Name: 前列腺素的提取与分析线虫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 学习从秀丽隐杆线虫中提取和分析前列腺素及其他类花生酸的方法，利用液相色谱-串联质谱技术实现高灵敏度和特异性检测。该方法为脂质代谢研究提供了可靠工具。

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感谢阿拉巴马大学伯明翰分校（UAB）靶向代谢组学与蛋白质组学实验室，该实验室部分得到了UAB皮肤病研究中心（P30 AR050948，负责人：C. Elmets）、UAB-UCSD奥布莱恩急性肾损伤中心（P30 DK079337，负责人：A. Agarwal）以及UAB肺健康中心（R01 HL114439、R01 HL110950，负责人：J.E. Blalock）的支持。质谱仪的经费来自美国国家研究中心资源部（NCRR）共享仪器资助项目（S10 RR19261，负责人：S. Barnes）。我们还感谢Ray Moore提供的技术支持。C. elegans菌株由受美国国立卫生研究院（NIH）资助的Caenorhabditis遗传中心提供。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助（R01GM085105，负责人：MAM，包括一项ARRA行政补充资助）。

如下所述的实验方案分为三个部分：线虫培养、前列腺素提取和前列腺素分析。如文中所述，样品可在多个步骤暂时保存于 -80 °C 或 -20 °C。
1. 线虫培养
我们建议使用约 6 g 混合发育阶段的线虫进行全面的 LC-MS/MS 分析。这将提供足够的样品量，至少可进行六次独立进样检测。若通过 MRM 对已知的前列腺素（PGs）进行定量分析，单次或两次进样则只需 1–2 g 样品即可。也可对来自特定发育阶段同步培养物的提取物进行分析。最多可同时培养四种不同品系。例如，一种野生型对照和三种不同的突变品系。
<ol>
	<li>准备65个超大（16 cm）NGM平板以及用于补充喂养的浓缩细菌。使用NA22细菌进行涂布。为制备用于补充喂养的浓缩细菌，需在LB培养基中培养至少4升NA22细菌，培养时间为16–24小时。离心后弃上清，将菌体重悬于100 ml M9缓冲液中。每种线虫品系可能需要200至400 ml该浓缩细菌溶液。4 °C保存。</li>
	<li>在5块超大培养板上开始线虫培养。将线虫培养约3至4代，直至培养板上充满怀卵成虫。根据需要向培养板中添加浓缩细菌，以防止线虫饥饿（每板约1 ml，待其完全干燥后再盖上盖子）。</li>
	<li>用M9缓冲液将怀卵的雌雄同体线虫从培养板上冲洗下来，并收集至50 ml圆锥形聚丙烯管中。</li>
	<li>让怀卵的雌雄同体线虫沉降至底部（通常约3-5分钟）。移除上清液，包括细菌、卵和幼虫阶段的线虫。用15 ml M9缓冲液重新悬浮并轻轻混匀。</li>
	<li>将200 μl线虫悬液转移至60个已接种的NGM平板中，每个平板加一份。将线虫均匀分散至各平板表面。在所有平板接种完成前，持续充分混匀线虫悬液，以确保各平板接种的线虫数量大致相等。</li>
	<li>根据需要补充浓缩的细菌（约每板 1 ml/12 至 24 小时）以防止饥饿。更换盖子前让培养板自然晾干。根据最初接种的线虫数量，培养 2 至 4 代，或直至培养板中充满怀卵成虫。</li>
	<li>一次收获一种菌株的线虫。用 M9 缓冲液将线虫从培养板上冲洗下来，并收集到 50 ml 聚丙烯管中（例如 6 支试管）。用 M9 缓冲液洗涤一个培养皿，然后将含有线虫的缓冲液转移至下一个培养皿。洗涤一定数量后例如. 10th将含有线虫的缓冲液转移至50 ml离心管中，并用M9缓冲液加满至管口。对剩余的培养板重复上述洗涤步骤。</li>
	<li>当怀卵成虫在5-6分钟内沉降至底部时，吸除上清液（约35 ml），并将沉淀合并至一个或两个离心管中。用新鲜M9缓冲液定容至50 ml，静置3-5分钟，吸除上清液，保留怀卵成虫。重复洗涤3次，或直至上清液透明。</li>
	<li>使用大口径巴斯德移液管，尽可能将全部线虫转移至两个15 ml聚丙烯圆锥形离心管中。在临床离心机中以1,000 rcf（约CentraSL2离心机3,500 rpm）离心5分钟。弃去上清液，并重复此步骤，直至所有线虫均转移并沉淀至同一管中。尽可能吸除上清液，将线虫保存于-80 °C。对所有品系重复上述操作。</li>
