Name: RNAi介导的双基因敲除和味觉感知测量蜜蜂（蜜蜂） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-25T08:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: 学习利用RNA干扰技术对蜜蜂进行双基因敲除，并通过喙伸反应实验评估味觉感知变化。该方法揭示了卵黄原蛋白和超气门蛋白在调控蜜蜂行为中的相互作用机制。

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作者感谢 Erin Fennern 对实验的协助。本工作由挪威研究理事会（180504、185306 和 191699）、PEW 慈善信托基金以及国家衰老研究所（NIA P01 AG22500）资助。

第一部分：RNAi介导的双基因敲低
1. 双链RNA合成
<ol>
	<li>设计靶向双链RNA的引物 vg, usp 以及一个编码绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）的对照基因（GFP）该序列不在蜜蜂基因组中：引物使用在线免费软件 Primer3 设计<a href="http://frodo.wi.mit.edu/" target="_blank">http://frodo.wi.mit.edu/</a>).</li>
	<li>用于dsRNA合成的 vg，usp 和 GFP：使用 Promega 的 RiboMax T7 RNA 合成系统进行 体外 转录</li>
	<li>dsRNA 纯化：
	<ol>
		<li>变性与复性：将dsRNA在85 °C加热5分钟，然后在室温下冷却1小时。</li>
		<li>DNase I 处理：向每个 dsRNA 反应体系中加入 1 μl DNase I，通过轻弹管壁混匀。37 °C 孵育 15 分钟。</li>
		<li>向每个反应中加入 150 μl 无核酸酶水和 750 μl TRizol-LS，通过轻轻颠倒试管充分混匀。将样品在 30 °C 下孵育 5 分钟。</li>
		<li>向每个样品中加入 200 μl 氯仿，剧烈混合 20 秒。在 4 °C 条件下以 12,000 x g 离心 15 分钟。</li>
		<li>将上清液转移至各新试管中，向每管加入500 μl异丙醇。通过倒置试管混匀。在-20 °C下孵育20分钟。在4 °C下以12,000 x g离心10分钟。</li>
		<li>弃去上清，加入1,000 μl 75%乙醇洗涤沉淀。将离心管在4 °C、7,500 × g条件下离心5 min后，将双链RNA（dsRNA）沉淀室温晾干，再用无核酸酶水溶解沉淀。为确保基因下调效果，dsRNA浓度应约为9–10 μg/μl。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 双链RNA腹部注射
对于双基因敲低，有两种策略：1）单次注射：将两个基因的dsRNA混合后注射混合物；2）两日注射：第一天注射靶向一个基因的dsRNA，第二天在同一蜜蜂中注射第二个dsRNA。
<ol>
