人类心肌细胞的生成：从无饲养层人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞制备方案

本实验的总体目标是从在无饲养层条件下培养的人诱导多能干细胞（iPS细胞）分化获得人心肌细胞。该过程首先将iPS细胞接种于超低吸附培养板中以形成拟胚体；第二步是将形成的拟胚体转移至明胶包被的培养皿中。

当出现收缩区域时，需在体视显微镜下进行人工解剖，并接种至纤维连接蛋白包被的培养皿中。为进一步诱导分化，最后一步是通过酶消化收缩的细胞簇以获得单个心肌细胞。最终结果可显示分化出的心肌样细胞表达典型结构标志物，例如通过免疫荧光显微镜检测到的心肌肌钙蛋白。

该方法有助于回答心血管生物学领域的一个关键问题，例如，在人类心肌细胞水平上，哪些机制驱动了心脏发育及疾病过程中心肌细胞的分化与功能障碍。这一技术非常有意义，因为它能够在体外从人类患者和个体来源生成心肌细胞；其次，它还能在试管中重现疾病过程，从而可在体内实验之前进行新药的体外测试。

实验开始时，使用在35毫米基质胶包被的培养板上生长至融合的iPS细胞培养物。将生长培养基替换为含有1毫克消化酶的1毫升PBS。使用拉制玻璃移液管观察细胞。

去除菌落中心具有分化细胞的区域，例如火山口样或囊状结构。同时去除细胞已分离、扁平化并似乎正在向外迁移的任何区域。将剩余的细胞置于37摄氏度培养罩内继续培养，直至菌落边缘变亮并开始脱离。

此过程通常需要五到七分钟。此时，移除 dispa 溶液，并用一毫升 HESM 洗涤细胞，然后弃去洗涤液。

在1毫升新鲜的HESM中，使用细胞刮刀收集细胞克隆。将克隆收集至15毫升离心管中。接着，用另1毫升HESM冲洗细胞，并在1000 × g下离心4分钟。

随后在 Matrigel 上接种细胞，并在培养期间每天更换培养基。首先按照前文所述方法收获未分化的 IPS 克隆。一旦获得未分化的细胞群体，将其轻柔地重悬于 1 毫升 EBM 20 中。

使用2毫升移液器时，不要过度吹打细胞团块，移液操作限制在两到三次。每次吹打之间，在体视显微镜下检查克隆的大小。

当菌落大小基本一致时，无需进一步混匀。现在将细胞接种到超低吸附培养板上，每收获一板细胞接种一个六孔板。用一毫升 EBM 20 冲洗试管，并将冲洗液加入培养板中，此步骤切勿遗漏。

孵育第三天后，使用显微镜更换培养基，以避免移除类胚体。移液时将移液枪头靠近培养板边缘。第七天时，将类胚体转移至已用37摄氏度预温30分钟的0.1%明胶包被的培养板中。

在每个 35 毫米培养皿中加入 35 至 40 个体胚，加入 2 毫升培养基。培养期间，每周定期换液两次。

检查胚状体中是否存在搏动区域，并标记出搏动区域的位置。在培养皿盖的上方，搏动并收缩的区域通常在约10至20天后出现。当出现自发收缩的区域时，将其培养基更换为EBM-2。在收缩区域出现后，继续培养并监测培养板上其他区域，持续长达一个月时间。

总体而言，在EBM中，分化过程的缺陷高度依赖于多个因素，其中最关键的因素是特定的细胞系以及用于诱导心肌分化的血清批次。为了获得最高的效率，需测试多个细胞系的心源性潜能以及不同批次的血清。首先包被12。

在 PBS 中每平方厘米包被 5 微克纤连蛋白，每孔加入 300 微升，应完全覆盖每个孔的表面。将培养板置于细胞培养超净台中敞口干燥。为去除细胞培养中的成珠区域，使用拉制的玻璃移液管和手术刀。

然后使用1 mL移液器将4至5个组织块转移至经纤维连接蛋白包被的培养板的每个孔中。完成所有组织块收集后，在收集板的加样孔中加入1 mL EBM-2培养基，并标记已取出细胞的区域。随后更换培养基，并将培养板放回培养操作台。

若在体视显微镜下需要更小的搏动细胞团，可将移植区域通过移液管吹打。此操作可产生含有少量搏动细胞的小细胞簇。在培养过程中进行。

每两周更换两次培养基，直至样品准备好进行分析。首先，准备4厘米见方的双腔载玻片，通过加入用足量PBS稀释的20 µg纤连蛋白以覆盖表面进行包被。如果使用玻璃支撑物，则额外添加20 µg层粘连蛋白。

按照先前所述方法分离珠状培养区域。使用1 mL移液器将细胞转移至含有500 µL胶原酶管的15 mL离心管中。将细胞孵育15分钟，并在孵育期间摇动试管一次。

孵育15分钟后，若仍有细胞团块残留，用200微升移液器吹打细胞以去除团块。将细胞转移至新鲜的collagenase two中，当无大团块残留时重复孵育。通过加入三毫升不含乙酸的EBM two终止消化，上述溶液均需预先配制。

将试管置于通风橱内的加热架上保存，然后在室温下以1000 × g离心4分钟。离心后，用1 mL含0.25%胰蛋白酶-EDTA的PBS将来自同一初始样品的细胞组分重悬。随后将悬液放入加热块中孵育5分钟，并用4 mL不含维生素A的EBM-2培养基终止胰蛋白酶反应。

接下来，使用2.5毫升注射器上的18号针头反复吹打细胞，最多七次，直至显微镜下观察不到大的细胞团块。然后以1000 × g离心4分钟。将细胞沉淀重悬于E BM2中，并接种至2孔板玻片上。

细胞经两到三天的孵育后即可用于分析。CMS 来源于多个 IPS 细胞系。这些细胞系最初是在甲基绿饲养层上建立的，随后立即转移至使用定义培养基的 Matrigel 上培养。

细胞呈现出类似人类胚胎干细胞的形态，具有明亮的相位边缘和明显的细胞核。免疫荧光分析显示，诱导多能干细胞正确表达了转录因子T四，并表达了TRA一六零表面抗原。流式细胞术分析证实了典型表面多能性抗原SSEEA四和TRA一六零的表达。

分选策略如左侧散点图所示。还对在基质胶上生长的IP FS细胞进行了核型分析。通过将IPS细胞聚集成类胚体（ebs），并在特定类型血清存在下进行培养，诱导其向心肌细胞系分化。

根据所使用的细胞系，山梨酸收缩区域占整个培养区域的20%至35%。通过酶消化法从这些区域分离出收缩性CMS，并分析其蛋白质表达。逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）结果显示，由诱导性多能干细胞（IPS）衍生的跳动细胞表达心脏特异性离子通道，而在非跳动细胞中则无此表达。

这些通道包括一种电压门控钙通道的 α1 亚基、一种 V 型电压门控钠通道的 α 亚基、一种属于 KQT 样亚家族的电压门控钾通道，以及两种形式的肌球蛋白。重链免疫荧光分析显示，单个诱导多能干细胞（IPS）来源的心肌细胞表达了结构蛋白，包括 α-肌节肌动蛋白、心肌肌钙蛋白 I 以及心肌特异性连接蛋白 connexin 43。总之，该技术为在体外建立心肌疾病模型奠定了基础，并使得在不向人体内注射药物的情况下，在人类细胞背景下进行药物实验成为可能。

观看本视频后，您应能充分了解如何在无饲养层条件下培养诱导多能干细胞（iPS细胞），并利用基于拟胚体聚集的方法将其分化为心肌细胞。