</ol>
2. 前列腺素提取
提取所需的试剂如下所示。该方法改进自Golovko和Murphy17的方法，包括丙酮提取，随后进行液-液纯化，以提高LC-MS/MS的灵敏度。实验中使用Bullet Blender 5匀浆器，但也可使用Dounce匀浆器获得类似结果。使用丁基化羟基甲苯（BHT）并在氮气（N2）环境下蒸发，以防止氧化。所有玻璃器皿均应进行硅化处理（Sigmacote），以减少脂质结合。有机溶剂提取操作应在化学通风橱中进行。
<ol>
	<li>称量一个50 ml聚丙烯锥形管。将存放在-80 °C的15 ml锥形管中的约6.0 g冷冻线虫，用加热的剃须刀片在6.5 ml刻度附近切开管壁取出。可使用经甲醇清洗过的刮勺将底部的冷冻线虫沉淀取出。通过切割沉淀以获取其下部，可使密度较低的幼虫及沉淀上层残留的细菌留在上方而被弃去。</li>
	<li>将冷冻线虫转移至已预先称重的50 ml锥形管中。若同时处理多个样品，为便于比较，应使用相同质量（6.0 g）的组织。当线虫融化成糊状时，用刮勺添加或去除线虫以达到目标质量。可选：加入1.00 ng的PGF2α-d4标准品作为提取效率的内标。</li>
	<li>向线虫悬液中加入12 ml预冷的2:1丙酮/生理盐水溶液（含0.005% BHT），充分涡旋混匀。使用移液器将1.5 ml线虫匀浆液分装至十二个5 ml自立式塑料管中，用于后续的Bullet Blender处理。</li>
	<li>向每个5 ml管中加入0.7–0.8 ml直径为0.5 mm的铈稳定氧化锆珠。盖紧管盖，将12个管子装入Bullet Blender 5匀浆仪中。以8–9档速度运行3分钟，随后将管子置于冰上。务必确保管盖拧紧，以防内容物溢出。取其中一个管子的10 μl匀浆液，置于载玻片上用体视显微镜检查，应仅见极少量完整线虫。如有必要，可再以相同速度重复匀浆1分钟。</li>
	<li>使用9英寸巴斯德吸管，将匀浆液均匀转移至四个10 ml锥形玻璃管中，避免转移珠子。依次用含BHT的1:2丙酮/生理盐水溶液1 ml冲洗三个管中的珠子，重复此步骤直至所有珠子均被清洗。将剩余溶液（约4 ml）转移至10 ml玻璃管中，并置于冰上。</li>
	<li>将10 ml玻璃管在4 °C下以约1,000 × g离心10分钟。将各管中的上清液转移至洁净的10 ml玻璃锥形管中。</li>
	<li>在化学通风橱中，向每个10 ml玻璃管中加入等体积的正己烷。例如，向3.5 ml丙酮/生理盐水溶液中加入3.5 ml正己烷。最大速度涡旋30秒。</li>
	<li>将10 ml玻璃管在4 °C下以约1,000 × g离心10分钟。弃去含正己烷及中性脂质的上层相。</li>
	<li>用2 M甲酸将下层相酸化至pH 3.5（约需100–150 μl）。使用pH试纸检测pH值。</li>
	<li>向每个管中加入等体积的氯仿。最大速度涡旋30秒，随后在4 °C下以约1,000 × g离心10分钟。</li>
	<li>移除并弃去上层水相。将移液器吸头穿过残留的乳白色中间层插入下层氯仿相，避免接触中间层。将四个管中的下层相收集至一个洁净的15 ml玻璃锥形管中。在-20 °C下孵育至少24小时。此时，提取物可在-20 °C下保存最多两周。</li>
	<li>将提取物从冷冻环境中取出，若存在乳白色残留水相上层，则弃去。使用新的巴斯德吸管将氯仿相转移至标记好的带聚四氟乙烯衬垫的½-Dram玻璃小瓶中。在化学通风橱中，用温和的N2气流将氯仿可溶部分吹干。干燥后的提取物可在-20 °C下保存最多两周。PG提取与分析的整体流程见图1。</li>
</ol>
3. 前列腺素分析
<ol>
	<li>配制单个参考前列腺素（如PGF）的储备溶液2α 或 PGF2 α-第4天（1 μg/ml）) 用甲醇溶解，并用甲醇:水（8:2 v/v）稀释，得到工作溶液。配制一系列稀释液（100、10、1、0.1、0.01 ng/ml），用于绘制标准曲线。</li>
	<li>加入200 μl甲醇:水（8:2 v/v）至干燥残余物中 秀丽隐杆线虫 脂质提取物并充分混匀。如果提取的线虫组织少于6 g，则应将干燥的提取物重悬于较少量的甲醇:水溶液中。</li>
	<li>制备流动相：水相含0.1%甲酸[A]，乙腈相含0.1%甲酸[B]。</li>