	<li>将新羽化的蜜蜂置于4 °C冰箱中冷却1-2分钟。当蜜蜂被固定后，用昆虫针将3-4只蜜蜂并排固定在装满固体石蜡的培养皿上，昆虫针应穿过其腹部与胸部之间。</li>
	<li>再次将蜜蜂置于4 °C冰箱中冷却，确保蜜蜂完全无法活动，约需1-2分钟。此时蜜蜂应呈现松弛状态。若蜜蜂身体卷曲或扭曲，表明冷却时间过长，应避免此情况。过度冷却会导致高死亡率，但完全固定至关重要，因为任何活动都会扩大伤口并增加死亡风险。</li>
	<li>将一次性30 G针头（BD）安装在Hamilton微量注射器上。吸取3 μl的dsRNA，并确保注射器内无气泡。将针头插入腹部侧面，以避免损伤内部器官。缓慢推动注射器推杆，使dsRNA被逐渐吸收。由于dsRNA黏度较高，完全排出需时2-3秒。在完全推下推杆后，将针头在伤口中停留4-5秒。注射后观察蜜蜂3-5秒，若发现血淋巴从伤口渗出，则弃用该蜜蜂。</li>
	<li>使用不同颜色标记蜜蜂的胸部，以对应不同的处理组。若采用单次注射策略，此时可在观察1小时后将蜜蜂放回蜂群。若采用两天注射策略，则在注射第一剂dsRNA后，应将蜜蜂放入带有侧壁供蜜的圆柱形网笼中，并置于34 °C、80%湿度的培养箱中饲养。</li>
	<li>第二天，按照步骤2.2和2.3操作，将网笼中的蜜蜂冷却并固定在石蜡板上。随后按照步骤2.4所述方法，进行第二剂dsRNA的注射。</li>
	<li>让蜜蜂在室温下恢复1小时，然后将其引入蜂群中。</li>
</ol>
注意：基因敲低效果可通过定量反转录PCR（qRT-PCR）和蛋白质印迹法检测。通常，基因敲低效率存在差异，且受多种因素影响。在本研究中，单次注射和连续两天注射后7天可检测到双基因敲低效果。
第二部分：Proboscis 延伸反应（PER）实验
1. 从蜂巢采集蜜蜂
注射后的第6天，从蜂群中采集经处理的蜜蜂，采集时不得使用熏烟器。将蜜蜂收集到金属网笼中，每笼放置3只蜜蜂。
2. 蜜蜂PER实验的固定
将蜜蜂置于4 °C环境中冷却，直至其完全无法活动。将每只蜜蜂垂直固定在专为PER实验设计的塑料管中。用两小片胶带将蜜蜂的腹部固定在管内，头部露出管外。将装有蜜蜂的管子放置在带有两排小型塑料柱的支架上，并为每根管子（蜜蜂）分配一个编号。然后将装有处理后蜜蜂的支架放入培养箱（34 °C，80%湿度）中，保持2小时。
3. 配制一系列蔗糖水溶液
配制0%、0.1%、0.3%、1%、3%、10%和30%的蔗糖水溶液，并将溶液装入带有15–20 G针头的注射器中。
4. PER 实验
先用一滴0%溶液（水）触碰蜜蜂的触角，随后依次使用0.1%、0.3%、1%、3%、10%和30%的蔗糖水溶液进行测试。所有蜜蜂均需先用水进行首次测试，且每种溶液之间至少间隔两分钟。因此，我们通常每次试验至少使用20只蜜蜂。若蜜蜂完全伸展出其喙，则记为一次阳性反应。
5. 数据管理
计算每个个体的味觉反应评分（GRS）总阳性反应数。对数据进行适当的统计学分析。
第3部分. 基因敲低验证
从另一组处理过的7日龄蜜蜂中解剖获取脂肪体。采用标准TRizol方法提取RNA，随后进行DNase I处理24。通过两步法qRT-PCR分析vg和usp基因的表达水平。由于actin基因在蜜蜂不同组织中表达稳定，因此被用作参考基因。本实验使用已发表的实时PCR引物扩增vg和usp基因24。数据采用ΔΔCT法进行分析25。

