一线虫研究Amylopathy模型系统
May 17th, 2013
我们描述的方法来研究蠕虫amylopathies方面 C。线虫。我们将展示如何构建表达Aβ的蠕虫 42在神经元和如何测试其功能行为分析。进一步的研究表明如何获取药理试验，可用于主培养的神经元。
该程序的总体目标是评估 β 淀粉样蛋白毒性对神经元功能和生存的影响。这是通过首先在 SE 感觉神经元中构建表达淀粉样蛋白 β 肽和 GFP 报告基因的转基因 C 优雅蠕虫来实现的。接下来，通过趋化性测定评估在 SE 神经元中表达 β 淀粉样蛋白的行为后果。
第三步是获得 A SE 神经元的原代培养物，然后用 Q-V-D-O-P-H 等药理学试剂处理培养的神经元，以抑制 β 淀粉样蛋白的毒性作用。最终，结果可以通过行为和药理学分析显示 β 淀粉样蛋白毒性对 SE 神经元功能和存活率的影响。这种方法可以帮助回答有关神经退行性变的关键问题，例如阐明特定的细胞和分子机制。
β 淀粉样蛋白寡聚体的潜在神经毒性作用。演示这些程序的是我实验室的博士后 Zing Dwan 博士。对于转化，需要 2%的 agros 注射垫。将一滴溶解在水中的热 aros 放在玻璃盖玻片上，然后迅速将第二滴盖玻片放在玻璃盖玻片上并轻轻敲击。
制备注射混合物时，确保将顶部 5 微升（无碎屑和其他污染物）集中并转移到新管中，以便通过毛细管作用将注射负载、注射混合物和空质粒放入注射移液管中。半微升通常足以注射 100 条蠕虫以扩大注射移液管上的开口，将其尖端摩擦安装在载玻片上的盖玻片的边缘Halo carbon 700 油。开场的质量至关重要。
它通过吸头形状来判断，最重要的是，通过流速来判断，流速是通过流量和移液器吸头处响应注射压力而形成的气泡的大小来评估的。现在将一滴 700 神圣碳油滴在注射垫上，并将几条蠕虫转移到注射垫上。使用蠕虫镐将蠕虫向下推到垫子上，直到它们粘附在 aros 上。
蠕虫应排成行，腹侧对齐。避免触摸他们的头部。如果多次尝试后蠕虫仍未粘附在垫子上，请尝试使用新的垫子或增加垫子的厚度或浓度。
现在将移液器插入蠕虫。首先，移动载物台，将蠕虫定位在移液器下方。将移液器放在性腺的中央核心旁边。
因为它的细胞质由许多生殖细胞核共享，这提高了注射的 DNA 传递给后代的可能性。移液器应几乎与蠕虫平行。第三，将尖端垂直移向身体，直到皮肤凹陷。
最后，轻轻敲击机械手以诱导尖端插入。现在注入 DNA 溶液。对移液管施加压力，直到性腺肿胀。
然后停止流路并将蠕虫从移液器上拉出。测试针头的流动，然后在继续下一个蠕虫之前注射其他性腺。注射后，向蠕虫中加入约 10 微升恢复缓冲液，等待它们开始游泳。
游泳后，加入等体积的 M nine 缓冲液。当蠕虫恢复游泳时，继续添加 M 9，直到溶液大部分为 M 9。现在将每个蠕虫转移到坐座板上。
在 50 毫升 falcon 管中收集 1 毫升 M 9 缓冲液中的 GR 蠕虫。然后使用 M nine 缓冲液，通过重复离心和更换溶液来洗涤蠕虫，直到洗涤后 M nine 澄清。接下来，向虱子中加入 10 体积的碱性次氯酸盐溶液。
颗粒状蠕虫在室温下孵育蠕虫，直到其中约五分之四断裂，这通常需要 10 分钟。通过取等分试样用显微镜观察来监测反应。通过加入等体积的无菌鸡蛋缓冲液来终止反应。
然后以 450 G 离心 5 分钟收集鸡蛋和胴体。轻轻去除上清液。重新加入等体积的鸡蛋缓冲液，再次以 450 G 离心试管 5 分钟。
重复该过程，直到缓冲液清除。现在将鸡蛋在 M 9 缓冲液中孵育过夜，第二天，将它们接种在标准 NGM 板上。准备几块琼脂，每边大约半厘米。
将琼脂块浸泡在含有所需引诱剂的溶液中 2 小时。将琼脂块存放在 10 厘米的测试板中，其中已标记测试点和对照点的位置。每个实验准备五个这样的板。
第二天在 20 摄氏度下放置过夜，让板形成化学梯度。实验前，向板上的每个点添加 10 微升 20 毫摩尔叠氮化钠。这起到麻醉剂的作用。
通过在板的中心放置 20 个年龄同步的蠕虫来开始实验，然后将板放入 20 摄氏度的培养箱中一小时。一小时后，对对照点上的测试动物进行计数并计算 CI 指数。如前所述裂解 gr 蠕虫并清洁鸡蛋和胴体后，将它们重新悬浮在 2 毫升无菌鸡蛋缓冲液中，并在鸡蛋缓冲液中加入 2 毫升无菌 60% 蔗糖。
然后用手或涡旋混合试管，直到鸡蛋完全重悬。将重悬的鸡蛋以 450 倍 G 离心 15 分钟。然后小心地收集装满鸡蛋的上清液，丢弃上颚以去除残留的蔗糖，将鸡蛋重悬于鸡蛋缓冲液中，并以 450 G 离心 5 分钟。
轻轻收集并丢弃上清液，然后在通风橱上重复清洁过程 3 次。使用每毫升几丁质酶含有 1 个单位的无菌鸡蛋缓冲液重悬沉淀的鸡蛋。让鸡蛋在室温下消化 30 分钟，然后开始在倒置细胞培养显微镜下监测反应。
当 70% 至 80% 的蛋壳被消化后，加入 5 毫升 L 15 完全培养基或 CM 15。要分离细胞，请通过让细胞流过 27 号针头几次来解离细胞，使它们不会形成团块。现在将溶液通过带有 5 微米过滤器的注射器。
通过在 450 G 离心 15 分钟来沉淀解离的细胞悬液。然后去除上清液，将沉淀的细胞重悬于 CM 15 中。为确保细胞解离，请在显微镜下检查悬浮液。