	<li>将自动进样器设置为 4 °C，并将样品瓶放入 70 孔的 1.5 ml 样品瓶架中。</li>
	<li>使用0.1%甲酸以0.2 ml/min的流速平衡Synergy hydro RP-C18色谱柱约5分钟。</li>
	<li>将样品（20–50 μl）注入色谱柱。进行梯度洗脱，0–11 分钟内从 10% B 升至 80% B，11–14 分钟内从 80% B 升至 100% B，并在 16 分钟时返回至 10% B。总运行时间为 20 分钟。13 种标准品的保留时间如图所示 表1 供参考3.</li>
	<li>使用电喷雾离子源（ESI）负离子模式将色谱柱流出物引入质谱仪。氮气用作雾化气和鞘气（CUR = 10）。碰撞气、碰撞能量和温度分别设定为10、-35 eV和600 °C。去簇电压（DP）、碰撞能量（CE）和碰撞池出口电压（CXP）分别设定为-90、-35和-10。</li>
	<li>对于全扫描（Q1 扫描），在质量范围内使用负离子模式 m/z 大多数PG为315-360图2）。可根据目标化合物的质量调整该范围。从液相色谱-质谱离子流色谱图的总离子流（TIC）中提取离子，判断提取的离子是否对应去质子化离子或加合离子，或为碎片离子。</li>
	<li>对于 MRM 实验，质荷比转换 m/z 355/311 用于检测 F1 类别， m/z 353/193 用于 F2 类别， m/z 351/193 或 351/191 用于 F3 类别（图3MRM 也被用于检测内标（例如， m/z 357/197 对于 PGF2α-d4）并绘制标准曲线。参见 Murphy 等 有关PG质量转换的更多信息18.</li>
	<li>对于 MS/MS 实验，使用 m/z 355 适用于 F1 类， m/z 353，适用于 F2 类 m/z 351，适用于F3类PGs。 秀丽隐杆线虫 F系列前列腺素的MS/MS数据可获取 图4 和 表 23,16哺乳动物类二十烷酸的MS/MS数据可从以下网址获取： <a href="http://www.lipidmaps.org" target="_blank">www.lipidmaps.org</a>.</li>
	<li>使用 Analyst 软件（版本 1.4.2，Applied Biosystems）处理分析数据。</li>
</ol>

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</ol>

作者无利益冲突。

我们描述了一种用于类二十烷酸提取与分析的实验流程，重点针对F系列前列腺素（PGs）。该流程中存在若干可能产生问题的环节。首先，线虫培养过程中必须避免饥饿，因为饥饿会改变前列腺素的代谢。为补充营养，建议使用NA22菌株而非更常用的OP50菌株，因为NA22菌株可达到更高的密度。然而，NA22菌株缺乏抗生素抗性，更容易受到污染。其次，与哺乳动物组织相比，线虫体内单个前列腺素异构体的合成丰度较低，这可能部分归因于多种异构体之间的功能冗余。我们建议使用约6 g组织以实现全面分析并获得更强的信号。若组织量较少（1–2 g），可将干燥提取物重悬于较少体积的甲醇-水溶液中以提高前列腺素浓度，但仅能进行一至两次进样。本实验室LC-MS/MS系统的检测限约为10 pg PGF2α /ml。1 ml 密集培养的混合阶段线虫（约 1 g）可获得大约 25–50 pg 的 CePGF2。更灵敏的质谱系统可减少分析所需的线虫组织量。第三，不同样品间前列腺素提取效率的差异可能导致结果波动。我们发现，当组织平行提取时，提取效率非常接近。为确定提取效率，可加入 1.0 ng 的 PGF2α- d4 在均质化步骤中作为内参。使用质量转换的多反应监测（MRM） m/z 357/197 用于测量 PGF2α-d4 浓度相对于 1 ng/ml 标准溶液。PGF 的含量2α- d4 提取过程中损失的量随后被计算。
