Name: 重组脂膜的结构和功能研究的钾离子通道 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: 了解电压门控钾离子通道在脂质膜中的重组技术，用于研究膜蛋白与脂质的相互作用。该方法结合电生理记录和电子晶体学分析，为神经科学和生物物理学研究提供重要工具。

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姜实验室在KvAP方面的研究得到了洛克菲勒大学Roderick MacKinnon博士实验室的大力支持。特别感谢Kathlynn Brown博士和Michael McQuire在噬菌体筛选实验方面提供的建议和帮助。本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH，项目号GM088745和GM093271，授予Q-XJ）以及美国心脏协会（AHA，项目号12IRG9400019，授予Q-XJ）的资助。

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<li>Vink, M., Derr, K., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+strategy+to+screen+2D+crystallization+trials+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins.</a> J. Struct. Biol. 160, 295(2007).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

将KvAP通道重构到不同膜中的方法已在多项研究中被采用8-10。基于确保脂质在去垢剂/脂质混合胶束与蛋白/去垢剂/脂质混合胶束之间充分分布的思路，我们能够实现KvAP几乎完全地重构到由差异显著的脂质组成的膜中。每个四聚体KvAP通道需要约100个脂质分子以完全覆盖其跨膜结构域。关键要求是在去除去垢剂之前，允许足够数量的脂质分子融合进入蛋白/脂质/去垢剂胶束。我们的标准条件（0.5 mg蛋白和5.0 mg脂质）可确保平均每分子蛋白对应约1,000个脂质分子。浮力实验和生物化学实验结果证实，该重构过程几乎完全。将通道插入黑脂膜后进行的电生理记录、利用噬菌体展示肽库对重构通道进行筛选，以及在膜中生长通道的二维晶体，均展示了膜重构技术在多种应用中的成功实现。
KvAP通道的脂质依赖性构象变化以及针对噬菌体展示肽库的筛选，展示了一条通过生化方法筛选通道阻滞剂或通道激活剂的新途径，而无需依赖电生理学手段来维持通道的特定构象8。我们成功筛选出构象特异性结合分子的结果表明，相同策略可用于寻找激活态构象的特异性结合分子。可以预见，将重构于囊泡中的通道用于单...

细胞通过特定膜蛋白的功能与其环境进行物质和信息交换1。细胞膜中的膜蛋白在膜上发挥泵、通道、受体、膜内酶、连接蛋白以及结构支撑等多种功能。影响膜蛋白的突变与多种人类疾病相关。事实上，许多膜蛋白因其在细胞膜中的重要性和易接近性，已成为主要的药物靶点。因此，理解各种膜蛋白在膜中的结构与功能至关重要，这有助于开发新方法以减轻突变蛋白在人类疾病中造成的有害影响。
脂质包围着整合在双分子层中的所有膜蛋白2, 3。在真核生物膜中，多种不同类型的脂质已知会组织成微区结构4, 5。许多膜蛋白被发现不仅分布于这些微区中，也存在于膜的主体流动相中3, 6。然而，这些微区形成的机制、膜蛋白向微区的靶向运输过程，以及此类分布的生理意义仍不清楚，尽管其重要性显而易见。研究脂质对膜蛋白影响的一个主要技术难题在于，如何将生物化学纯化的膜蛋白可靠地重构到脂质组成精确可控的人工膜系统中，从而使几乎所有重构后的蛋白都具有功能活性7。在过去几年中，我们建立了一系列方法，用于将来自A. pernix的原型电压门控钾离子通道（KvAP）重构到多种膜系统中，以开展结构与功能研究8-10。来自我们团队及其他研究者的数据显示，脂质可能是电压门控离子通道电压感应结构域构象变化的决定因素，并可能影响部分此类通道的结构形态11。接下来，我们将详细描述这些方法，并提供关键的技术要点，以确保他人能够成功重复我们的结果，并将这些方法拓展应用于其他膜蛋白的研究。

