一种用于淀粉样病变研究的 Caenorhabditis elegans 模式系统

本实验的总体目标是评估淀粉样蛋白β（amyloid beta）毒性对神经元功能和存活的影响。首先构建表达带有GFP报告基因的淀粉样蛋白β多肽的转基因秀丽隐杆线虫（C. elegans），该报告基因在SE感觉神经元中表达。随后，通过趋化性实验评估在SE神经元中表达淀粉样蛋白β所产生的行为学后果。

第三步是获取SE神经元的原代培养物，然后用Q-V-D-O-P-H等药理学试剂处理培养的神经元，以抑制β-淀粉样蛋白的毒性作用。最终，可通过行为学和药理学检测方法揭示β-淀粉样蛋白毒性对SE神经元功能和存活的影响。该方法有助于回答关于神经退行性变的关键问题，例如阐明特定的细胞和分子机制。

淀粉样蛋白β寡聚体潜在的神经毒性效应。演示该实验操作的是我实验室的博士后Dr.Zing Dwan。转化时需要使用含2%琼脂糖的注射垫。将一滴溶于水的热琼脂糖滴加到一块玻璃盖玻片上，迅速将另一块盖玻片覆盖在液滴上，并轻轻按压。

配制注射混合液时，务必离心并转移上层5 µL无碎片和其他污染物的液体至新的离心管中，用于注射。通过毛细作用将注射混合液和空载质粒吸入注射针。通常半微升（0.5 µL）足以注射100条线虫。为扩大注射针的开口，可将其尖端在载玻片上固定的盖玻片边缘轻轻摩擦，载玻片上需滴加Halo carbon 700油。开口的质量至关重要。

通过尖端形状来判断，最重要的是通过流速来评估，即根据注射压力下在移液管尖端形成的液流和气泡大小来判断。现在，在注射垫上滴加一滴 700 hallow 碳油，并将多条线虫转移到垫上。使用线虫挑取工具将线虫压到垫上，使其附着在 aros 上。

应将蠕虫按行排列，使其腹面保持对齐。避免触碰其头部。若经过多次尝试后蠕虫仍无法粘附在垫片上，可尝试更换新的垫片，或增加垫片中琼脂的厚度或浓度。

现在将移液管插入线虫体内。首先，移动载物台，使线虫位于移液管下方。将移液管置于性腺中央核心旁边。

由于其细胞质被多个生殖细胞核共享，这提高了注入的DNA传递给后代的可能性。移液管应几乎与线虫平行放置。第三步，将移液管尖垂直向下移动，直至接触到体壁并使其下陷。

最后，轻轻敲击显微操作仪，促使移液尖端插入。现在注入DNA溶液，对移液管施加压力，直至性腺膨胀。

然后停止液体流动，将线虫从移液器上取下。测试针头的液体流通情况，随后在进行下一条线虫操作前，对其他性腺进行注射。注射完成后，向线虫中加入约10微升复苏缓冲液，等待其开始游动。

开始游动后，加入等体积的M九缓冲液。当线虫恢复游动时，继续添加M九缓冲液，直至溶液主要为M九缓冲液。随后将每条线虫转移至一个放置好的培养板中。

在50毫升离心管中，用1毫升M9缓冲液收集GR线虫。然后使用M9缓冲液，通过反复离心并更换上清液的方式清洗线虫，直至洗涤后的M9缓冲液变得澄清。接着，向线虫中加入10倍体积的碱性次氯酸盐溶液。

将虫体沉淀在室温下孵育，直至约五分之四的虫体破裂，通常需要10分钟。通过取等分试样在显微镜下观察来监测反应进程。加入等体积的无菌卵缓冲液以终止反应。

然后在450 G离心5分钟，收集卵和尸体。轻轻移除上清液。加入与上清液体积相等的卵缓冲液，再次在450 G离心5分钟。

重复该步骤，直至缓冲液澄清。现在将卵在M九缓冲液中孵育过夜，次日将其接种至标准NGM平板上。准备数块琼脂，每块边长约0.5厘米。

将琼脂块浸泡在含有目标引诱剂的溶液中两小时。在已标记测试点和对照点位置的 10 厘米培养皿中放入一块琼脂块。每次实验准备五个这样的培养皿。

将平板在20摄氏度下静置过夜，使其形成化学梯度。实验前，在平板的每个点上加入10微升20毫摩尔的叠氮化钠，以起到麻醉作用。

将20只年龄同步的线虫放置在培养皿中央，启动实验，随后将培养皿置于20°C恒温培养箱中孵育1小时。1小时后，计数实验点与对照点上的线虫数量，并计算CI指数。按照前述方法裂解gr线虫并清洗卵和尸体后，将其重悬于2毫升无菌卵缓冲液中，并加入2毫升用卵缓冲液配制的无菌60%蔗糖溶液。

然后用手或涡旋振荡器混匀试管，直至卵子完全重悬。将重悬的卵子在450 × g条件下离心15分钟。随后小心收集含有卵子的上清液，并弃去沉淀以去除残留的蔗糖，将卵子重悬于卵缓冲液中，并在450 × g条件下离心5分钟。

在生物安全柜中轻轻收集并弃去上清液，然后重复清洗过程三次。用含有每毫升一个单位的几丁质酶的无菌卵缓冲液重悬沉淀的卵。将卵在室温下消化30分钟，然后在倒置细胞培养显微镜下开始监测反应。

当70%至80%的卵壳被消化后，加入5毫升完全L-15培养基（CM 15）。为了分离细胞，通过27号针头反复吹打数次，使细胞充分解离，避免形成团块。随后将溶液通过带有5微米滤膜的注射器过滤。

将解离的细胞悬液在450 ×g条件下离心15分钟，沉淀细胞。然后弃去上清液，并将沉淀的细胞重悬于CM 15培养基中。为确认细胞已充分解离，需在显微镜下检查细胞悬液。

最后，将解离的细胞接种到预先包被的玻璃盖玻片上。使用花生凝集素包被后，细胞可在室温及正常空气条件下维持超过两周。利用所述的转基因技术，构建了一种转基因线虫，使其在ASE神经元中表达人源Aβ42蛋白；ASE神经元可通过趋化性实验检测生物素等水溶性吸引物。

对出生七天的转基因蠕虫进行了测试。对照组在寻找生物素时没有困难。相比之下，只有少数表达 beta 42 的蠕虫能够找到吸引剂斑点。

在三到四天时，生物素的趋化性指数分别为0.68和0.12，对应对照组和实验组线虫。此外，该指数也出现了轻微但可检测到的下降。一个培养的A SER神经元在出生后第九天仍表达GFP。

然而，GFP荧光消失，提示可能发生凋亡，为验证这一假说，按前述方法制备原代A SER神经元，并添加广谱caspase抑制剂。结果正如预期，该处理阻止了荧光的丢失，证实人源Aβ42的表达可触发A SER神经元的凋亡。

观看本视频后，您应能充分了解如何构建精巧的转基因线虫，如何在行为学实验中对其进行研究，以及如何从Ambrose获得原代培养物。