我们所列出的色谱参数和质谱转换条件可进行调整，以检测其他前列腺素（PG）和类二十烷酸。尽管付出了大量努力，我们仍未能在提取物中鉴定出D系列或E系列的前列腺素17。此外，我们未检测到具有自由基引发过氧化反应特征的8-iso PGF2α和8-iso PGE2，这类反应会产生非选择性的前列腺素立体异构体混合物19。线虫是否合成其他类型的前列腺素尚不清楚。已在秀丽隐杆线虫（C. elegans）提取物中发现内源性大麻素以及花生四烯酸和二十碳五烯酸的各种环氧化物和羟基化代谢产物5,7,20,21。我们建议分别采用多反应监测（MRM）和串联质谱（MS/MS）结合标准品进行定量和定性分析。对于新型类二十烷酸，应结合脂肪酸合成酶缺陷的fat突变体的比较研究22以及可能的功能实验来进行分析。分析fat突变体时需注意，线虫体内即使存在极微量的多不饱和脂肪酸（PUFA）也足以支持前列腺素的合成。例如，fat-2(wa17)突变体仍保留少量D12去饱和酶活性（约为野生型的5%22），并仍能产生前列腺素6。fat-3(wa22)和fat-4(wa14)突变体则无法合成来源于花生四烯酸和二十碳五烯酸的前列腺素16。我们还发现，fat突变体会通过上调剩余PUFA类别的前列腺素合成来补偿缺失的PUFA类别。例如，fat-3(wa22)突变体不能合成大多数来源于20碳PUFA的前列腺素，而是似乎上调了来源于18碳PUFA的新型前列腺素的合成16。迄今为止，我们尚未发现完全缺乏前列腺素合成能力的C. elegans品系。前列腺素可能对线虫的生长或发育至关重要。

前列腺素（PGs）是一类重要的脂质激素，已在多种生物体中被广泛研究，并被认为在调控生殖、免疫和发育过程中发挥重要作用12-14。由于前列腺素是一类由共同前体衍生而来的脂质分子，因此非常适合进行系统生物学的综合分析。线虫 C. elegans 是研究遗传学和系统生物学基本问题时最常用的模式生物之一。
我们已经证明 秀丽隐杆线虫 合成F系列前列腺素，引导游动精子向卵母细胞定向移动3,6,16已鉴定出由20碳多不饱和脂肪酸衍生的F系列前列腺素，其双键数分别为三个、四个和五个，对应F1、F2和F3类3,16这些前列腺素（PG）的合成不依赖于环氧化酶（cyclooxygenase）酶，但PGF1α 和 PGF2α 立体异构体仍会生成。对于定性和定量分析 秀丽隐杆线虫 PGs，液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）是一种强大且灵敏的分析技术。在开展该分析之前，建立优化的提取方法至关重要，因为分析过程的性能在很大程度上取决于提取物的质量。液相色谱与质谱联用仅能提供预期的质荷比（m/z)，以及理想的前列腺素（PG）母离子峰形和保留时间。对PG的代谢谱进行分析 秀丽隐杆线虫 是一项具有挑战性的任务，需要采用多种质谱采集策略。
液相色谱-质谱全扫描或称一级质谱扫描（Q1 扫描）的优势在于可确保大多数可电离的磷脂（PGs）产生质谱响应。尽管一级质谱扫描能够提供关于野生型和突变型 C. elegans 中磷脂总体分布的有用信息，但由于灵敏度较低，对微量磷脂的检测能力受到限制。然而，液相色谱-质谱一级扫描仍可提供磷脂的全局视图，特别适用于分析预计会影响大量磷脂群体代谢的突变体。
在代谢物鉴定中，首先对化学合成的前列腺素（PG）标准品进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，以获得其产物离子谱图作为参考化合物。这些谱图可与未知代谢物的谱图进行比对。采用多反应监测（MRM）模式可提高检测的灵敏度和特异性。MRM实验通过设定化合物的母离子与产物离子之间的质荷比跃迁来实现。通过已知目标分析物的质荷比和化学结构，可以预测多种未知代谢物的理论MRM跃迁。
目前尚未有报道针对秀丽隐杆线虫（C. elegans）中同分异构前列腺素（PGs）的优化LC-MS/MS分析方法。本文介绍了一种提取与整合质谱分析方法，结合LC-MS和LC-MS/MS技术，用于检测、定量及研究C. elegans中的PG代谢物。该方法亦可应用于其他二十碳衍生物的分析。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>超大号（16 厘米）培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875714</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 菌株 NA22</td><td>秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC）</td><td>NA22</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.cgc.cbs.umn.edu&quot; 