斑马鱼胚胎中脑血管结构的成像与三维重建

本实验的总体目标是评估胚胎期斑马鱼的脑血管结构。首先收集受精的斑马鱼卵并建立处理条件。经过三天的生长期后，处死斑马鱼并进行固定，小心摘除一只眼睛，然后将样本置于盖玻片上。

然后通过共聚焦显微镜对脑血管系统进行成像。最后，使用开源软件生成血管系统的三维重建图像。最终，通过对重建图像的分析，确定不同处理条件对血管分支和密度的影响。

在发育中的斑马鱼大脑中。该技术可评估胚胎期斑马鱼的整个血管系统。这使我们能够在器官系统水平上研究淀粉样蛋白β的生物学特性。

该方法的可视化演示至关重要，因为解剖和图像分析技术难度较高，难以掌握。首先，在28.5摄氏度、14小时光照和10小时黑暗的循环条件下培育表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的转基因斑马鱼品系，使其在目标组织中表达。本示例中，转基因鱼在卵子收集前夜即开始培育，并将雄鱼和雌鱼放入带有网状底部的交配缸中。次日早晨，移除隔板，让斑马鱼交配，并每15分钟检查一次是否有卵子产生。

使用滤网收集卵子后，用 E3 胚育培养基清洗三次，再用 E3 胚育培养基将卵子转移至 100 毫米的培养皿中，并在 28 摄氏度下孵育，以改变脑血管分支。从受精后 24 小时开始，加入溶于 DMSO 的化学物质（例如 γ-分泌酶抑制剂）。如需要，可加入 0.03% PTU 以抑制色素形成。

将胚胎连同溶液转移至12孔板的孔中，在28.5°C下孵育，直至胚胎发育至所需阶段。用三卡溶液处死胚胎后，于4°C条件下用醛类固定液固定过夜。将胚胎置于PBS中，4°C避光保存。

为了从胚胎中取出眼睛，使用 sharpened tungsten needle 切割连接一只眼睛的周围组织，然后切断肌肉，最后切断视神经以摘除眼睛。眼睛取出后，将胚胎翻转，使其空的眼窝朝下并接触盖玻片。

加入一滴3%甲基纤维素以固定胚胎位置，并覆盖整个胚胎，防止干燥。使用倒置共聚焦显微镜配合20倍平场复消色差物镜进行成像时，应立即对胚胎成像；许多成像系统仅能清晰分辨该样本中约一半深度的血管结构。若出现此情况，需将胚胎重新悬浮于磷酸盐缓冲液（PBS）中，并将其重新安装至对侧进行进一步成像，以便利用ImageJ软件完成脑血管图像的三维重建，该软件针对三维渲染进行了优化。

通过依次点击插件、Loci、Bio-Formats 导入器来导入共聚焦图像序列，然后选择尼康图像序列文件，选择“以超堆栈形式查看堆栈”并设置颜色模式为灰度。然后勾选自动缩放和拆分通道。这些设置将打开四个独立的通道面板。

关闭所有其他图像，仅保留文件名后跟 c 等于一的 16 位图像。通过使用底部的滚动选项卡浏览图像切片，找到包含目标区域或结构的切片，然后进入图像 → 调整 → 阈值进行阈值调节。

在弹出的面板中，将顶部滑块向左滑动，使结构在背景上清晰可见，同时保持底部滑块位置不变，以创建一个新的8位图像。选择黑白，然后选择暗色背景。

除非每张图像需要不同的调整，否则请勿选择“为每张图像计算阈值”。接下来，进入插件 3D 查看器，将阈值设为零，重采样因子设为一或二，并取消选中红色和蓝色颜色框，以生成绿色的 3D 输出。否则，将生成白色的渲染图像。

然后选择应用。使用鼠标和键盘控制旋转、转动和缩放 3D 图像，并在任意时刻通过菜单中的捕获选项保存静态图像。

屏幕上图像框的尺寸决定了生成图像的像素大小，因此若需要高分辨率图像，可通过拖动右下角来增大图像框。通过选择“视图记录”中的360度旋转，可创建旋转的3D动画。最后，将文件保存为多种可用格式之一，并使用免费开源媒体播放器VLC来观看3D内容。

血管结构的重建为斑马鱼发育提供了全面且具有视觉吸引力的观察视角。图中展示的是受精后六天斑马鱼胚胎中血管结构的多个角度，其内皮细胞表达EGFP，呈现单色绿色或白色。信号强度可能难以分辨，但伪彩着色通过查找表提供图像强度信息，有助于更好地感知重叠结构的深度。

例如，该图展示了受精后六天斑马鱼发育完成后其血管系统的伪彩3D图像。该技术使我们能够探索淀粉样蛋白β在脊椎动物大脑中的血管效应。观看本视频后，您应能充分理解如何对胚胎期斑马鱼的血管网络进行可视化观察，该模型系统经济且易于获取，适用于血管生成研究。