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</ol>

我们没有需要披露的内容。

本研究是首次在成年昆虫中同时敲低两个基因的尝试。我们的结果表明，dsRNA 注射的两种策略（单次注射和连续两天注射）均能有效实现双重基因抑制，在将 dsRNA 注射入蜜蜂后第6天即可检测到vg和usp基因的同步沉默效果8,9。然而，基因敲低效率在不同昆虫物种中存在差异，取决于靶基因的转录水平、蛋白质 turnover 速率以及细胞或器官对 dsRNA 的摄取效率。此外，RNAi 的效果具有剂量依赖性。我们发现，新羽化的蜜蜂能够良好耐受 4 μl 的 dsRNA 注射量，但若注射量超过 4 μl，死亡率则迅速上升。因此，对于需要较高注射体积的实验，连续两天注射策略可能比单次注射更为合适。
本文中我们建立的双基因敲低方法9可用于研究两个调控因子的联合效应。此外，本视频中介绍的不同dsRNA注射方法为进一步解析基因间的相互关系提供了更多工具。
例如，Vg 和 JH 处于一个调控蜜蜂生理的反馈环路中 9 行为成熟 26,27...

RNA干扰（RNAi）是一种基于RNA的转录后基因沉默机制，存在于多种真核生物中。RNAi过程由内源性或外源性的双链RNA（dsRNA）前体触发。dsRNA会激活核糖核酸酶蛋白Dicer，该蛋白结合并切割dsRNA，产生小片段（20-25 bp）。随后，这些dsRNA的小片段通过Argonaute蛋白引导RNA诱导沉默复合物（RISC）识别并切割互补的mRNA，其中Argonaute蛋白是RISC的催化组分1。在哺乳动物中，长度超过30 nt的dsRNA会激活抗病毒反应（干扰素反应，IFN），导致RNA转录本的非特异性降解2。然而，由于昆虫缺乏这种干扰素反应，长dsRNA在昆虫中已被证明具有高效性和特异性3。
长片段双链RNA（dsRNA）已被用于在不同昆虫物种中下调靶基因的表达。蜜蜂是最早利用dsRNA揭示发育和行为中多个重要基因功能的昆虫之一4,5。在蜜蜂中已采用多种dsRNA递送方法：饲喂dsRNA可有效下调蜜蜂幼虫中靶基因的表达6，而注射dsRNA则是蜜蜂胚胎4和成虫7,8基因沉默的有效手段。
通过向昆虫施用dsRNA所表现出的基因敲低效应是短暂且局部的。研究表明，向腹部注射dsRNA或向胸部注射dsRNA均能有效抑制昆虫腹部脂肪体细胞中靶基因的表达9,10。将dsRNA注入腹部和胸部体腔后，脂肪体细胞可从细胞所处的血淋巴中摄取dsRNA10。然而，无论是腹部注射还是胸部注射，均无法靶向其他器官（如卵巢和脑）中的基因。为了靶向蜜蜂脑中的基因，已有研究实施了向脑内直接注射dsRNA的方法，该方法可有效影响局部脑区中靶基因的表达11。本文仅记录在成年蜜蜂中更为常用的腹部dsRNA注射方法。
RNAi 主要用于靶向单个基因，是揭示基因功能的有力工具。然而，任何基因都不是孤立存在的，而是处于复杂的调控网络之中。理解一个生物过程的关键在于解析基因之间的相互作用，这需要同时操控多个基因，而不仅仅是单个基因的敲低。在哺乳动物细胞系中，科学家已通过递送系统成功实现了对两个或三个基因的同步抑制。 12 或多重microRNA（miRNA）发夹结构设计 13但在昆虫中，多重基因敲降仍未得到验证。本文中，我们介绍了可实现双重基因敲降的不同注射策略。我们靶向两个基因：卵黄原蛋白（vg)，编码卵黄蛋白前体，以及ultraspiracle（usp）该基因编码一种幼年激素（JH）的假定受体，可能作为转录因子介导对幼年激素的响应 14 在蜜蜂中，Vg 和 JH 通过反馈环路相互调控 15 并参与蜜蜂行为调控 9. 通过双重基因敲低，我们同时干扰 Vg 和 JH 通路，揭示二者如何共同影响蜜蜂的行为与生理，以及它们之间的相互作用机制 vg，usp 以及 JH 相互作用 9.
味觉感知是预测蜜蜂社会行为的一种行为学指标16。在行为发育方面，具有较高味觉感知能力的巢内蜂行为成熟较快，通常在生命早期就开始外出采集，并偏好收集花粉16,17。尽管味觉感知背后的调控机制尚不明确，已有研究表明味觉感知与内部能量代谢9、激素分泌18,19以及生物源性胺通路20相关。Vg 和 JH 均是调节味觉感知的重要激素因子7,21。在实验室中，可通过检测蜜蜂对不同蔗糖溶液的喙伸展反应（PER）来评估其味觉感知的差异。测试时，依次用一滴水接触每只蜜蜂的两根触角，随后使用浓度递增的蔗糖溶液（0.1%、0.3%、1%、3%、10%、30%）进行测试。当水滴或蔗糖溶液接触触角时，若蜜蜂完全伸展出其喙，则记为一次阳性反应。根据个体对各溶液产生阳性反应的次数，即可确定其味觉感知水平16。然而，PER 方法的应用不仅限于测量味觉感知。PER 还可用于检测蜜蜂的代谢状态，例如饱食与饥饿状态的比较。通常情况下，对蔗糖反应更强的蜜蜂更处于饥饿状态（Wang 和 Amdam，未发表数据）。此外，PER 范式还可用于研究蜜蜂的关联学习与记忆。在此类实验中，蜜蜂将被训练以将蔗糖水的存在与某种气味关联起来。当蜜蜂学会这种关联后，仅呈现该气味即可引发阳性喙伸展反应，而无需再提供蔗糖奖励22,23。在本视频中，我们将展示如何实施 PER 实验，以评估味觉感知，此前的研究已将该表型与vg 和 usp 双基因敲低相联系9。