<table><tbody><tr><td>胰蛋白胨</td><td>RPI Corp.</td><td>T60060</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>RPI Corp.</td><td>Y20020</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>RPI Corp.</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>n-十二烷基-&amp;#946;-D-麦芽糖苷</td><td>Affymetrix</td><td>D322S</td><td>溶剂级</td></tr><tr><td>n-辛基-&amp;#946;-D-葡萄糖苷</td><td>Affymetrix</td><td>O311</td><td>分析级</td></tr><tr><td>抑肽酶</td><td>RPI Corp.</td><td>A20550-0.05</td><td></td></tr><tr><td>亮抑蛋白酶肽</td><td>RPI Corp.</td><td>L22035-0.025</td><td></td></tr><tr><td>胃蛋白酶抑制剂 A</td><td>RPI Corp.</td><td>P30100-0.025</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>13407000</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Bead SM-2</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>RPI Corp.</td><td>H75030</td><td></td></tr><tr><td>POPE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850757C</td><td></td></tr><tr><td>POPG</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840457C</td><td></td></tr><tr><td>DOGS</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870314C</td><td></td></tr><tr><td>DMPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>生物素-DOPE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870282C</td><td></td></tr><tr><td>DOTAP</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>890890C</td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin 琼脂糖微珠</td><td>Piercenet</td><td>29200</td><td></td></tr><tr><td>透析袋</td><td>Spectrum Laboratories, Inc</td><td>132-570</td><td></td></tr><tr><td>戊烷</td><td>Fisher</td><td>R399-1</td><td></td></tr><tr><td>癸烷</td><td>TCI America</td><td>D0011</td><td></td></tr><tr><td>MTS-PEG5000</td><td>Toronto Research Cemicals</td><td>M266501</td><td></td></tr></tbody></table>

将kv通道重构至脂质膜中用于结构与功能研究

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

为了以简化的方式研究脂质-蛋白质相互作用，必须将膜蛋白整合到具有明确脂质组成的膜中。我们正在研究一种原型电压门控钾离子（Kv）通道中的脂质依赖性门控行为，并已建立了一套详细的方案，用于将这些通道重构至不同的膜系统中。我们的重构方案综合考虑了去垢剂诱导的囊泡融合、蛋白质/去垢剂胶束与脂质/去垢剂混合胶束的融合，以及脂质在蛋白质/去垢剂/脂质胶束和脂质/去垢剂混合胶束之间达到平衡分布的重要性。实验数据表明，通道蛋白在脂质囊泡中的插入方向相对随机，且重构效率极高，在分级分离实验中未观察到可检测的蛋白质聚集体。我们已利用重构的通道确定了其在不同脂质环境中的构象状态，记录了平面脂双层中少量通道的电生理活性，从噬菌体展示肽库中筛选出构象特异性的配体，并支持通道在膜中形成二维晶体。本文所述的重构方法可适用于在脂双层中研究其他膜蛋白，尤其适用于探究脂质对真核生物电压门控离子通道的影响。

纯化KvAP通道至生化均一性的实验总体流程如图1A所示。图1B中的SDS-PAGE凝胶展示了蛋白表达与纯化过程中各阶段的典型样品。经IMAC纯化后的蛋白纯度已相对较高。KvAP通道的得率约为1.0 mg/升培养液。
脂质囊泡的去垢剂溶解需要针对每一种脂质与去垢剂的组合进行优化。POPE/POPG小单层囊泡被DM溶解的过程如图2A所示，囊泡漂浮实验的结果通常较为明确。梯度组分经SDS-PAGE分析的典型结果如图2B所示。在蔗糖密度梯度中，含有通道蛋白的POPE/POPG囊泡通常富集于10%层与35%层之间的界面处。含有KvAP的DOTAP或DOGS囊泡密度较轻，通常位于5%与10%层之间的界面（轻微渗入10%层）。如果存在较大量的多层囊泡，则通常呈现乳白色，并富集于10%-35%界面下方。我们发现，这种情况通常发生在蛋白-去垢剂-脂质混合物孵育时间不足、未能实现脂质良好分布时。
在平面脂双层中嵌...

