Name: 人类心肌细胞的生成:从馈线人类诱导多能干细胞的分化协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: 了解利用无饲养层人类诱导多能干细胞通过拟胚体聚集分化为功能性心肌细胞的方法。该技术通过免疫荧光检测心肌肌钙蛋白表达，为心血管疾病建模和药物筛选提供可重复的心脏细胞来源。

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BS 得到了米兰比可卡大学暑期学生科研培训项目的支持；本研究得到了意大利卫生部、意大利教育大学与研究部以及人类健康基金会向 GC 提供的资金支持；我们感谢 Michael V.G. Latronico 对稿件的审阅。

1. 人类iPS细胞系的无饲养层维持与传代
<ol>
	<li>准备Matrigel包被的培养皿。将一管适用于人胚胎干细胞的基质胶置于冰上解冻一小时，然后用25 ml DMEM-F12培养基稀释。每35 mm培养皿中加入1 ml（若使用其他规格培养皿，则按表面积等比例添加），操作过程中保持所有试剂和器皿处于冰上预冷状态。用铝箔纸包裹培养皿避光。</li>
</ol>
注意：Matrigel 的储存浓度因批次而异。稀释说明见产品数据表。
<ol start="2">
	<li>将培养板置于冰上过夜，次日从冰上取出。培养板可在冰箱中保存最多一周后再使用。</li>
	<li>根据下表配制 mTESR1 完全培养基（或解冻一管 Nutristem 培养基）和 H-ESM（人胚胎干细胞培养基）。
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
			<tr>
				<td>H-ESM</td>
				<td>终浓度</td>
				<td>配制 500 ml 所需量</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Knockout 血清替代物（KSR）</td>
				<td>20%</td>
				<td>100 ml</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>GlutaMAX 100X</td>
				<td>2 mM</td>
				<td>5 ml</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>MEM 非必需氨基酸</td>
				<td>0.1 mM</td>
				<td>5 ml</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>青霉素-链霉素</td>
				<td>100 U/ml - 0.1 mg/ml</td>
				<td>5 ml</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>2-巯基乙醇</td>
				<td>0.1 mM</td>
				<td>900 μl</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>B27 补充剂 - 不含维生素A</td>
				<td>1%</td>
				<td>10 ml</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>N2 补充剂</td>
				<td>1%</td>
				<td>5 ml</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Knockout DMEM</td>
				<td>-</td>
				<td>370 ml</td>
			</tr>
		</tbody>
	</table>
	 
	配制好的储存培养基可在 4 °C 保存不超过 2 周。配制完全生长培养基时，需在换液前加入基础成纤维细胞生长因子（bFGF），使其终浓度为 20 ng/ml。</li>
</ol>
注意：可使用经小鼠胚胎成纤维细胞条件处理的完全 H-ESM 培养基替代 mTESR1 或 Nutristem 用于诱导多能干细胞培养。
<ol start="4">
	<li>将包被的培养板置于37 °C培养箱中孵育30分钟至2小时，然后再进行传代。</li>
	<li>细胞应大约每5天传代一次，即使尚未达到汇合状态；克隆之间不应相互接触。</li>
	<li>用1 ml分散酶（1 mg/ml，用PBS将10 mg/ml储存液稀释而成）替换生长培养基。</li>
	<li>使用拉制的玻璃巴斯德移液管去除正在分化的区域。需去除的区域包括克隆中心的火山口样或囊状结构，以及细胞已从克隆脱离、变扁平并呈现向外迁移趋势的区域。</li>
	<li>在37 °C培养罩内孵育，直至克隆边缘变亮并开始脱落（通常约5–7分钟）。弃去分散酶溶液，用1 ml H-ESM洗涤后弃去。</li>
	<li>在1 ml H-ESM中，使用细胞刮刀（类似刮铲）收集克隆，并转移至15 ml离心管中。用额外1 ml H-ESM冲洗后并入同一离心管。以1,000 rcf离心4分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于1 ml预热的生长培养基（mTESR1或Nutristem）中。避免过度吹打导致细胞团块破碎——吹打次数应少于6–8次。根据所需接种的细胞数量决定保留量，并去除多余细胞（通常按1:4或1:5稀释），例如，若按1:5比例接种2个培养板，则去除600 μl，再加入1.6 ml新鲜培养基。</li>
	<li>去除培养板中的Matrigel。将细胞逐滴加入培养板，均匀分布。避免剧烈振荡离心管，以免细胞聚集至中央。</li>
	<li>用1 ml培养基冲洗离心管，并将液体均分至各培养板。每孔最终体积应为1.5–2 ml。</li>
	<li>每天更换培养基，但传代后的当天除外。尽管理想情况下应每天换液，若自上次传代起未超过2–3天，也可偶尔每两天更换一次，且不会影响细胞的多能性或分化潜能。</li>
	<li>若需冻存细胞系，则改用1–2 ml mFreSR冻存液重悬细胞，用2 ml移液器将1 ml分装至冻存管中。将冻存管放入-80 °C冰箱内的冻存盒中，并在3–4天内转移至液氮中保存。</li>
</ol>
注意： iPS细胞的手动显微解剖必须在体视显微镜下进行。 体外 体外受精（IVF）工作站（例如 配备体视显微镜的KSystem体外受精工作站可在加热平台上保持无菌条件以进行细胞操作。若无此设备，可将体视显微镜置于常规层流罩内使用。
2. 胚状体聚集与心脏诱导
<ol>
	<li>根据下表配制EBM-20培养基。
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
			<tr>
				<td>EBM-20</td>
				<td>终浓度</td>
				<td>500 ml 配方</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>南美洲来源胎牛血清</td>
				<td>20%</td>
				<td>100 ml</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>MEM非必需氨基酸</td>
				<td>0.1 mM</td>
				<td>5 ml</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>青霉素-链霉素</td>
				<td>100U/ml - 0.1 mg/ml</td>
				<td>5 ml</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>GlutaMAX 100X</td>
				<td>0.1 mM</td>
				<td>5 ml</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>2-巯基乙醇</td>
				<td>50 μM</td>
				<td>450 μl</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>DMEM/F12</td>
				<td>-</td>
				<td>385 ml</td>
			</tr>
		</tbody>
	</table>
	 