最后，将解离的细胞接种在先前包被的玻璃盖玻片上。使用花生凝集素，细胞可以在室温下用正常空气维持两周以上。使用所描述的转化技术，构建了一条转基因蠕虫，在 a SE 神经元中表达人类 β 42，该神经元使用趋化性测定检测水溶性引诱剂，如生物素。
对 7 日龄的转基因蠕虫进行了测试。对照在找到生物素方面没有问题。相比之下，只有少数表达 beta 42 的蠕虫能找到引诱点。
在 3 至 4 天时，生物素的趋化指数分别为 0.68 和 0.12 对照和实验蠕虫。指数也有一个小幅但可察觉的下降。培养的 A SER 神经元在 4 天后 9 天后仍表达 GFP。
然而，GFP 荧光消失，怀疑细胞凋亡验证了这一理论。如前所述制备原代 A SER 神经元，并补充广谱 caspase 抑制剂。正如预期的那样，治疗停止了荧光的丢失，证实了人 A β 42 的表达触发了 A SER 神经元的凋亡。
看完这个视频，你应该对如何构建优雅的转基因蠕虫，在行为论文中研究它们，以及如何从安布罗斯获得原代培养物有一个很好的了解。
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概述
本文描述了在秀丽隐杆线虫中研究β-淀粉样蛋白毒性的方法，重点关注神经元功能和存活。它详细介绍了表达人类Aβ 42的转基因蠕虫的构建，以及通过趋化性实验评估它们的行为。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 神经退行性变
- 转基因模型
背景
- β-淀粉样蛋白与神经退行性疾病有关。
- 秀丽隐杆线虫是研究神经元功能的模型生物。
- 了解β-淀粉样蛋白的影响可以为神经退行性变提供洞察。
- 行为评估可以揭示有毒肽对神经元健康的影响。
研究目的
- 评估β-淀粉样蛋白对神经元功能和存活的影响。
- 阐明神经退行性变的细胞和分子机制。
- 评估可能减轻β-淀粉样蛋白毒性的药理学药剂。
使用的方法
- 构建表达带GFP报告基因的β-淀粉样蛋白的转基因秀丽隐杆线虫。
- 使用趋化性实验评估行为后果。
- 分离SE神经元的原代培养物。
- 用药理学药剂处理培养的神经元以评估保护作用。
主要结果
- 行为评估显示β-淀粉样蛋白对神经元功能的影响。
- 药理学治疗显示可能抑制β-淀粉样蛋白毒性的潜力。
- 结果有助于理解神经退行性变的机制。
- 发现可能为神经退行性疾病的未来治疗策略提供信息。
结论
- 该研究为研究神经元中β-淀粉样蛋白毒性提供了一个框架。
- 转基因秀丽隐杆线虫可以成为神经退行性变研究的有价值的工具。
- 行为和药理学评估在评估神经元健康方面是有效的。
常见问题
Executive Industry Relevance
Transgenic Caenorhabditis elegans models expressing human amyloid beta enable rapid, mechanistically grounded interrogation of neurodegenerative pathways relevant to amylopathies. This system supports predictive confidence in early-stage target validation and de-risking of neurotoxicity hypotheses, directly informing portfolio triage for neurodegeneration programs. The approach bridges molecular mechanism elucidation with scalable, reproducible behavioral and cellular readouts for enterprise R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of amyloid beta neurotoxicity in a genetically tractable organism.
- Supports mechanistic de-risking by linking transgene expression to quantifiable neuronal dysfunction.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of neurodegenerative pathways using behavioral and cellular assays.
- Provides a platform for rapid iteration and triage of neurodegeneration targets.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized chemotaxis assays for quantitative assessment of neuronal function.
- Enables reproducible behavioral phenotyping for compound screening readiness.
