Name: 重组脂膜的结构和功能研究的钾离子通道 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: 了解电压门控钾离子通道在脂质膜中的重组技术，用于研究膜蛋白与脂质的相互作用。该方法结合电生理记录和电子晶体学分析，为神经科学和生物物理学研究提供重要工具。

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姜实验室在KvAP方面的研究得到了洛克菲勒大学Roderick MacKinnon博士实验室的大力支持。特别感谢Kathlynn Brown博士和Michael McQuire在噬菌体筛选实验方面提供的建议和帮助。本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH，项目号GM088745和GM093271，授予Q-XJ）以及美国心脏协会（AHA，项目号12IRG9400019，授予Q-XJ）的资助。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

将KvAP通道重构到不同膜中的方法已在多项研究中被采用8-10。基于确保脂质在去垢剂/脂质混合胶束与蛋白/去垢剂/脂质混合胶束之间充分分布的思路，我们能够实现KvAP几乎完全地重构到由差异显著的脂质组成的膜中。每个四聚体KvAP通道需要约100个脂质分子以完全覆盖其跨膜结构域。关键要求是在去除去垢剂之前，允许足够数量的脂质分子融合进入蛋白/脂质/去垢剂胶束。我们的标准条件（0.5 mg蛋白和5.0 mg脂质）可确保平均每分子蛋白对应约1,000个脂质分子。浮力实验和生物化学实验结果证实，该重构过程几乎完全。将通道插入黑脂膜后进行的电生理记录、利用噬菌体展示肽库对重构通道进行筛选，以及在膜中生长通道的二维晶体，均展示了膜重构技术在多种应用中的成功实现。
KvAP通道的脂质依赖性构象变化以及针对噬菌体展示肽库的筛选，展示了一条通过生化方法筛选通道阻滞剂或通道激活剂的新途径，而无需依赖电生理学手段来维持通道的特定构象8。我们成功筛选出构象特异性结合分子的结果表明，相同策略可用于寻找激活态构象的特异性结合分子。可以预见，将重构于囊泡中的通道用于单...

细胞通过特定膜蛋白的功能与其环境进行物质和信息交换1。细胞膜中的膜蛋白在膜上发挥泵、通道、受体、膜内酶、连接蛋白以及结构支撑等多种功能。影响膜蛋白的突变与多种人类疾病相关。事实上，许多膜蛋白因其在细胞膜中的重要性和易接近性，已成为主要的药物靶点。因此，理解各种膜蛋白在膜中的结构与功能至关重要，这有助于开发新方法以减轻突变蛋白在人类疾病中造成的有害影响。
脂质包围着整合在双分子层中的所有膜蛋白2, 3。在真核生物膜中，多种不同类型的脂质已知会组织成微区结构4, 5。许多膜蛋白被发现不仅分布于这些微区中，也存在于膜的主体流动相中3, 6。然而，这些微区形成的机制、膜蛋白向微区的靶向运输过程，以及此类分布的生理意义仍不清楚，尽管其重要性显而易见。研究脂质对膜蛋白影响的一个主要技术难题在于，如何将生物化学纯化的膜蛋白可靠地重构到脂质组成精确可控的人工膜系统中，从而使几乎所有重构后的蛋白都具有功能活性7。在过去几年中，我们建立了一系列方法，用于将来自A. pernix的原型电压门控钾离子通道（KvAP）重构到多种膜系统中，以开展结构与功能研究8-10。来自我们团队及其他研究者的数据显示，脂质可能是电压门控离子通道电压感应结构域构象变化的决定因素，并可能影响部分此类通道的结构形态11。接下来，我们将详细描述这些方法，并提供关键的技术要点，以确保他人能够成功重复我们的结果，并将这些方法拓展应用于其他膜蛋白的研究。