	使用南美来源的胎牛血清（FBS）对于确定分化效率至关重要：使用其他类型的血清可能影响分化过程。配制完全EBM-20培养基时，加入抗坏血酸（AA）至终浓度为50 μg/ml。完全生长培养基在4 °C保存不得超过一周。</li>
	<li>按照上述方法（步骤1.6至1.9）收获iPS克隆。</li>
	<li>用2 ml移液器在1 ml EBM-20培养基中轻柔重悬。避免过度打散细胞团块——上下吹打不超过2–3次，并在体视显微镜下观察细胞集落的大小。按1:1比例接种至超低吸附培养板中例如 对于35 mm培养皿，使用6孔板中的1个孔。用1 ml EBM-20冲洗离心管，然后加入培养板中。</li>
</ol>
注意： 类胚体（EB）的大小会影响分化过程，控制心脏诱导的效率和时间。研究表明，大小均一的类胚体聚集可降低分化过程中观察到的变异性。
<ol start="4">
	<li>第3天，在显微镜下更换一次EBM-20培养基，以避免移除类胚体（EBs）。移液时将移液器靠近培养板边缘，小心吸出培养基。</li>
	<li>第7天，将类胚体转移至预先用0.1%明胶包被并已在37 °C孵育30分钟的培养板中。如有需要，可去除明胶，并将培养板置于细胞培养超净台中过夜。每35 mm培养皿中加入35–40个类胚体。</li>
	<li>观察类胚体中是否出现搏动区域，并每周更换两次EBM-20培养基。在培养皿盖顶部标记出搏动区域的位置，以便在体视显微镜下快速定位。搏动区域通常在约10–20天后出现。</li>
	<li>当出现自发性收缩区域时，将培养基更换为EBM-2（配制方法同EBM-20，但使用2% FBS），并按照下文第3节所述方法进行分离。</li>
	<li>继续观察其他区域是否出现搏动现象，并每周更换两次培养基，直至搏动区域可用于后续实验。</li>
</ol>
注意：分化过程的效率在很大程度上取决于多个因素，其中最关键的是特定的细胞系以及用于诱导心肌分化的血清批次。为获得最高效率，应检测细胞系的心肌生成潜能及不同批次的血清。
3. 搏动区域的分离与培养
<ol>
	<li>用 PBS 稀释纤连蛋白至 5 μg/cm2，加入足够体积使其完全覆盖 12 孔板（每孔表面积为 4 cm2）或其他所需培养板的整个表面（12 孔板每孔共 300 μl）。将培养板置于细胞培养超净台中，不加盖，使其自然干燥。培养板可用封口膜包裹后于 4 °C 过夜保存。</li>
	<li>根据需要，使用拉制的玻璃巴氏吸管和手术刀去除跳动区域，并用 1 ml 移液器将其转移至包被有纤连蛋白的培养板中。</li>
	<li>加入 1 ml EBM-2 培养基。</li>
	<li>在培养板上标记已去除细胞的区域，并更换培养基。培养板可保存长达 1 个月，因为其他区域可能在后期开始出现跳动。</li>
</ol>
注意：如果需要更小的搏动细胞团，可在体视显微镜下将移植区域反复吹打数次，直至其分裂成更小的碎片。这样将得到由少量搏动细胞组成的细胞簇（见视频3）。
<ol start="5">
	<li>每两周更换一次培养基，直至准备进行分析。</li>
</ol>
注意：本方案获得的心肌细胞具有类似胎儿的形态和功能特征；通过延长培养时间以进一步分化这些细胞，可使其成熟为类似成人的表型。
4. 单个搏动细胞的分离与分析
<ol>
	<li>用 PBS 将纤连蛋白稀释至 5 μg/cm2，并充分覆盖 2 孔玻片（4 cm2 面积）或其他合适载体的表面进行包被。若使用玻璃载体，则用层粘连蛋白和纤连蛋白（每种各 5 μg/cm2）进行包被。</li>
	<li>使用巴斯德吸管或解剖刀从第 3 节的培养板中取出跳动区域。</li>
	<li>使用 1 ml 移液器将细胞转移至含有 500 μl 胶原酶 II（在含 Mg 和 Ca 的 PBS 中浓度为 480 U/ml）的 15 ml 离心管中，于 37 °C 孵育 15 分钟，孵育期间轻摇一次试管。</li>
	<li>用 200 μl 移液器反复吹打。如有团块残留，将细胞转移至新鲜胶原酶 II 溶液中，并重复步骤 4.3。</li>
	<li>重复步骤 4.4，直至无大块细胞团残留。</li>
	<li>加入 3 ml EBM-2（不含氨基酸）以终止胶原酶反应。随后可将试管置于加热金属架中，在生物安全柜内静置，直至其他样品处理完毕。以 1,000 rcf 离心 4 分钟。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于每管 1 ml 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 溶液中（由 0.5% 储存液用 1×PBS 稀释而成），于 37 °C 孵育 5 分钟。合并来自同一初始样品的消化产物。</li>
	<li>加入 4 ml EBM-2（不含氨基酸）以终止胰蛋白酶反应。使用 2.5 ml 注射器连接 18G 针头，将细胞悬液通过针头吹打不超过 7 次。以 1,000 rcf 离心 4 分钟。</li>
	<li>每孔用 1 ml EBM-2 重悬细胞沉淀后接种。接种后 2–3 天可进行功能学和形态学分析。</li>
</ol>