目标=&quot;_blank&quot;&gt;http://www.cgc.cbs.umn.edu&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>丙酮 &lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;99.5%</td><td>Fisher Scientific</td><td>A928-4</td><td></td></tr><tr><td>丁基化羟基甲苯</td><td>MP Biomedicals</td><td>101162</td><td></td></tr><tr><td>正己烷，HPLC 级</td><td>Fisher Scientific</td><td>H302-1</td><td></td></tr><tr><td>甲酸， &lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;99%</td><td>阿克罗斯</td><td>AC27048-0010</td><td>可通过 Fisher Scientific 购得</td></tr><tr><td>氯仿，HPLC 级</td><td>阿克罗斯</td><td>AC26832-0010</td><td>可通过赛默飞世尔科技公司获取</td></tr><tr><td>PGF2&lt;sub&gt;&amp;alpha;&lt;/sub&gt;-4天</td><td>Cayman Chemicals</td><td>316010</td><td>Cayman 提供多种标准品供购买</td></tr><tr><td>无菌螺旋盖自立式5 ml离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-651</td><td>适用于 Bullet Blender</td></tr><tr><td>0.5 mm 氧化锆珠</td><td>下一步 &amp;gt;&amp;gt;&amp;gt; 推进</td><td>ZrOB05</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 玻璃锥形高强度刻度离心管</td><td>Kimble Kimax</td><td>45200-10</td><td>可通过 Fisher Scientific 公司获取</td></tr><tr><td>15 ml 玻璃锥形管</td><td>康宁 Pyrex</td><td>8082-15</td><td>可通过 Fisher Scientific 购得</td></tr><tr><td>Sigmacote（硅化试剂）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-100ML</td><td></td></tr><tr><td>聚四氟乙烯衬里密封的1/2德拉姆玻璃小瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>V1235C-TFE</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>CentraSL2 临床离心机</td><td>托马斯科学公司</td><td>2517N92-TS</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender 5 蓝色均质器</td><td>下一步 &amp;gt;&amp;gt;&amp;gt; 推进</td><td>BBY5MB</td><td>可使用40 ml Dounce匀浆器作为替代方案</td></tr><tr><td>Synergi 4 &amp;mu;m Hydro-RP 80 &amp;#197; LC色谱柱 250 x 2.0 mm</td><td>Phenomenenex</td><td>00G-4375-B0</td><td>高效液相色谱柱</td></tr><tr><td>SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm</td><td>Phenomenenex</td><td>AJ0-7510</td><td></td></tr><tr><td>SecurityGuard 