<table><tbody><tr><td>GE Healthcare 96 孔板 PCR 珠</td><td>GE Healthcare</td><td>27-9557-01</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>RiboMax T7 RNA 合成系统</td><td>Promega</td><td>P1300</td><td></td></tr><tr><td>Trizol LS</td><td>Invitrogen</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>氯仿:异戊醇 24:1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 微量注射器</td><td>Hamilton</td><td>80301</td><td></td></tr><tr><td>30G BD 一次性针头</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>30960</td><td></td></tr><tr><td>立体解剖显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>S6D</td><td></td></tr><tr><td>昆虫针</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-25</td><td></td></tr><tr><td>蜡板</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rnai介导的双基因敲低及蜜蜂（apis mellifera）味觉感知测量

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

本视频演示了利用双链RNA（dsRNA）注射在蜜蜂中同时下调两个基因的新型RNA干扰（RNAi）技术。同时介绍了用于测量味觉感知的喙伸展反应（PER）实验方案。	
	RNAi介导的基因敲低是一种有效降低靶基因表达的技术。该技术通常用于单个基因的操作，但在检测基因间的相互作用和协同效应方面存在局限性。在本视频的第一部分，我们介绍了两种同时敲低两个基因（称为双基因敲低）的策略。我们展示了这两种策略均能有效抑制两个处于调控反馈回路中的基因——卵黄原蛋白（vg）和超螺旋（usp）。这种双基因敲低方法可用于解析基因之间的相互关系，并可广泛应用于不同昆虫物种中。	
	本视频的第二部分演示了在蜜蜂经过双重基因敲降处理后，进行喙伸展反应（PER）检测的操作过程。PER检测是测量蜜蜂味觉感知能力的一项标准测试，该能力是预测蜜蜂行为成熟速度的关键指标。蜂巢内蜜蜂的味觉感知能力越强，表明其行为发育程度越高，通常表现为更早开始采集行为，并倾向于专一性地采集花粉。此外，PER检测还可用于判断蜜蜂的代谢状态，如饱腹或饥饿状态。最后，将PER检测与不同气味刺激配对以训练蜜蜂的方法，也广泛应用于蜜蜂学习与记忆的研究中。

单次注射和连续两天注射两种策略均显著降低了蜜蜂在注射dsRNA后第六天的vg基因（单因素方差分析，p &lt; 0.001）（图2A）和usp基因（单因素方差分析，p &lt; 0.001）（图2B）的转录水平。与先注射usp、后注射vg（usp/vg）的两天注射方案相比，采用单次注射dsRNA混合物以及先注射vg、后注射usp（vg/usp）的两天注射方案对usp转录本的抑制效果显著更强（事后分析，p混合物 vs. usp/vg = 0.013，pvg/usp vs. usp/vg = 0.019）。
双基因敲低蜜蜂的GRS显著高于GFP<...