<table><tbody><tr><td>胰蛋白胨</td><td>RPI Corp.</td><td>T60060</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>RPI Corp.</td><td>Y20020</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>RPI Corp.</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>n-十二烷基-&amp;#946;-D-麦芽糖苷</td><td>Affymetrix</td><td>D322S</td><td>溶剂级</td></tr><tr><td>n-辛基-&amp;#946;-D-葡萄糖苷</td><td>Affymetrix</td><td>O311</td><td>分析级</td></tr><tr><td>抑肽酶</td><td>RPI Corp.</td><td>A20550-0.05</td><td></td></tr><tr><td>亮抑蛋白酶肽</td><td>RPI Corp.</td><td>L22035-0.025</td><td></td></tr><tr><td>胃蛋白酶抑制剂 A</td><td>RPI Corp.</td><td>P30100-0.025</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>13407000</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Bead SM-2</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>RPI Corp.</td><td>H75030</td><td></td></tr><tr><td>POPE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850757C</td><td></td></tr><tr><td>POPG</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840457C</td><td></td></tr><tr><td>DOGS</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870314C</td><td></td></tr><tr><td>DMPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>生物素-DOPE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870282C</td><td></td></tr><tr><td>DOTAP</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>890890C</td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin 琼脂糖微珠</td><td>Piercenet</td><td>29200</td><td></td></tr><tr><td>透析袋</td><td>Spectrum Laboratories, Inc</td><td>132-570</td><td></td></tr><tr><td>戊烷</td><td>Fisher</td><td>R399-1</td><td></td></tr><tr><td>癸烷</td><td>TCI America</td><td>D0011</td><td></td></tr><tr><td>MTS-PEG5000</td><td>Toronto Research Cemicals</td><td>M266501</td><td></td></tr></tbody></table>

将kv通道重构至脂质膜中用于结构与功能研究

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

为了以简化的方式研究脂质-蛋白质相互作用，必须将膜蛋白整合到具有明确脂质组成的膜中。我们正在研究一种原型电压门控钾离子（Kv）通道中的脂质依赖性门控行为，并已建立了一套详细的方案，用于将这些通道重构至不同的膜系统中。我们的重构方案综合考虑了去垢剂诱导的囊泡融合、蛋白质/去垢剂胶束与脂质/去垢剂混合胶束的融合，以及脂质在蛋白质/去垢剂/脂质胶束和脂质/去垢剂混合胶束之间达到平衡分布的重要性。实验数据表明，通道蛋白在脂质囊泡中的插入方向相对随机，且重构效率极高，在分级分离实验中未观察到可检测的蛋白质聚集体。我们已利用重构的通道确定了其在不同脂质环境中的构象状态，记录了平面脂双层中少量通道的电生理活性，从噬菌体展示肽库中筛选出构象特异性的配体，并支持通道在膜中形成二维晶体。本文所述的重构方法可适用于在脂双层中研究其他膜蛋白，尤其适用于探究脂质对真核生物电压门控离子通道的影响。

纯化KvAP通道至生化均一性的实验总体流程如图1A所示。图1B中的SDS-PAGE凝胶展示了蛋白表达与纯化过程中各阶段的典型样品。经IMAC纯化后的蛋白纯度已相对较高。KvAP通道的得率约为1.0 mg/升培养液。
脂质囊泡的去垢剂溶解需要针对每一种脂质与去垢剂的组合进行优化。POPE/POPG小单层囊泡被DM溶解的过程如图2A所示，囊泡漂浮实验的结果通常较为明确。梯度组分经SDS-PAGE分析的典型结果如图2B所示。在蔗糖密度梯度中，含有通道蛋白的POPE/POPG囊泡通常富集于10%层与35%层之间的界面处。含有KvAP的DOTAP或DOGS囊泡密度较轻，通常位于5%与10%层之间的界面（轻微渗入10%层）。如果存在较大量的多层囊泡，则通常呈现乳白色，并富集于10%-35%界面下方。我们发现，这种情况通常发生在蛋白-去垢剂-脂质混合物孵育时间不足、未能实现脂质良好分布时。
在平面脂双层中嵌...

