RNAi介导的双基因敲低及蜜蜂（Apis mellifera）味觉感知测量

本视频实验方案演示了一种新颖的技术，可同时敲低成年蜜蜂中的两个基因，随后进行喙伸展反应（proboscis extension response，PER）检测，以评估双基因敲低对蜜蜂味觉感知的影响。该方法首先合成针对三种蛋白基因的双链RNA，这些蛋白包括：vitellogenin、ultraspiracle 以及绿色荧光蛋白（green fluorescence protein）。

由于编码GFP的基因不存在于蜜蜂基因组中，因此GFP双链RNA可作为阴性对照。第二步是采用四种处理策略将双链RNA注射到蜜蜂体内：单独注射GFP双链RNA；同时注射vg和usp双链RNA的混合物；第一天注射vg双链RNA，第二天注射usp双链RNA；或第一天注射usp双链RNA，第二天注射vg双链RNA。注射后，用不同颜色标记的彩点标记蜜蜂以对应相应的处理方式，然后将其放回蜂巢。

六天后，通过实时 PCR 验证处理组蜜蜂中 VG 和 USP 基因的敲低效果，并通过 PER 试验测定 VG 与 USP 双重敲低对味觉感知的影响。最终结果显示，双重敲低蜜蜂的 VG 和 USP 基因表达显著降低，同时对蔗糖的味觉感知显著增强。该干扰方法是一种可用于揭示基因功能的强大工具。

它通常用于靶向单个基因。然而，基因是复杂调控网络的一部分。要更好地理解任何生物过程，一种方法是研究基因如何与基因网络相互作用。

为此，我们需要同时操控多个基因。迄今为止，我们只能一次在一个基因上进行操作；而在此首次介绍如何在蜜蜂中同时敲低两个基因，而非仅一个。唾液腺条件反射（SCUs）或称为 PER，是一种用于测量蜜蜂味觉感知的有效技术，该感知是蜜蜂社会行为的一种行为预测指标。

例如，具有较强味觉感知能力的蜜蜂行为成熟较快，较早开始外出觅食，并倾向于采集花粉。开始本实验前，使用免费软件Primer.Three设计靶向目标基因的双链RNA引物。本实验中，靶向敲低的两个基因为卵黄原蛋白基因（vitellogenin，VG）和超螺旋受体（ultraspiracle，USP）。

除了VG和USP的设计外，还设计了靶向编码绿色荧光蛋白（GFP）的对照基因的双链RNA引物，该基因不存在于蜜蜂基因组中。随后，使用Promega公司的Rib Max T7 RNA合成系统，通过体外转录完成VG、USP和GFP的双链RNA合成。

采用标准方法纯化双链RNA后，将每份双链RNA沉淀溶解于无核酸酶的水中，以确保基因下调效果；双链RNA浓度应约为每微升9至10微克。为准备蜜蜂注射，将新羽化的蜜蜂置于4°C冰箱中冷却1至2分钟。待蜜蜂固定后，用昆虫针将3至4只蜜蜂并排固定在盛有固体石蜡的培养皿中，昆虫针交叉穿过其腹部与胸部之间。

将蜜蜂再次放入4°C冰箱中冷却约一至两分钟。确保蜜蜂完全不动。蜜蜂应呈现松弛状态，而非蜷缩或扭曲。

完全固定非常重要，因为任何移动都可能导致伤口扩大并增加死亡率。蜜蜂若出现卷曲或扭曲状态，表明其已被冷藏过久，不应使用，因其死亡率较高。在汉密尔顿微量注射器上安装一次性30号针头。

用注射器吸取3 µL双链RNA，确保注射器内无气泡。若采用单次注射策略，注射器中应装入两种基因双链RNA的混合物；若采用两天注射策略，则注射器中装入两种双链RNA中的一种。

将针头插入腹部侧面。为避免损伤内脏器官，应缓慢推动注射器活塞，使双链RNA逐渐被吸收。由于双链RNA黏度较高，完全从注射器中推出需要两到三秒。

完全推下活塞后，将针头留在伤口处 4 到 5 秒。注射后观察蜜蜂 3 到 5 秒。如果伤口处渗出一滴血淋巴，则丢弃该蜜蜂，并用不同颜色标记蜜蜂的胸部，以对应不同的处理方式。