在本实验方案中，我们描述了两种在蜜蜂中同时抑制两个基因（双基因敲低）的策略。随后，我们介绍了如何利用吻伸反应（PER）实验来研究双基因敲低对蜜蜂味觉感知的影响。

RNAi介导的双基因敲低及蜜蜂（Apis mellifera）味觉感知测量

本视频展示了利用双链RNA在蜜蜂中同时下调两个基因的新型RNA干扰（RNAi）技术……

本视频实验方案演示了一种新颖的技术，可同时敲低成年蜜蜂中的两个基因，随后进行喙伸展反应（proboscis extension response，PER）检测，以评估双基因敲低对蜜蜂味觉感知的影响。该方法首先合成针对三种蛋白基因的双链RNA，这些蛋白包括：vitellogenin、ultraspiracle 以及绿色荧光蛋白（green fluorescence protein）。由于编码GFP的基因不存在于蜜蜂基因组中，因此GFP双链RNA可作为阴性对照。第二步是采用四种处理策略将双链RNA注射到蜜蜂体内：单独注射GFP双链RNA；同时注射vg和usp双链RNA的混合物；第一天注射vg双链RNA，第二天注射usp双链RNA；或第一天注射usp双链RNA，第二天注射vg双链RNA。注射后，用不同颜色标记的彩点标记蜜蜂以对应相应的处理方式，然后将其放回蜂巢。六天后，通过实时 PCR 验证处理组蜜蜂中 VG 和 USP 基因的敲低效果，并通过 PER 试验测定 VG 与 USP 双重敲低对味觉感知的影响。最终结果显示，双重敲低蜜蜂的 VG 和 USP 基因表达显著降低，同时对蔗糖的味觉感知显著增强。该干扰方法是一种可用于揭示基因功能的强大工具。它通常用于靶向单个基因。然而，基因是复杂调控网络的一部分。要更好地理解任何生物过程，一种方法是研究基因如何与基因网络相互作用。为此，我们需要同时操控多个基因。迄今为止，我们只能一次在一个基因上进行操作；而在此首次介绍如何在蜜蜂中同时敲低两个基因，而非仅一个。唾液腺条件反射（SCUs）或称为 PER，是一种用于测量蜜蜂味觉感知的有效技术，该感知是蜜蜂社会行为的一种行为预测指标。例如，具有较强味觉感知能力的蜜蜂行为成熟较快，较早开始外出觅食，并倾向于采集花粉。开始本实验前，使用免费软件Primer.Three设计靶向目标基因的双链RNA引物。本实验中，靶向敲低的两个基因为卵黄原蛋白基因（vitellogenin，VG）和超螺旋受体（ultraspiracle，USP）。除了VG和USP的设计外，还设计了靶向编码绿色荧光蛋白（GFP）的对照基因的双链RNA引物，该基因不存在于蜜蜂基因组中。随后，使用Promega公司的Rib Max T7 RNA合成系统，通过体外转录完成VG、USP和GFP的双链RNA合成。采用标准方法纯化双链RNA后，将每份双链RNA沉淀溶解于无核酸酶的水中，以确保基因下调效果；双链RNA浓度应约为每微升9至10微克。为准备蜜蜂注射，将新羽化的蜜蜂置于4°C冰箱中冷却1至2分钟。待蜜蜂固定后，用昆虫针将3至4只蜜蜂并排固定在盛有固体石蜡的培养皿中，昆虫针交叉穿过其腹部与胸部之间。将蜜蜂再次放入4°C冰箱中冷却约一至两分钟。确保蜜蜂完全不动。蜜蜂应呈现松弛状态，而非蜷缩或扭曲。完全固定非常重要，因为任何移动都可能导致伤口扩大并增加死亡率。蜜蜂若出现卷曲或扭曲状态，表明其已被冷藏过久，不应使用，因其死亡率较高。在汉密尔顿微量注射器上安装一次性30号针头。用注射器吸取3 µL双链RNA，确保注射器内无气泡。若采用单次注射策略，注射器中应装入两种基因双链RNA的混合物；若采用两天注射策略，则注射器中装入两种双链RNA中的一种。将针头插入腹部侧面。为避免损伤内脏器官，应缓慢推动注射器活塞，使双链RNA逐渐被吸收。由于双链RNA黏度较高，完全从注射器中推出需要两到三秒。完全推下活塞后，将针头留在伤口处 4 到 5 秒。注射后观察蜜蜂 3 到 5 秒。