性。首先，在 28.5 摄氏度下以 14 小时的光照、10 小时的黑暗循环在所需组织中培养表达增强绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼菌株。在这个例子中，在血管内皮细胞中表达 EGFP 的转基因鱼在取卵前一晚饲养，将雄性和雌性放在带有网状底部的交配池中第二天早上，取下隔板，让鱼每 15 分钟交配检查一次卵。

使用网眼过滤器收集种蛋并使用 E 3 培养基清洗后，使用 E 3 将种蛋转移到 100 毫米培养皿中，并在 28 摄氏度下孵育以改变脑血管分支。从受精后 24 小时开始，添加一种化学物质，例如溶解在 DMSO 中的 γ 分泌酶抑制剂。如果需要，添加 0.03%PTU 以抑制色素形成。

将溶液中的胚胎转移到 12 的孔中后，孔板在 28.5 摄氏度下孵育，直到胚胎达到所需的发育阶段。在 trica 中牺牲胚胎并在 4 摄氏度下用醛固定过夜后。将胚胎储存在 PBS 中，在 4 摄氏度的黑暗中。

要从胚胎中取出眼睛，请使用锋利的钨针并在连接一只眼睛的组织周围切开。然后切开肌肉，最后切开视神经以切除眼睛。取下眼睛后，将胚胎翻到盖玻片上，空眼窝朝下并触摸盖玻片。

加入一滴 3% 甲基纤维素以将胚胎固定到位并覆盖整个胚胎以防止干燥。在使用具有 20 x 平面 APO 物镜图像的倒置共聚焦显微镜进行成像时，胚胎会立即出现，许多成像系统将只能分辨该标本中途的血管结构。如果是这种情况，复苏，将胚胎悬浮在 PBS 中，并将其重新安装在对侧进行进一步成像，以使用针对 3D 渲染优化的图像 J 对脑血管图像进行 3D 重建。

通过转到插件、位置、生物格式导入器导入共聚焦堆栈，然后选择尼康堆栈的共聚焦文件，选择具有超级堆栈的视图堆栈并将颜色模式设置为灰度。然后检查 Auto Scale 和 Split channels。这些选择将打开四个单独的通道面板。

关闭除文件名后跟 c 等于 1 的 16 位图像之外的所有图像。使用底部的滚动选项卡来调整阈值，以查找具有感兴趣区域或结构的切片。然后去 图像调整阈值.

在出现的面板中，将顶部栏向左滑动，以便在背景上可以清楚地看到结构，并将底部滑块留在原处以创建新的 8 位图像。选择 b 和 w。然后是深色背景。

不要为每个图像选择计算阈值，除非每个切片需要不同的调整。接下来，转到插件 3D 查看器阈值零重采样因子 1 或 2，然后取消选择红色和蓝色框以进行绿色 3D 输出。否则，它将产生白色渲染。

然后选择 apply。使用鼠标和键盘控件旋转、旋转和缩放 3D 图像，以随时保存静止图像。使用菜单中的 capture 选项。

屏幕上图像框的大小决定了生成的图像的像素尺寸，因此如果需要高分辨率图像，请通过拖动右下角来放大框。通过选择视图录制 360 度旋转来创建旋转的 3D 影片。最后，将文件保存为几种可用格式之一，并使用免费的开源媒体播放器 VLC 查看 3D。

维管结构的重建为斑马鱼的发育提供了一个全面且视觉上有趣的视角。这里显示的是受精后 6 天的斑马鱼胚胎中血管结构的几个角度，这些胚胎在内皮细胞中以单色绿色或白色表达 EGFP。感知信号强度可能很困难，但伪着色提供了来自查找表的图像强度，从而可以更好地感知重叠结构的深度。

例如，该图显示了斑马鱼受精后 6 天的脉管系统的伪彩色 3D 图像发育后。这项技术使我们能够探索 β 淀粉样蛋白在脊椎动物大脑中的血管作用。看完这个视频，你应该对如何可视化胚胎斑马鱼的血管网络有一个很好的了解，这为研究血管生成提供了一种经济且可访问的系统。