前列腺素的提取与分析线虫
June 25th, 2013
在本文中，我们描述了一个优化的过程，前列腺素等类花生酸类物质的提取和分析 C。线虫
该程序旨在识别和测量 Sea Elegance 提取物中的前列腺素和其他类花生酸。首先，在大规模培养物中培养蠕虫。然后使用液体液体萃取技术，从蠕虫组织中提取亲水性脂质，将脂质提取物注入与质谱仪耦合的 HPLC 柱中。
然后分析来自液相色谱串联质谱的数据。最终，这种纯化温提取物的 lc MSMS 方法可以识别新的代谢物，还可以测量已知的代谢物，例如 S 系列前列腺素。因此，与现有方法（如酶免疫测定法）相比，该技术的主要优点是它具有高度的敏感性和特异性，同时，全面而灵活地演示该技术的将是我实验室的研究生 Hugh Hong，用于蠕虫颗粒和 NA 22 的补充喂养。
离心培养细菌，弃去上清液，将细菌沉淀悬浮于 100 毫升 M 9 缓冲液中。将浓缩的细菌溶液储存在 4 摄氏度。在五个超大 NGM 板上开始蠕虫培养。
继续繁殖蠕虫三到四代，直到板充满重力。成人根据需要防止饥饿 1 毫升左右的浓缩细菌到蠕虫板。盖上盖子前完全风干。
接下来，用 M nine 缓冲液从板上洗掉抓斗雌雄同体。在 50 毫升锥形聚丙烯管中收获蠕虫。然后让蠕虫沉降到底部。
丢弃含有细菌卵和幼虫期蠕虫的上清液。现在 Resus，将剩余的蠕虫悬浮在 15 毫升 M 9 缓冲液中并轻轻混合。将 200 微升蠕虫悬浮液分配到 60 个接种的 N GM 板中的每一个。
保持蠕虫溶液充分混合，直到所有板都接种完毕，以确保它们接收大致相等数量的蠕虫。将蠕虫分散在板上。将蠕虫培养 2 到 4 代，每 12 到 24 小时每板补充 1 毫升浓缩细菌。
当盘子里装满了 GR 成虫时，一次收获一个菌株的蠕虫。用 M 9 缓冲液将蠕虫从板上洗掉，然后转移到 6 个 50 ml 聚丙烯管中。用 M nine 缓冲液填充试管以洗涤蠕虫。
当抓握成体沉降到底部时，去除约 35 毫升的上清液。然后将蠕虫拉入一个或两个管子中。重复 M 9 洗涤 3 次，或用大口径 pasti 移液器重复上清液透明。
将尽可能多的蠕虫转移到 15 mL 聚丙烯锥形管中。以 1000 RCF 离心 5 分钟，然后弃去上清液。对其他菌株重复收获、洗涤和巩固步骤。
将收获的蠕虫菌株的库存储存在零下 80 摄氏度。注意使用红热剃须刀片的聚丙烯锥形管的重量。在 6 毫升标记附近切下一根含有收获蠕虫的冷冻聚丙烯管。
在无菌条件下。将约 6 克冷冻蠕虫颗粒转移到 thought 样本中。加入 1 ng 内标和 12 mL 冰冷的丙酮盐水溶液。
使用 BHT 混合物，将 1.5 毫升蠕虫浆液均匀分配到 12 个 5 毫升自立式塑料管中。加入 0.7 毫升严重稳定的氧化锆珠。如有必要，将蠕虫悬浮液均质化。
再重复该过程一分钟，以使用 9 英寸牧场移液器获得少于 10% 的完整蠕虫。小心地将匀浆而不是珠子转移到四个 10 毫升锥形玻璃管中。合并三个试管中的珠子，用 1 毫升含有 BHT 的丙酮盐水溶液洗涤。
对剩余的含有珠子的试管重复此洗涤。将洗涤液转移到冰上的玻璃管中。接下来，将匀浆以 1000 G 离心 10 分钟。
在 4 摄氏度下，将上清液从每管转移到干净的 10 毫升玻璃锥形管中。然后在化学罩中，以最大速度向每个试管涡旋中加入等体积的己烷，持续 30 秒。在 4 摄氏度下以 1000 G 离心 10 分钟后。
丢弃含有己烷和中性电荷脂质的上层相，以酸化下层水相。使用 pH 试纸进行 pH 值为 3.5 的测试。现在，以最大速度向每个试管涡旋中加入等体积的氯仿，持续 30 秒。
将样品在 4 摄氏度下以每 10 分钟 1000 GS 左右离心。将玻璃移液器吸头插入下部氯仿相中，并尝试通过倾斜试管来避开固体界面。将四支试管中的提取物拉入一个 15 毫升锥形玻璃管中。
用氮气吹扫玻璃管中的空气，并在零下 20 摄氏度下孵育 24 小时至两周。解冻提取物后，丢弃剩余的乳白色水性表层（如果存在）。使用新的过去移液器。
将氯仿转移到化学罩中标记的特氟龙衬里半 DRM 玻璃瓶中。在温和的氮气流中蒸发有机溶剂，将样品储存在零下 20 摄氏度下长达两周。首先，在甲醇中制备单个参比前列腺素的储备液。
现在通过在 80% 甲醇中连续稀释生成标准曲线。接下来，将干燥的 Sea Elegance 脂质提取物溶解在 200 微升 80% 甲醇中进行分析。将 20 至 50 μL 样品注入反相色谱柱中，并使用负离子模式 ESI 接口进行梯度分析，如文本方案中所述。
将色谱柱流出物引入质谱仪。将碰撞气体设置为 10 电子伏特。负 35 电子伏特时的碰撞能量。
温度为 600 摄氏度。负 90 时的整理电位和负 11 时的细胞退出电位生成了一条标准曲线，以使用分析软件分析提取样品中存在的不同类别的前列腺素。处理数据以识别蠕虫提取物中存在的前列腺素。
野生型和脂肪三种突变蠕虫提取物的调查扫描显示，离子的整体水平在 315 至 360 原子质量单位的质量范围内。与野生型蠕虫相比，脂肪 3 突变体缺乏大多数 20 碳 pfas，例如 F 三类前列腺素。主电荷比 3 51 以灰色突出显示，MRM 分析可以识别不同类别的前列腺素。
例如，F1 类前列腺素存在于野生型提取物以及其他几种疏水性化合物中，保留时间更长，质量转变的变化允许进一步分析 F 二类和 F 三类前列腺素，表明蠕虫提取物含有每类的多种前列腺素异构体。碰撞诱导的海洋优雅前列腺素与标准前列腺素分解的比较可用于映射到预期的卵裂位点。以防止脂质氧化。
请记住采取适当的预防措施。例如，将抗氧化剂 VHT 添加到指定的溶液中，然后用氮气吹扫提取物。
概述
本研究提出了一种优化的程序，用于使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）从秀丽隐杆线虫中提取和分析前列腺素和其他类脂肪酸。该方法相比传统技术提高了灵敏度和特异性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 分析化学
背景
- 前列腺素和类脂肪酸在各种生物过程中起着至关重要的作用。
- 传统的分析方法可能缺乏灵敏度和特异性。
- 秀丽隐杆线虫是研究代谢过程的模型生物。
- LC-MS/MS为代谢物分析提供了一种全面的方法。
研究目的
- 开发一种可靠的方法来提取和分析秀丽隐杆线虫的脂质代谢物。
- 识别新代谢物并测量已知的，如S系列前列腺素。
- 改进现有的分析技术。
所用方法
- 秀丽隐杆线虫的大规模培养。
- 从蠕虫组织中提取亲水性脂质的液液提取。
- 将脂质提取物注入与质谱仪耦合的HPLC色谱柱。
- 使用LC-MS/MS进行代谢物鉴定的数据分析。
主要结果
- 优化的LC-MS/MS方法成功地识别和定量了各种类脂肪酸。
- 与酶免疫分析相比，实现了高灵敏度和特异性。
- 在已知的前列腺素之外，还识别了新代谢物。
- 该方法在分析不同的脂质提取物时表现出灵活性。
结论
- 所开发的方法是脂质代谢物分析的重大进展。