如果伤口处渗出一滴血淋巴，则丢弃该蜜蜂，并用不同颜色标记蜜蜂的胸部，以对应不同的处理方式。此时，如果采用单次注射策略，将蜜蜂置于提供蜂蜜的容器中观察一小时，然后将其放回蜂群中。然而，如果采用两天注射策略且仅注射了第一种双链RNA，则将蜜蜂放入圆柱形网笼中，并在侧壁提供蜂蜜。将蜜蜂在34摄氏度、80%湿度的培养箱中过夜培养，次日继续进行后续操作。使用与第一次相同的双链RNA注射程序，对同一批蜜蜂注射第二种双链RNA。将蜜蜂置于提供蜂蜜的容器中，在室温下恢复一小时，然后将其引入蜂群。注射后第六天，从蜂群中采集经处理的蜜蜂，打开蜂箱时不得使用喷烟器。不使用烟雾，因为它可能影响蜜蜂的味觉感知，而本实验步骤中将对蜜蜂的味觉进行测试。使用软镊子将蜜蜂收集到金属网圆筒形蜂笼中，每个蜂笼放置不超过三只蜜蜂，用于固定蜜蜂。进行PER检测时使用。将蜜蜂置于 4°C 环境中冷却，直至其完全无法活动。将每只蜜蜂垂直固定于专为 PER 实验设计的塑料管中。使用胶带将蜜蜂腹部固定在管内，头部露出管外。将试管放置在带有两排小塑料柱的架子上。其中一排标有数字，以便为固定的蜜蜂分配编号。将装有处理后蜜蜂的架子放入34摄氏度、80%湿度的培养箱中孵育两小时。配制一系列蔗糖水溶液。将溶液装入带有15至20号针头的注射器中，用于PER检测。将蜜蜂分组进行测试。首先用一滴0%的溶液（即水）触碰每只蜜蜂的触角，随后依次用0.1%、0.3%、1%、3%、10%和30%的蔗糖溶液进行测试，每种溶液之间间隔至少两分钟。使用一种蔗糖浓度测试 20 只蜜蜂通常需要大约两分钟。因此，每组蜜蜂的数量应始终超过 20 只。如果一只蜜蜂完全伸出了其喙，则计为一次实时的正响应。PCR分析证实，单次注射和连续两天注射策略均显著降低了蜜蜂体内Fiji和USP的转录水平。在这些图中，双链RNA注射后第6天，RQ表示目标基因转录本的相对定量水平，柱状图上方不同的字母表示处理组之间的显著差异。事后分析显示，与先注射USP再注射VG的两天注射方案相比，使用双链RNA混合物进行单次注射以及先注射VG再注射游戏副本的两天注射方案对USP转录本的抑制效果显著更低。这表明Vg可能是Vg与保幼激素调控环路中的主要调控因子。处理组蜜蜂的鸟苷酸（GUA）响应评分（GRS）根据此处所示的喙伸展响应（PER）实验结果计算得出。注射了Vg和USP双链RNA混合物的蜜蜂，其GRS显著高于GFP对照组蜜蜂，表明双基因沉默蜜蜂对蔗糖更为敏感。柱状图上方的不同字母表示处理组之间的显著差异。此处展示的是通过同时抑制 VG 和 USP 基因所揭示的 vitellogenin、ultraspiracle、球形体和保幼激素之间可能存在的调控网络。USP 单基因敲低不会引起保幼激素水平的变化，而 VG 和 USP 双基因敲低导致的保幼激素升高程度大于仅敲低 VG 基因。这表明，Vitellogenin（VG）不仅抑制保幼激素的合成，还抑制保幼激素对USP基因敲低所产生的反馈反应。在双重基因敲低实验中，保幼激素合成的显著增加源于VG敲低导致VI genin对保幼激素的抑制作用减弱，以及USP敲低引起保幼激素信号转导降低所触发的代偿性反应。有关该调控网络的更详细讨论见配套的实验方案文本。通过采用双基因敲低方法，我们揭示了重要基因 ultras、spherical 与保幼激素之间详细的相互关系，而仅抑制单一基因则无法发现这一关系。现在，研究人员可利用该技术探索调控网络中基因之间的相互作用。Proboscis Response（PR）是用于测量蜜蜂味觉感知的标准方法，但该方法对操作过程极为敏感，因此在保持实验环境和动物操作的一致性时必须格外谨慎。此外，如果实验需要在数天内完成，最好制定一个简短的时间表，并密切关注天气和环境条件是否发生变化。

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