本文描述了将一种原型电压门控钾通道完全重建到脂质膜中的操作步骤。重建后的通道适用于生化分析、电生理记录、配体筛选以及电子晶体学研究。这些方法可能普遍适用于其他膜蛋白的结构与功能研究。

将Kv通道重构至脂质膜中用于结构与功能研究

为了以简化的方式研究脂质-蛋白质相互作用，有必要将膜蛋白整合到成分明确的膜中……

本实验的总体目标是详细描述研究脂质对膜蛋白功能和结构影响的技术。首先通过表达和纯化电压门控钾离子通道来实现这一目标，第二步是进行离子通道的重建。接下来，通过脂质双层膜中的离子通道进行电生理记录，以研究离子通道的功能。最后一步是膜中离子通道的结晶，用于结构解析。最终，通过生化分析、电生理方法以及电子晶体学研究，来探究脂质对离子通道电压感应器运动的影响。初学者通常会因蛋白质重构和生物记录中的诸多技术细节而遇到困难。希望本视频能帮助您顺利完成整个实验流程并取得成功。整个实验过程将由我实验室的 Dr. Hui Jim 进行示范。在进行脂质制备之前，准备一支14毫升的一次性玻璃试管、一支带螺口盖的玻璃管，以及一支含有氯仿的250微升玻璃注射器。然后将10毫升氯仿转移至试管中。为制备POPE和POPG脂质体，将3.75毫克溶于氯仿中的POPE和1.25毫克溶于氯仿中的POPG转移至带螺口盖的玻璃管中。当无可见氯仿残留时，在持续的氩气流下干燥脂质。随后在室温真空条件下进一步干燥一小时。接着，向干燥的脂质中加入440 µL低盐缓冲液或水，涡旋混匀。用于水合脂质的试管。脂质悬液应呈现乳白色且浑浊。随后，将脂质悬液置于冰浴中进行超声处理，直至囊泡溶液变为半透明。然后向混合物中加入50微升3摩尔的氯化钾和10微升0.5摩尔的DM，使最终脂质悬浮液中含有300毫摩尔氯化钾和10毫摩尔DM，将溶液在室温下于旋转仪中孵育2小时，以促进脂质-去垢剂混合胶束的形成。孵育结束后，由于去垢剂诱导小单层脂质体（ELLA囊泡）融合，悬浮液应略微变浑浊。当蛋白浓度浓缩至超过2毫克/毫升时，加入上述组分——脂质-去垢剂混合物，定容至最终体积1毫升。然后将蛋白质-脂质-去垢剂混合物置于玻璃管中，在旋转仪上再孵育两小时。KVAP 与去垢剂溶解的 DTaP 或 DOGS 混合制备的过程，类似于 P-O-P-E-P-O-P-G 囊泡的脂质制备。然而，将水合脂质超声处理成小单层囊泡所需时间比 P-O-P-E-P-O-P-G 脂质更长，DOGS 囊泡可能会缓慢相互融合，形成微小油滴，从而完全溶解 Dote 或 DOGS。将超声处理后的囊泡与10毫摩尔的DM和40毫摩尔的beta og混合。脂质-去垢剂混合物在室温下孵育过夜，混合物应较为澄清，无任何微小颗粒或液滴。接下来，将KVAP蛋白与去垢剂溶解的DTaP或DOGS混合，蛋白与脂质的比例应小于或等于1:10。将蛋白质-去垢剂-脂质混合物在室温下孵育2至3小时，并持续进行圆周旋转。为证明去除临界胶束浓度（CMC）相对较高的去垢剂（如DM和Beta-OG）的过程较为缓慢，首先为每1毫升混合物准备2升透析缓冲液。然后剪取一段合适长度的透析管，用去离子水冲洗，检查并确保透析管无泄漏。接着，将蛋白质-脂质-去污剂混合物装入透析管中。用夹子夹紧透析管两端，使夹子下方与液面之