<ol><li>Di Pasquale, E., Latronico, M. V., Jotti, G. S., Condorelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+and+cardiovascular+diseases%3A+a+genetic+tool+for+manipulating+cardiomyocyte+differentiation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors and cardiovascular diseases: a genetic tool for manipulating cardiomyocyte differentiation and function.</a> Gene Therapy. 19, 642-648 (2012).</li>
<li>Laflamme, M. A., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heart regeneration.</a> Nature. 473, 326-335 (2011).</li>
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<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
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<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
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<li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2010).</li>
<li>Yazawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+induced+pluripotent+stem+cells+to+investigate+cardiac+phenotypes+in+Timothy+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome.</a> Nature. 471, 230-234 (2011).</li>
<li>Itzhaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia+with+patient-specific+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Modeling of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia with patient-specific human-induced pluripotent stem cells.</a> Journal of the American College of Cardiology. 60, 990-1000 (2012).</li>
<li>Jung, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dantrolene+rescues+arrhythmogenic+RYR2+defect+in+a+patient-specific+stem+cell+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> EMBO Molecular Medicine. 4, 180-191 (2012).</li>
<li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4, 130ra147(2012).</li>
<li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 108, 407-414 (2001).</li>
<li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+enhances+the+cardiac+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+through+promoting+the+proliferation+of+cardiac+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid enhances the cardiac differentiation of induced pluripotent stem cells through promoting the proliferation of cardiac progenitor cells.</a> Cell Research. 22, 219-236 (2012).</li>
<li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+enhances+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes.</a> Circulation. 107, 1912-1916 (2003).</li>
<li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2011).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).</li>
</ol>