- Supports development of primary neuronal culture assays for pharmacological evaluation.
- Allows for scalable, cross-comparable outputs across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns disease-relevant amyloid beta toxicity with measurable phenotypes in a whole-organism context.
- Provides continuity from molecular mechanism to functional outcome, supporting translational biomarker strategies.
- Enables risk-adjusted advancement of neuroprotective candidates based on in vivo and in vitro data.
- Supports predictive de-risking for preclinical neurodegeneration pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This model system integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis testing and compound evaluation in neurodegeneration research.
- Discovery Biology: Facilitates null hypothesis testing of amyloid beta-induced neurotoxicity and pathway clarification.
- Screening: Provides validated, reproducible chemotaxis and neuronal survival assays for compound assessment.
- Analytics: Generates quantitative behavioral indices and cellular viability readouts for robust statistical comparison.
- Translational Research: Links molecular and functional endpoints, supporting biomarker alignment and translational continuity.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, scalable platform for ongoing neurodegeneration target and compound evaluation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodegeneration target validation.
- Operational Value: Standardizes behavioral and cellular assays for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of neuroprotective strategies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and cross-program comparability in neurodegeneration pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in transgenic manipulation and behavioral phenotyping of C. elegans.
- Demands access to microinjection, fluorescence microscopy, and cell culture infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of chemotaxis and neuronal culture protocols.
- Adaptation to other neurodegenerative targets may require construct and assay optimization.
- Behavioral and cellular outputs must be interpreted within the context of organismal complexity and model limitations.