- 它为研究秀丽隐杆线虫中类脂肪酸的研究人员提供了一个全面的工具。
- 未来的应用可能扩展到其他生物和代谢研究中。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative extraction and LC-MS/MS analysis of prostaglandins in Caenorhabditis elegans enables high-sensitivity interrogation of lipid signaling pathways relevant to early discovery and mechanistic de-risking. This workflow supports target validation and comparative pathway analysis by providing robust, reproducible quantification of low-abundance eicosanoids. The approach enhances predictive confidence for lipid biology programs and informs risk-adjusted portfolio decisions in discovery-stage R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of prostaglandin species to clarify lipid signaling mechanisms.
- Supports functional target validation by comparing wild-type and mutant eicosanoid profiles.
- Facilitates mechanistic de-risking through structural and quantitative lipid analysis.
- Provides data for hypothesis-driven pathway interrogation in genetically tractable systems.
Screening & Assay Development
- Establishes validated extraction and LC-MS/MS protocols for reproducible lipid quantification.
- Supports assay standardization using internal deuterated prostaglandin analogs.
- Enables multiple reaction monitoring (MRM) for specific prostaglandin class quantification.
- Delivers quantitative outputs suitable for downstream compound screening or genetic perturbation studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant lipid pathway studies by enabling cross-species eicosanoid comparison.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation for lipid signaling targets.
- Supports translational biomarker identification through comprehensive eicosanoid profiling.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation for lipid signaling targets.
- Discovery Biology: Enables null hypothesis testing and pathway clarification via quantitative eicosanoid measurement.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible extraction and LC-MS/MS protocols for lipid quantification.
- Analytics: Delivers MRM and survey scan outputs for robust statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and mechanistic continuity across model systems.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, standardized workflow adaptable to other lipid classes and model organisms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in lipid pathway studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable extraction and analysis protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of lipid biology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mass spectrometry and lipid biochemistry for data interpretation.
- Needs access to LC-MS/MS instrumentation and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization of extraction and quantification protocols.
- Adaptable to other model systems with protocol optimization for sample type.
- Sample oxidation and low analyte abundance require careful handling and internal standards.