无财务利益需披露。

多能干细胞具有自发分化为心肌细胞（CMs）的潜力，但效率较低，且不同细胞系之间的变异性较大。因此，新型诱导方法的开发主要集中在提高分化效率，并朝着更明确的方案发展。然而，大多数这些新分化方法较为复杂，需要精细的培养条件、对试剂添加时间和浓度的精确控制，以及使用昂贵的细胞因子和生长因子进行处理。此外，不同iPS细胞系内源性细胞因子信号水平的差异使得细胞因子浓度的标准化变得困难，通常需要针对每个细胞系将其调整至适当水平。
获得的iPS来源心肌细胞的成熟度在利用iPS细胞进行心脏分化以应用于疾病建模和药物发现时，是一个需要重点考虑的关键因素。人类ESC和iPS细胞的分化通常产生具有胎儿表型的心肌细胞 即 结构尚未完全成熟。当采用单层培养方法时，这一特点尤为明显，因此这类方法更适用于特定心脏前体细胞群体的生成、扩增与分离 2,3.
在此情况下，用于疾病建模的“经典”拟胚体（EBs）聚集方法似乎更符合实验需求。该方法操作简便、经济、易于实施，且适用于所有细胞系。该方法无需额外添加生长因子或细胞因子...

从历史上看，对驱动人类发育和疾病的遗传与分子机制的研究主要依赖于构建基因修饰的动物模型。然而，许多人类表型无法在小鼠中成功复制，主要原因在于这两个物种之间存在的生物学差异。另一方面，获取人类组织可能受到限制，且通常难以获得足够的材料用于深入的实验研究。心血管生物学领域正面临上述双重局限：人类心脏的生理特性与小鼠存在显著差异，而大量心脏组织仅能在死亡后或心脏手术期间获得。因此，寻找一种理想的可分化为功能性人类心肌细胞（CMs）的细胞来源已成为心血管生物学的核心课题，科研人员已为此付出大量努力。已有多种细胞类型被提出作为候选，包括骨骼肌成肌细胞、局部心脏干细胞、骨髓单个核细胞、内皮祖细胞以及间充质干细胞。然而，利用这些细胞所获得的研究数据并不一致4。
人类胚胎干细胞（ESC）的分离最初 5 山中伸弥（Yamanaka）和汤姆森（Thomson）在诱导性多能干细胞（iPS细胞）领域的开创性发现 6,7 随后似乎提供了解决方案：这些细胞具有无限增殖的能力，并具备分化为三个胚层所有细胞衍生物的潜能，包括心肌细胞（CMs）。诱导多能干细胞（iPS细胞）的使用具有进一步优势：由于其来源于自体成体细胞，因此携带与供体个体或患者相同的基因组。这使得iPS细胞能够用于开发 体外 有助于研究人类遗传性疾病和发育机制的模型。由于这一特性，iPS细胞还能克服与免疫排斥和伦理问题相关的难题 8因此，尽管胚胎干细胞（ESCs）仍是干细胞生物学领域的金标准，但全球研究人员正越来越多地转向诱导多能干细胞（iPS细胞）技术。
诱导多能干细胞现正被用于建立人类疾病模型 体外 包括先天性心血管疾病在内的多种病症 9,10近年来，iPS细胞疾病模型已应用于单基因遗传性心脏疾病的研究（即 长QT综合征、儿茶酚胺能多态性室性心动过速）以及心脏缺陷为复杂表型一部分的病理状态（即 豹综合征和蒂莫西综合征、扩张型心肌病）。这些研究报告证实，源自患者的特异性诱导多能干细胞分化为心肌细胞后，表现出与疾病相似的表型和功能特征 体内.
然而，提高诱导iPS细胞向心肌细胞系分化的效率仍面临诸多挑战。通过形成称为拟胚体（embryoid bodies, EBs）的聚集体，已成功实现人胚胎干细胞（ESC）自发生成心肌细胞（CMs）17。自该发现以来，许多其他方法相继被提出。多个研究团队已显著提高了分化方案的效率，并逐步采用化学成分明确且不含动物源性成分的培养试剂（有关现有所有方法的全面综述，参见 Mummery, C., et al., Circulation Research (2012) 3）。
然而，基于拟胚体（EB）聚集的经典方法仍然是进行功能研究和疾病机制探索最常用的方法。我们提出的方案基于将诱导性多能干细胞（iPS细胞）聚集形成拟胚体，并在含血清和抗坏血酸的条件下进行培养，该方法已被证明可促进心肌细胞分化过程，并对这些细胞的成熟产生积极影响18,19。本文将详细阐述这一方法，并展示如何利用无饲养层的iPS细胞系生成患者特异性的iPS来源心肌细胞（CMs）。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;培养基与试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>人ESC专用基质</td><td>BD 生物科学</td><td>354277</td><td>将5 ml瓶在4℃解冻 &amp;deg;在冰上孵育过夜，按照说明书的稀释说明，在冰上分装至预冷的冻存管中，并于 -20 ℃ 保存 &amp;deg;C .</td></tr><tr><td>人血浆纤维连接蛋白，0.1% 溶液</td><td>Sigma</td><td>F0896-2MG</td><td>工作浓度：5 &amp;mu;g/cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma</td><td>L2020-1MG</td><td>工作浓度：5 &amp;mu;g/cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>PBS（不含 Mg 和 Ca），10×</td><td>Lonza</td><td>BE17-515F</td><td></td></tr><tr><td>PBS（含 Mg 和 Ca），10×</td><td>生物血清</td><td>XC-S2067/500</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II，中性蛋白酶，II型</td><td>罗氏</td><td>4942078001</td><td>储备液：10 mg/ml，溶于DMEM-F12，-20℃保存 &amp;deg;C，工作液：1 mg/ml，溶于不含镁/钙的 PBS 中</td></tr><tr><td>0.5% 胰蛋白酶/EDTA</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>II型胶原酶</td><td>沃辛顿</td><td>4176</td><td>稀释至 480 U/ml（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; 1.6 