人类心肌细胞的生成:从馈线人类诱导多能干细胞的分化协议

该程序的总体目标是区分人心肌细胞与在无饲养层条件下培养的人 IPS 细胞。这是通过首先将 IPS 细胞接种到超低附着板中以形成胚胎体来实现的。该程序的第二步是将形成的胚胎体转移到明胶涂层的培养皿中。

当收缩区域出现时，在立体显微镜下手动解剖并接种在纤连蛋白涂层的培养皿上。为了进一步分化，最后一步是通过酶消化收缩簇获得单个心肌细胞。最终，结果可以通过免疫荧光显微镜显示表达典型结构标志物 IE 心肌肌钙蛋白的心肌样细胞的分化。

这种方法可以帮助回答心血管生物学领域的一个关键问题，例如，哪些是驱动心脏发育过程中心脏分化和功能障碍的机制以及人类心肌细胞水平的疾病。这是一项非常有趣的技术，因为它允许在体外从人类患者和人类个体产生心肌细胞。在第二个实例中，它允许在试管中概括疾病，以便可以在体内之前对新药进行体外实验。

实验 从在 35 毫米基质胶涂层板上生长的融合 IPS 细胞培养物开始。用 1 毫升含有 1 毫克 diss 的 PBS 替换生长培养基。使用轮询玻璃移液器检查细胞。

去除具有分化细胞的区域，例如菌落中心的火山口状或囊性结构。还要删除细胞分离、变平和似乎向外迁移的任何区域。现在，在培养罩下在 37 摄氏度下孵育剩余的细胞，直到集落边界变得更亮并开始分离。

这通常需要 5 到 7 分钟。此时，去除 dispa 溶液并用 1 毫升 HESM 洗涤细胞。然后丢弃洗涤液。

在新鲜的 HESM 中，使用细胞提升器收获菌落。将菌落收集到 15 毫升试管中。接下来，用另一毫升 HESM 冲洗细胞，并以 1000 倍 G 的速度离心 4 分钟。

然后继续将细胞接种在基质胶上，并在培养过程中每天更换培养基。首先收获上一节所述的未分化 IPS 集落。分离出未分化的种群后，轻轻复苏将它们悬浮在一毫升 EBM 20 中。

使用 2 毫升移液器，不要将细胞团块打碎太多。将移液限制为 2 或 3 次冲程。在两次笔触之间检查立体镜下的菌落大小。

当菌落的大小都差不多时，它们不需要进一步混合。现在将细胞接种在超低附着板上，每块收获的细胞板填充一个 6 孔板。不要忘记用 1 毫升 EBM 20 冲洗试管，并将冲洗液分配到板上。

孵育第 3 天后，使用显微镜更换培养基，以避免去除胚胎体。使移液器靠近板的边缘。第 7 天，将胚胎体移至涂有 0.1% 明胶的板中，并在 37 摄氏度下加热 30 分钟。

在每块 35 毫米的培养皿中加入 35 至 40 个胚胎体，加入 2 毫升培养基中。在培养过程中。每周定期更换培养基两次。

检查胚胎体是否有跳动区域，并标出串珠区域的位置。在培养皿的顶部，覆盖珠状收缩区域应在大约 10 到 20 天后出现。当出现自发性收缩的区域时，将其培养基切换到 EBM 2 收缩区域出现后，继续培养和监测平板上的其他区域长达一个月。

总共。在 EBM 二中，分化过程的缺陷高度依赖于几个因素，其中最关键的是特定的细胞系和用于诱导心脏分化的血清批次。为了获得最高效率，测试几条心源性潜能和不同批次的血清 首先包衣 12.

每孔 300 微升 PBS 中纤连蛋白含量为 5 微克/平方厘米的孔板应完全覆盖每个孔的表面。让板在细胞培养罩中不加盖晾干。要去除细胞培养物的珠状区域，请使用拉动的玻璃移液管和手术刀。

然后使用 1 毫升移液器将 4 到 5 个夹子转移到纤连蛋白包被板的每个孔中。完成所有收集后，将 1 毫升 EBM 2 添加到收集板上的加载孔中，标记去除细胞的区域。然后更换培养基并将板放回培养罩中。

如果在立体显微镜下需要较小的跳动团块，请将外植区域通过移液管。这会产生包含一些跳动细胞的小簇。在文化中。

每周更换培养基两次，直到准备好进行分析。首先，准备 4 厘米见方的两室载玻片，用 20 微克纤连蛋白涂覆在足够的 PBS 中稀释以覆盖表面。如果使用玻璃支架，请额外添加 20 μg 层粘连蛋白。

如前所述隔离微珠培养区域。使用 1 毫升移液器，将细胞转移到含有 500 微升胶原酶管的 15 毫升管中。孵育细胞 15 分钟，并在孵育过程中摇动试管一次。

15 分钟后，用 200 μL 移液器移动细胞，如果仍有团块，则去除团块。将细胞转移到新鲜的胶原酶 2 中，当没有大块时重复孵育。通过添加 3 毫升 EBM 结束消化，其中两毫升不含 som，因为它们各自准备好。

将试管存放在通风橱下的加热架中，然后在室温下以 1000 倍 G 离心 4 分钟。离心后，将来自同一初始样品的细胞组分悬浮在一毫升 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 的 PBS 溶液中。然后将悬浮液在加热块中孵育 5 分钟，用 4 毫升 E BM 2 灭活胰蛋白酶，不含 As Soin。

接下来，将细胞通过 2.5 毫升注射器上的 18 号针头最多 7 次，直到在显微镜下看不到大团块。然后以 1000 倍 G 离心细胞 4 分钟。现在将细胞沉淀重悬于 E BM 2 中，并将它们接种在两个孔室载玻片上。

孵育 2 到 3 天后，细胞即可进行分析。CMS 由几种 IPS 细胞系产生。这些品系最初是在冰毒饲养层上生成的，并立即使用确定的培养基放置在基质胶上。

细胞显示出类似人类 ESC 的形态，具有相位亮边和突出的细胞核。免疫荧光分析显示 IPS 细胞正确表达转录因子 T 4 并表达 TRA one 60 表面抗原。Cyto 荧光测定分析证实了典型表面多能性抗原 SS EEA 4 和 TRA one 60 的表达。

门控策略显示在左侧散点图中。还对在基质凝胶上生长的 IP FS 细胞进行了核型分析。IPS 细胞聚集到 ebs 中，并在特定类型血清存在下培养，从而触发对心脏谱系的诱导。

由于山梨酸收缩面积占总培养物的 20% 至 35%，具体取决于所使用的细胞系。通过酶消化从这些区域分离收缩 CMS 并分析蛋白质表达。R-T-P-C-R 发现心脏特异性离子通道在 IPS 衍生的跳动细胞中表达，但在非跳动细胞中不表达。

这些通道包括一个 α 离子、电压依赖性钙通道的一个亚基、5 型电压门控钠通道的 α 亚基、KQT 的钾电压门控通道，就像亚家族一样，以及肌球蛋白的两种形式。重链免疫荧光分析显示，单个 IPS 衍生的心肌细胞表达结构蛋白、α 肌节、肌动蛋白、心肌肌钙蛋白 I 和心脏特异性连接 conexion 43。毕竟，这项技术确实为体外心肌疾病的建模铺平了道路，并允许在人体环境中进行药物实验，而无需将药物注射到人体中。

看完这个视频，你应该对如何将 IPS 细胞维持在游离状态，并通过基于胚胎体聚集的方法将它们分化为心肌细胞有了很好的了解。