全细胞膜片钳红外神经刺激机制的调查

以下实验的总体目标是制作一个模型系统，以研究红外激光照明对体外听觉神经元的影响。这是通过膜片钳、全细胞配置中培养的听觉神经元来实现的，以探索它们的电特性。随后，将神经元暴露在激光照射下可以在暴露的细胞中引发电反应，这可以通过膜片钳设置进行测量。

然后可以改变照明参数和环境变量，以观察它们对激光感应电响应的影响。暴露于激光下的听觉神经元将表现出可重复的电活动，以响应每个激光脉冲以供以后分析。这种方法可以帮助回答有关螺旋神经节神经元红外刺激机制的关键问题。

虽然这种方法可以专门提供对螺旋神经节细胞的红外刺激的见解，但它也可以扩展到其他细胞类型或简化模型，例如脂质双层，以进一步阐明所涉及的物理过程。这种方法的视觉演示对于确保光传输光纤的准确定位很重要，因为产生的辐射曝光是一个关键参数，已经准备好了电阻为 2 到 6 兆欧姆的记录微量移液器。它们可以使用 CO2 激光拉拔器从借来的硅酸盐玻璃中拉出。

准备光纤耦合激光器。各种各样的光纤都可以。将带有 FCPC 连接器的跳线配置中的光纤切成两半，产生两条光纤链路，一端是连接器，另一端是裸露的光纤。

这些是辫子。通过去除纤维护套，用乙醇清洁并在显微镜下用适当的工具劈裂来准备一根尾纤的熊尖。检查尖端是否垂直于纤维轴，以及它是否看起来平坦。

如有必要，使用适当的直通连接器将光纤尾纤的另一端连接到刺激激光器的输出端。此时，请务必测量光纤的输出激光功率。在进行任何进一步的提示作后也执行此作。

现在将光纤插入卡盘并将卡盘固定到适当的微型定位器上。接下来，确定光纤与盖玻片的角度。拍摄布置的照片并使用图像 J.Now 计算角度，确保将激光器与膜片钳数据采集系统同步的连接。

膜片钳数据采集系统的数字输出应通过外部函数发生器连接到激光器，从而可以独立于数据采集系统指定激光脉冲参数，用于触发激光器的信号应连接回数据采集系统的输入端，以确保激光脉冲的时间和长度可以与电生理信号同时记录， 将灌注系统的流速设置为每分钟 1 到 2 毫升之间。带有在线加热器的重力进料系统用于快速加热溶液，蠕动泵用于通过抽吸去除用过的溶液。井。使用高倍率水浸物镜和相差将装有培养细胞的盖玻片放入正置显微镜的记录室中，定位螺旋神经节神经元。

典型的螺旋神经节神经元呈相位状、明亮、圆形、直径约为 15 微米，具有突出的细胞核。找到合适的神经元后，切换到较低放大倍率的物镜并定位目标神经元。然后使用微型定位器移动光纤，直到尖端在水平和垂直平面上都靠近目标神经元。

切换回高倍率物镜，将光纤尖端置于神经元旁边的预期位置。调整纤维的垂直位置时，纤维的底部边缘必须靠在盖唇上。为了最大限度地减少光纤位置的不确定性，可以从显微镜图像中的视觉线索中识别接触点。

纤维就位后，沿其纵轴将其向外移动已知量，以免影响微量移液器的定位。微量移液器应装满细胞内溶液，并牢固地安装在放大器的头部载物台上。使用连接到微量电极支架侧面的管路，施加少量正压，以防止微量移液器堵塞。

使用微米纵器，将微量移液器移动到目标神经元上方的位置，然后继续进行千兆欧姆密封。记录膜电容、串联电阻和输入电阻，由拟合到电流的指数曲线确定。在密封测试脉冲期间。

通过调整放大器上的 CP 快速和 CP 慢速控制，最大限度地减少电容瞬变。然后将放大器切换到全电池模式，并修改电容和电阻补偿，直到在 SEAL 测试期间观察到平坦的电流。接下来，应用串联电阻补偿，进行大约 70% 的校正、70% 的预测，调整电容和电阻补偿控制，以保持平坦的测试密封响应。

然后将放大器切换到电流钳位模式。注意在没有电流注入的情况下的静息膜电位。现在设置保持电流以将膜电位稳定在所需的水平。

中和移液器电容并调整电桥平衡以平衡电压降。通过用去极化电流刺激来检查神经元的放电特性。此时，使用与 CCD 相机耦合的成像软件将光纤移回神经元旁边的位置，捕获最初聚焦在神经元平面上的图像，然后聚焦在光纤的顶部边缘。

分析图像以确定 delta 值，即光纤上边缘相对于目标神经元中心的位置。准确了解光纤的位置非常重要。这是因为传递到目标细胞的单位能量、面积或辐射暴露是红外神经刺激的关键参数，这可能会受到纤维相对于细胞位置的显着影响。

该激光器的光功率由计算机通过直接输入激光器控制，并且可以在每次记录之前手动指定。如前所述，脉冲长度和重复率可以通过函数发生器进行控制，确保从膜片钳通道和激光触发通道以 0.25 到 5 的速度记录 1 半到 15 毫秒的激光脉冲的数据。Millijoules 通常产生可测量的电响应。最初。

将激光脉冲的重复频率设置为 1 赫兹或更小，以最大限度地减少不良影响可能很有用。设置完所有激光参数后。继续进行数据收集。

螺旋神经节神经元在电压钳和电流钳中以可重复的波形响应激光照明 响应 2.5 毫秒 0.8 毫焦耳激光脉冲的记录配置。典型的电池在各种保持电位下产生净向内电流。电流钳记录显示，在这些激光脉冲的过程中，膜去极化稳定，随后在脉冲后向静息膜电位呈近似指数下降。

在某些情况下，激光脉冲后还有一个小的额外膜去极化。用过高的能量照射或暴露在温度大幅升高的环境中可能会导致细胞损伤，通过细胞电特性恶化或细胞瞬间死亡观察到。通过遵循此程序，可以改变一系列环境参数，例如溶液温度或化学因素，以测试这些参数对激光感应电活动的影响。

不要忘记，使用激光器可能很危险，应采取标准的安全预防措施。这些措施包括使用激光护目镜、警告标志，以及确保光束不会无意中与任何高反射表面相交。