mg/ml，在含 Mg 和 Ca 的 PBS 中</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Life Technologies</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>敲除DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>无血清替代物（KSR）</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>4℃解冻 &amp;deg;C，分装后于 -20 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>F&amp;#8211;南美洲来源胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>10270-106</td><td>应检测各批次的心源性分化潜能。在4℃下解冻 &amp;deg;C，在56℃下热失活 &amp;deg;C 反应 30 分钟，分装后于 -20 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（PenStrep），100倍浓缩液</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX，100倍浓缩液</td><td>Life Technologies</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸，100X</td><td>Invitrogen</td><td>11140-135</td><td></td></tr><tr><td>N2 补充剂，100 倍浓缩液</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27添加剂，50倍浓缩液</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基&amp;#8211;乙醇</td><td>Invitrogen</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>猪皮明胶</td><td>Sigma</td><td>G1890-100G</td><td>在水中配制1%的储备液，-20℃保存 &amp;deg;C. 用 PBS 稀释至 0.1%，并于 4℃ 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>干细胞技术</td><td>5850</td><td>将5倍浓缩补充剂与基础培养基混合，分装后于-20℃保存 &amp;deg;C. 不要将完全培养基置于4℃保存 &amp;deg;C 超过 1 周</td></tr><tr><td>Nutristem hESC XF</td><td>Stemgent，来自 Biological Industries</td><td>05-100-1A</td><td>4℃解冻 &amp;deg;C O/N，分装后于 -20 保存 &amp;deg;C，直至使用。分装样品可保存于 4 &amp;deg;C，不超过一周。</td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>干细胞技术</td><td>5853</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma</td><td>A4544-25G</td><td>以水配制 10 mg/ml 的储存液。分装后于 -20 ℃ 保存。 &amp;deg;避光，加入 EBM 至终浓度（500X）</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;塑料器皿&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>35 mm 培养皿</td><td>Becton Dickinson</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>康宁公司</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>12孔板</td><td>Becton Dickinson</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Permanox 2孔腔室载玻片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>玻璃双孔板载玻片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>177380</td><td></td></tr><tr><td>6孔板，超低吸附表面</td><td>康宁公司</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>18G 针头</td><td>Becton Dickinson</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>玻璃巴斯德吸管，230 mm</td><td>VWR International</td><td>612-1702</td><td></td></tr><tr><td>2.5 ml 注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>300188</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>IVF 工作站</td><td>尼康 KSystem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>尼康 SMZ1500 体视显微镜</td><td>尼康</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