此时，如果采用单次注射策略，将蜜蜂置于提供蜂蜜的容器中观察一小时，然后将其放回蜂群中。然而，如果采用两天注射策略且仅注射了第一种双链RNA，则将蜜蜂放入圆柱形网笼中，并在侧壁提供蜂蜜。将蜜蜂在34摄氏度、80%湿度的培养箱中过夜培养，次日继续进行后续操作。

使用与第一次相同的双链RNA注射程序，对同一批蜜蜂注射第二种双链RNA。将蜜蜂置于提供蜂蜜的容器中，在室温下恢复一小时，然后将其引入蜂群。注射后第六天，从蜂群中采集经处理的蜜蜂，打开蜂箱时不得使用喷烟器。

不使用烟雾，因为它可能影响蜜蜂的味觉感知，而本实验步骤中将对蜜蜂的味觉进行测试。使用软镊子将蜜蜂收集到金属网圆筒形蜂笼中，每个蜂笼放置不超过三只蜜蜂，用于固定蜜蜂。进行PER检测时使用。

将蜜蜂置于 4°C 环境中冷却，直至其完全无法活动。将每只蜜蜂垂直固定于专为 PER 实验设计的塑料管中。使用胶带将蜜蜂腹部固定在管内，头部露出管外。

将试管放置在带有两排小塑料柱的架子上。其中一排标有数字，以便为固定的蜜蜂分配编号。将装有处理后蜜蜂的架子放入34摄氏度、80%湿度的培养箱中孵育两小时。

配制一系列蔗糖水溶液。将溶液装入带有15至20号针头的注射器中，用于PER检测。

将蜜蜂分组进行测试。首先用一滴0%的溶液（即水）触碰每只蜜蜂的触角，随后依次用0.1%、0.3%、1%、3%、10%和30%的蔗糖溶液进行测试，每种溶液之间间隔至少两分钟。

使用一种蔗糖浓度测试 20 只蜜蜂通常需要大约两分钟。因此，每组蜜蜂的数量应始终超过 20 只。如果一只蜜蜂完全伸出了其喙，则计为一次实时的正响应。

PCR分析证实，单次注射和连续两天注射策略均显著降低了蜜蜂体内Fiji和USP的转录水平。在这些图中，双链RNA注射后第6天，RQ表示目标基因转录本的相对定量水平，柱状图上方不同的字母表示处理组之间的显著差异。事后分析显示，与先注射USP再注射VG的两天注射方案相比，使用双链RNA混合物进行单次注射以及先注射VG再注射游戏副本的两天注射方案对USP转录本的抑制效果显著更低。

这表明Vg可能是Vg与保幼激素调控环路中的主要调控因子。处理组蜜蜂的鸟苷酸（GUA）响应评分（GRS）根据此处所示的喙伸展响应（PER）实验结果计算得出。注射了Vg和USP双链RNA混合物的蜜蜂，其GRS显著高于GFP对照组蜜蜂，表明双基因沉默蜜蜂对蔗糖更为敏感。

柱状图上方的不同字母表示处理组之间的显著差异。此处展示的是通过同时抑制 VG 和 USP 基因所揭示的 vitellogenin、ultraspiracle、球形体和保幼激素之间可能存在的调控网络。USP 单基因敲低不会引起保幼激素水平的变化，而 VG 和 USP 双基因敲低导致的保幼激素升高程度大于仅敲低 VG 基因。

这表明，Vitellogenin（VG）不仅抑制保幼激素的合成，还抑制保幼激素对USP基因敲低所产生的反馈反应。在双重基因敲低实验中，保幼激素合成的显著增加源于VG敲低导致VI genin对保幼激素的抑制作用减弱，以及USP敲低引起保幼激素信号转导降低所触发的代偿性反应。有关该调控网络的更详细讨论见配套的实验方案文本。

通过采用双基因敲低方法，我们揭示了重要基因 ultras、spherical 与保幼激素之间详细的相互关系，而仅抑制单一基因则无法发现这一关系。现在，研究人员可利用该技术探索调控网络中基因之间的相互作用。Proboscis Response（PR）是用于测量蜜蜂味觉感知的标准方法，但该方法对操作过程极为敏感，因此在保持实验环境和动物操作的一致性时必须格外谨慎。

此外，如果实验需要在数天内完成，最好制定一个简短的时间表，并密切关注天气和环境条件是否发生变化。