本文描述了将一种原型电压门控钾通道完全重建到脂质膜中的操作步骤。重建后的通道适用于生化分析、电生理记录、配体筛选以及电子晶体学研究。这些方法可能普遍适用于其他膜蛋白的结构与功能研究。

将Kv通道重构至脂质膜中用于结构与功能研究

为了以简化的方式研究脂质-蛋白质相互作用，有必要将膜蛋白整合到成分明确的膜中……

本实验的总体目标是详细描述研究脂质对膜蛋白功能和结构影响的技术。首先通过表达和纯化电压门控钾离子通道来实现这一目标，第二步是进行离子通道的重建。接下来，通过脂质双层膜中的离子通道进行电生理记录，以研究离子通道的功能。最后一步是膜中离子通道的结晶，用于结构解析。最终，通过生化分析、电生理方法以及电子晶体学研究，来探究脂质对离子通道电压感应器运动的影响。初学者通常会因蛋白质重构和生物记录中的诸多技术细节而遇到困难。希望本视频能帮助您顺利完成整个实验流程并取得成功。整个实验过程将由我实验室的 Dr. Hui Jim 进行示范。在进行脂质制备之前，准备一支14毫升的一次性玻璃试管、一支带螺口盖的玻璃管，以及一支含有氯仿的250微升玻璃注射器。然后将10毫升氯仿转移至试管中。为制备POPE和POPG脂质体，将3.75毫克溶于氯仿中的POPE和1.25毫克溶于氯仿中的POPG转移至带螺口盖的玻璃管中。当无可见氯仿残留时，在持续的氩气流下干燥脂质。随后在室温真空条件下进一步干燥一小时。接着，向干燥的脂质中加入440 µL低盐缓冲液或水，涡旋混匀。用于水合脂质的试管。脂质悬液应呈现乳白色且浑浊。随后，将脂质悬液置于冰浴中进行超声处理，直至囊泡溶液变为半透明。然后向混合物中加入50微升3摩尔的氯化钾和10微升0.5摩尔的DM，使最终脂质悬浮液中含有300毫摩尔氯化钾和10毫摩尔DM，将溶液在室温下于旋转仪中孵育2小时，以促进脂质-去垢剂混合胶束的形成。孵育结束后，由于去垢剂诱导小单层脂质体（ELLA囊泡）融合，悬浮液应略微变浑浊。当蛋白浓度浓缩至超过2毫克/毫升时，加入上述组分——脂质-去垢剂混合物，定容至最终体积1毫升。然后将蛋白质-脂质-去垢剂混合物置于玻璃管中，在旋转仪上再孵育两小时。KVAP 与去垢剂溶解的 DTaP 或 DOGS 混合制备的过程，类似于 P-O-P-E-P-O-P-G 囊泡的脂质制备。然而，将水合脂质超声处理成小单层囊泡所需时间比 P-O-P-E-P-O-P-G 脂质更长，DOGS 囊泡可能会缓慢相互融合，形成微小油滴，从而完全溶解 Dote 或 DOGS。将超声处理后的囊泡与10毫摩尔的DM和40毫摩尔的beta og混合。脂质-去垢剂混合物在室温下孵育过夜，混合物应较为澄清，无任何微小颗粒或液滴。接下来，将KVAP蛋白与去垢剂溶解的DTaP或DOGS混合，蛋白与脂质的比例应小于或等于1:10。将蛋白质-去垢剂-脂质混合物在室温下孵育2至3小时，并持续进行圆周旋转。为证明去除临界胶束浓度（CMC）相对较高的去垢剂（如DM和Beta-OG）的过程较为缓慢，首先为每1毫升混合物准备2升透析缓冲液。然后剪取一段合适长度的透析管，用去离子水冲洗，检查并确保透析管无泄漏。接着，将蛋白质-脂质-去污剂混合物装入透析管中。用夹子夹紧透析管两端，使夹子下方与液面之间的空间尽可能小。将装有样品的透析管置于透析缓冲液中，并放在搅拌板上，使透析管在溶液中缓慢旋转。每八小时更换一次透析缓冲液。接下来，通过称量0.5克干态聚苯乙烯珠，为去除低临界胶束浓度（CMC）的去垢剂做准备。