人类心肌细胞的生成：从无饲养层人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞制备方案

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

为了研究驱动心脏发育的过程并确定导致人类心肌疾病的分子机制，首先必须获得功能性人类心肌细胞（CMs）。在药物发现和毒理学研究中使用这些细胞也将带来显著益处，可使针对心脏疾病的新型药理学分子在临床前阶段即可在人类来源的细胞上进行验证。在所有可能的心肌细胞来源中，诱导性多能干细胞（iPS细胞）是最具前景的来源之一，因为这些细胞可直接从易于获取的患者组织中获得，并具有分化为体内所有细胞类型的内在潜能1。目前已有多种方法被提出用于将iPS细胞分化为心肌细胞，其范围从经典的拟胚体（EBs）聚集法到化学成分明确的分化方案不等2,3。本文中，我们提出一种基于拟胚体的分化方案，并展示该方法如何有效地从无饲养层培养的iPS细胞中高效生成具有功能的心肌样细胞。

在我们的研究中，我们利用多个人诱导多能干细胞（iPS）系生成了心肌细胞（CMs）。这些细胞系最初是在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层上建立的，但随后立即转移至Matrigel基质上，并使用定义明确的培养基（mTESR1或Nutristem）进行培养。通过多种检测方法验证了这些细胞形态学特征的维持情况、多能性细胞标志物（OCT-4、SSEA4和TRA1-60）的表达以及基因组稳定性（图1）。
通过将iPS细胞聚集形成拟胚体（EBs），并在特定类型的血清和AA存在下进行培养，诱导其向心肌谱系分化（图2A和图2B）。根据所使用的细胞系不同，出现收缩区域的比例占总体的20-35%（图2C和视频1）。通过酶消化法从这些区域分离出的收缩性心肌细胞（CMs）（视频2）表达典型的心肌细胞结构蛋白（心肌肌钙蛋白、α-肌节肌动蛋白、肌球蛋白重链α和β）、缝隙连接蛋白（连接蛋白-43）以及主要的离子通...

多能干细胞，包括胚胎干细胞或诱导性多能干细胞（iPS细胞），是获取人类分化细胞（包括心肌细胞）的重要来源。本文将重点介绍iPS细胞向心脏细胞的诱导分化，展示如何通过基于拟胚体的方案获得功能性人类心肌细胞。