reconstitution-kv-channel-into-lipid-membranes-for-structural

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

重组脂膜的结构和功能研究的钾离子通道

将功能性膜蛋白重构到特定组分的巨型脂质体中，结合膜片钳电生理技术，是一种强大的研究方法。然而，传统的巨型脂质体制备方法可能不利于蛋白质的稳定性。本文描述了从纯脂质或含有离子通道的小型脂质体制备巨型脂质体的实验方案。...

用于成像和膜片钳电生理学研究的巨型脂质体的制备

展示了两种脱水-再水化方法——电形成法和凝胶辅助溶胀法，将跨膜蛋白KvAP重组到巨大单层囊泡（GUVs）中的过程。在这两种方法中，含有该蛋白的小区单层囊泡融合形成GUVs，随后可通过荧光显微镜和膜片钳电生理技术进行研究。...

将跨膜蛋白——电压门控离子通道KvAP——重组入巨大单层囊泡，用于显微镜与膜片钳研究

本文介绍了一种快速且有效的功能重建方法，可用于重建纯化的野生型和突变型CFTR蛋白，该方法能够保持这种氯离子通道的活性，而CFTR在囊性纤维化中存在功能缺陷。通过CFTR介导的重建蛋白脂质体中的碘离子外流，可研究通道活性以及小分子化合物的作用。...

纯化野生型和突变型CFTR蛋白的功能性重构及通道活性测定

本文描述了获取去垢剂溶解的TRPV1生化量以进行光谱分析的具体方法。这些联合方案提供了生物化学和生物物理工具，可经适当调整后用于在膜环境可控条件下开展哺乳动物离子通道的结构与功能研究。...

用于光谱分析的TRPV1纯化与重组

本方案描述了利用冷冻电子显微镜测定离子通道结构的技术，包括用于在哺乳动物细胞中高效表达基因且操作简便、毒性最低的杆状病毒系统，蛋白质提取、纯化及质量检测，样品载网的制备与筛选，以及数据收集与处理。...

人源脂质敏感型阳离子通道TRPC3的表达与纯化及其通过单颗粒冷冻电镜进行结构解析

在本文中，我们展示了将F-肌动蛋白细胞骨架包封进巨大单层脂质囊泡（也称为脂质体）的实验技术，以及在脂质体膜内小叶形成模拟细胞皮层的F-肌动蛋白层的方法。...

体外 在巨大单层囊泡内重建肌动蛋白细胞骨架

无细胞重建是研究细胞骨架组装的关键工具，过去十年的研究已建立了在简化系统中研究 septin 动态的方法。本文介绍了三种互补的方法，用于在不同膜环境中观察 septin...

在膜上重建隔蛋白组装以研究其生物物理特性与功能

本文描述了Caffrey膜结构与功能生物学研究组采用的手动设置膜蛋白在脂质介相中结晶实验的步骤。...

利用脂质介相结晶膜蛋白以进行结构测定

评估二维（2D）结晶实验以形成有序的膜蛋白阵列，是电子晶体学中一项极为关键且困难的任务。本文介绍了我们用于筛选和鉴定主要分子量在15–90...

通过电子晶体学评估小膜蛋白的二维结晶实验以用于结构生物学研究

我们将演示如何研究单个点突变对离子通道功能的影响。...

在哺乳动物细胞中异源表达离子通道的诱变与功能分析

了解电压门控钾离子通道在脂质膜中的重组技术，用于研究膜蛋白与脂质的相互作用。该方法结合电生理记录和电子晶体学分析，为神经科学和生物物理学研究提供重要工具。

将Kv通道重构至脂质膜中用于结构与功能研究

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