然后将它们放入一个50毫升的Corning离心管中，加入20毫升甲醇，在超声水浴中处理5分钟以去除夹带的气泡，并在5,000 rpm下离心5分钟。随后，彻底倾去甲醇，并用乙醇和Milli-Q水重复洗涤步骤。将洗涤后的珠子保存在4°C的20%乙醇中，并在使用前更换为无去垢剂的缓冲液。估算待处理的蛋白质-脂质-去垢剂混合物中的去垢剂含量，并计算去除去垢剂所需的珠子用量。称取湿润的珠子（不含过量水分），并直接加入蛋白混合物中，静置至少15至20分钟，以确保珠子充分发挥作用。为去除1毫升溶液中的8.7毫克DDM，共需87毫克的聚苯乙烯珠（例如Bio-Beads SM-2），将其均分为五等份。将蛋白-脂质-去污剂混合物与每一份珠子在室温下以持续翻转的方式孵育20至30分钟。离心沉淀珠子，然后将上清液转移至下一组珠子中，重复此步骤直至完成。在此步骤中，首先使用氯仿清洗玻璃试管、带聚四氟乙烯表面螺旋盖的棕色小瓶以及一套玻璃注射器。然后在氩气气流下干燥棕色小瓶。接下来，将0.75毫克POPE和0.25毫克POPG溶于氯仿中，转移至燃烧瓶内，并用氩气蒸发氯仿。随后，向瓶中加入0.2毫升戊烷以溶解干燥的脂质，然后彻底干燥以去除残留的氯仿。接着，向瓶中加入50微升癸烷以溶解干燥的脂质。现在，将脂质涂抹在双层杯圆柱表面的圆形孔洞上，注意不要让任何脂质溶液进入孔内。等待一到两分钟，使溶剂完全蒸发，以便对脂质双层中的KVAP通道进行电学记录。将杯子插入记录室，插入盐桥，并将电极连接到记录杯的两侧。将半胱氨酸溶液加入电极孔中，将CYS和跨膜溶液分别加入池室的外杯和内杯中。然后调节杯两侧之间的电位偏移，使其小于两毫伏，接着在杯盖的小孔上涂抹脂质。等待膜逐渐变薄并达到相对稳定状态。一旦膜变得稳定，将P2移液器吸头的细端置于孔上方，注入0.5至1微升含有囊泡的通道液。囊泡会穿过孔洞，沉降到杯底。为了在双层膜中测试 KVAP 通道，从 -80 毫伏的保持电位施加一个 80 毫伏的短暂脉冲。由于通道具有快速失活和激活后缓慢恢复的特性，在两次脉冲之间需给予较长的间隔时间，对于 PEPG 膜中的通道而言，该间隔约为 120 秒。一旦观察到电流幅度良好，通过向离子浓度较低的一侧添加额外的离子盐，平衡膜两侧溶液中的离子浓度。这是一张负染二维晶体的图像，处于晶体优化的中期阶段。由于糖的存在有时会导致晶体相互堆积，因此使用6% pH 6.4的钼酸铵溶液并添加0.5%甘油三醛进行染色。此处的黑色方框标示了一个区域，该区域可产生具有衍射斑点的衍射图样。此处显示的约 20 埃的冷冻电镜图像是来自一个与之前所示样品相似的二维晶体。该样品与 3% TLOs 混合后，通过直接浸入法冷冻，并在冷冻电镜下以 50,000 倍放大倍数成像。显然，晶体排列中存在局部缺陷。这是另一张进一步优化后的晶体的冷冻电镜图像。样品包埋于0.75%单宁酸和10%树精中，在50,000 ×倍率下拍摄。紧密排列中的直线表明，在此类晶体中通道排列有序，而两个黑色箭头标记了方形矢量。观看本视频后，希望您能够充分了解如何正确处理脂质和蛋白质，本视频将有助于您更高效地研究膜上脂质与蛋白质的相互作用。

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生物学

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