为了研究驱动心脏发育的事件并确定导致人类心肌疾病的分子机制，有必要……

本实验的总体目标是从在无饲养层条件下培养的人诱导多能干细胞（iPS细胞）分化获得人心肌细胞。该过程首先将iPS细胞接种于超低吸附培养板中以形成拟胚体；第二步是将形成的拟胚体转移至明胶包被的培养皿中。当出现收缩区域时，需在体视显微镜下进行人工解剖，并接种至纤维连接蛋白包被的培养皿中。为进一步诱导分化，最后一步是通过酶消化收缩的细胞簇以获得单个心肌细胞。最终结果可显示分化出的心肌样细胞表达典型结构标志物，例如通过免疫荧光显微镜检测到的心肌肌钙蛋白。该方法有助于回答心血管生物学领域的一个关键问题，例如，在人类心肌细胞水平上，哪些机制驱动了心脏发育及疾病过程中心肌细胞的分化与功能障碍。这一技术非常有意义，因为它能够在体外从人类患者和个体来源生成心肌细胞；其次，它还能在试管中重现疾病过程，从而可在体内实验之前进行新药的体外测试。实验开始时，使用在35毫米基质胶包被的培养板上生长至融合的iPS细胞培养物。将生长培养基替换为含有1毫克消化酶的1毫升PBS。使用拉制玻璃移液管观察细胞。去除菌落中心具有分化细胞的区域，例如火山口样或囊状结构。同时去除细胞已分离、扁平化并似乎正在向外迁移的任何区域。将剩余的细胞置于37摄氏度培养罩内继续培养，直至菌落边缘变亮并开始脱离。此过程通常需要五到七分钟。此时，移除 dispa 溶液，并用一毫升 HESM 洗涤细胞，然后弃去洗涤液。在1毫升新鲜的HESM中，使用细胞刮刀收集细胞克隆。将克隆收集至15毫升离心管中。接着，用另1毫升HESM冲洗细胞，并在1000 × g下离心4分钟。随后在 Matrigel 上接种细胞，并在培养期间每天更换培养基。首先按照前文所述方法收获未分化的 IPS 克隆。一旦获得未分化的细胞群体，将其轻柔地重悬于 1 毫升 EBM 20 中。使用2毫升移液器时，不要过度吹打细胞团块，移液操作限制在两到三次。每次吹打之间，在体视显微镜下检查克隆的大小。当菌落大小基本一致时，无需进一步混匀。现在将细胞接种到超低吸附培养板上，每收获一板细胞接种一个六孔板。用一毫升 EBM 20 冲洗试管，并将冲洗液加入培养板中，此步骤切勿遗漏。孵育第三天后，使用显微镜更换培养基，以避免移除类胚体。移液时将移液枪头靠近培养板边缘。第七天时，将类胚体转移至已用37摄氏度预温30分钟的0.1%明胶包被的培养板中。在每个 35 毫米培养皿中加入 35 至 40 个体胚，加入 2 毫升培养基。培养期间，每周定期换液两次。检查胚状体中是否存在搏动区域，并标记出搏动区域的位置。在培养皿盖的上方，搏动并收缩的区域通常在约10至20天后出现。当出现自发收缩的区域时，将其培养基更换为EBM-2。在收缩区域出现后，继续培养并监测培养板上其他区域，持续长达一个月时间。总体而言，在EBM中，分化过程的缺陷高度依赖于多个因素，其中最关键的因素是特定的细胞系以及用于诱导心肌分化的血清批次。为了获得最高的效率，需测试多个细胞系的心源性潜能以及不同批次的血清。首先包被12。在 PBS 中每平方厘米包被 5 微克纤连蛋白，每孔加入 300 微升，应完全覆盖每个孔的表面。将培养板置于细胞培养超净台中敞口干燥。为去除细胞培养中的成珠区域，使用拉制的玻璃移液管和手术刀。然后使用1 mL移液器将4至5个组织块转移至经纤维连接蛋白包被的培养板的每个孔中。完成所有组织块收集后，在收集板的加样孔中加入1 mL EBM-2培养基，并标记已取出细胞的区域。随后更换培养基，并将培养板放回培养操作台。若在体视显微镜下需要更小的搏动细胞团，可将移植区域通过移液管吹打。此操作可产生含有少量搏动细胞的小细胞簇。在培养过程中进行。每两周更换两次培养基，直至样品准备好进行分析。首先，准备4厘米见方的双腔载玻片，通过加入用足量PBS稀释的20 µg纤连蛋白以覆盖表面进行包被。如果使用玻璃支撑物，则额外添加20 µg层粘连蛋白。按照先前所述方法分离珠状培养区域。使用1 mL移液器将细胞转移至含有500 µL胶原酶管的15 mL离心管中。将细胞孵育15分钟，并在孵育期间摇动试管一次。孵育15分钟后，若仍有细胞团块残留，用200微升移液器吹打细胞以去除团块。将细胞转移至新鲜的collagenase two中，当无大团块残留时重复孵育。通过加入三毫升不含乙酸的EBM two终止消化，上述溶液均需预先配制。将试管置于通风橱内的加热架上保存，然后在室温下以1000 × g离心4分钟。离心后，用1 mL含0.25%胰蛋白酶-EDTA的PBS将来自同一初始样品的细胞组分重悬。随后将悬液放入加热块中孵育5分钟，并用4 mL不含维生素A的EBM-2培养基终止胰蛋白酶反应。接下来，使用2.5毫升注射器上的18号针头反复吹打细胞，最多七次，直至显微镜下观察不到大的细胞团块。然后以1000 × g离心4分钟。将细胞沉淀重悬于E BM2中，并接种至2孔板玻片上。细胞经两到三天的孵育后即可用于分析。CMS 来源于多个 IPS 细胞系。这些细胞系最初是在甲基绿饲养层上建立的，随后立即转移至使用定义培养基的 Matrigel 上培养。细胞呈现出类似人类胚胎干细胞的形态，具有明亮的相位边缘和明显的细胞核。免疫荧光分析显示，诱导多能干细胞正确表达了转录因子T四，并表达了TRA一六零表面抗原。流式细胞术分析证实了典型表面多能性抗原SSEEA四和TRA一六零的表达。分选策略如左侧散点图所示。还对在基质胶上生长的IP FS细胞进行了核型分析。通过将IPS细胞聚集成类胚体（ebs），并在特定类型血清存在下进行培养，诱导其向心肌细胞系分化。根据所使用的细胞系，山梨酸收缩区域占整个培养区域的20%至35%。通过酶消化法从这些区域分离出收缩性CMS，并分析其蛋白质表达。逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）结果显示，由诱导性多能干细胞（IPS）衍生的跳动细胞表达心脏特异性离子通道，而在非跳动细胞中则无此表达。这些通道包括一种电压门控钙通道的 α1 亚基、一种 V 型电压门控钠通道的 α 亚基、一种属于 KQT 样亚家族的电压门控钾通道，以及两种形式的肌球蛋白。重链免疫荧光分析显示，单个诱导多能干细胞（IPS）来源的心肌细胞表达了结构蛋白，包括 α-肌节肌动蛋白、心肌肌钙蛋白 I 以及心肌特异性连接蛋白 connexin 43。总之，该技术为在体外建立心肌疾病模型奠定了基础，并使得在不向人体内注射药物的情况下，在人类细胞背景下进行药物实验成为可能。观看本视频后，您应能充分了解如何在无饲养层条件下培养诱导多能干细胞（iPS细胞），并利用基于拟胚体聚集的方法将其分化为心肌细胞。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

人类心肌细胞的生成：从馈线人类诱导多能干细胞的分化协议

我们已建立了一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导心肌母细胞的方案，该方法能够大量获得用于心血管修复的人心脏前体细胞和功能性心肌细胞。...

高效诱导多能人胚胎干细胞生成人心脏前体细胞和心肌细胞的小分子方法

本文详细描述了通过选择性调控Wnt信号通路，将人多能干细胞高效分化为心肌细胞的方法，并随后通过流式细胞术分析参考标志物，以评估细胞群体的均一性和身份特征。...

高效率诱导人多能干细胞分化为心肌细胞及通过流式细胞术进行表征

本文介绍一种稳定的人心肌细胞诱导方案，该方案结合了小分子调控的心脏分化与葡萄糖剥夺介导的心肌细胞纯化，可实现高纯度心肌细胞的制备，适用于心血管疾病建模与药物筛选。...

利用小分子调控分化及后续葡萄糖饥饿法从人诱导性多能干细胞中衍生高纯度心肌细胞

从多能干细胞生成心肌细胞 体外 可获取大量心脏组织 体外 用于基础科学与临床应用。该方案利用心房化因子...

利用BMP拮抗剂Grem2从多能干细胞分化心房型心肌细胞

本文介绍一种针对人多能干细胞（hPSCs）的稳定、快速且可扩展的心肌细胞分化方案。利用该大规模方法获得的心肌细胞可提供足够数量的细胞，有效用于人类心血管疾病建模、高通量药物筛选，以及潜在的临床应用。...

利用高可重复性小分子诱导分化方案实现人多能干细胞向心肌细胞的大规模生产

我们提出了三种新颖且更高效的方案，用于将人诱导性多能干细胞分化为心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，并提供了一种递送方法，通过结合细胞注射与补片介导的细胞因子递送，提高移植细胞的定植效率。...

多能干细胞来源的心脏细胞用于心肌修复

对人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CMs）进行电生理表征，对于心脏疾病建模及评估药物反应至关重要。本方案提供了将hPSC-CMs解离并接种于多电极阵列上的必要信息，用于测量其场电位，并介绍了一种分析QT间期和RR间期的方法。...

利用多电极阵列（MEAs）对人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CMs）进行电生理分析

本文介绍了一种高效利用年轻来源的人类间充质干细胞的心脏分化潜能以生成具有功能且能够收缩的心肌样细胞的方法。...

体外 人源间充质干细胞向功能性类心肌细胞的分化

本文介绍一种可扩展的方法，通过简单组合使用Activin...

从人多能干细胞生成第一心场样心脏前体细胞及心室样心肌细胞

本文包含一系列实验方案，用于在多孔微电极阵列（MEA）板上培养人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CM）网络，并通过可逆电穿孔技术穿透细胞膜，以记录动作电位。可在数天内对相同的细胞位点进行多次高通量记录。...

基于多孔微电极阵列的人类诱导多能干细胞衍生心肌细胞网络用于重复动作电位记录

本文介绍了一种从患者外周血单个核细胞稳健地生成并扩增人心肌细胞的实验方案。...

从患者外周血单个核细胞生成与扩增人心肌细胞

了解利用无饲养层人类诱导多能干细胞通过拟胚体聚集分化为功能性心肌细胞的方法。该技术通过免疫荧光检测心肌肌钙蛋白表达，为心血管疾病建模和药物筛选提供可重复的心脏细胞来源。

人类心肌细胞的生成：从无饲养层人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞制备方案

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