保护柱套装</td><td>Phenomenenex</td><td>KJ0-4282</td><td></td></tr><tr><td>岛津Prominence高效液相色谱仪，配备制冷自动进样器</td><td>岛津科学仪器公司</td><td></td><td>任何配备三重四极杆质谱仪的标准高效液相色谱系统均应足够</td></tr><tr><td>API 4000 三重四极杆质谱仪</td><td>应用生物系统公司/MDS SCIEX</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;表格 边框=&quot;1&quot;&gt; &lt;胸段椎骨&gt; &lt;tr&gt; &lt;td colspan=&quot;2&quot;&gt;&lt;强&gt;M9 缓冲液配方（4 升）&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;12 g&lt;/td&gt; &lt;td&gt;KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;24 g&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;20 g&lt;/td&gt; &lt;td&gt;NaCl&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;最多4升&lt;/td&gt; &lt;td&gt;去离子水&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td colspan=&quot;2&quot;&gt;分装至八个1升瓶中。高压灭菌后冷却。&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;0.5 ml/瓶&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1 M MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt; &lt;/table&gt; </td></tr></tbody></table>

秀丽隐杆线虫中前列腺素的提取与分析

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans 正成为研究脂质生物学的有力动物模型1-9。前列腺素是一类重要的二十碳衍生物，是由多不饱和脂肪酸（PUFAs）衍生而来的脂质信号分子10-14。由于其含量极低且化学性质活泼，这些信号分子难以研究。前列腺素的特征结构是在脂肪酸骨架中含一个环戊烷环。在哺乳动物中，前列腺素可通过环氧化酶依赖性和非依赖性途径生成10,15。C. elegans 能够在不依赖环氧化酶的情况下合成多种多样的前列腺素6,16,17。目前已鉴定出大量F系列前列腺素，但对二十碳衍生物的研究仍处于早期阶段，尚有广阔空间有待新发现。本文描述了一种提取和分析前列腺素及其他二十碳衍生物的方法。采用液-液萃取技术从大量线虫培养物中提取带电脂质，并通过液相色谱-电喷雾串联质谱法（LC-ESI-MS/MS）进行分析。建议在定量分析中使用前列腺素的氘代类似物（如PGF2α-d4）作为内标。可采用多反应监测（MRM）来定量并比较野生型与突变型动物之间特定类型前列腺素的差异。通过碰撞诱导解离（CID）或串联质谱（MS/MS）可获得有关关键结构特征的信息。通过液相色谱-质谱（LC-MS）对选定质荷比范围（例如 m/z 315–360）进行全扫描，可用于评估前列腺素水平的整体变化。我们提供了上述三种分析方法的实例。这些方法将为研究人员提供一套工具，用于发现新的二十碳衍生物并阐明其代谢通路。

样品制备采用经 Golovko 和 Murphy 改良的液-液萃取法进行17. 对内标（PGF）的回收率极佳2α-d4）。从PG中提取的总体方案 C. elegans 如图所示 图1色谱条件经过优化，以实现基线分离 &gt;30种二十烷类标准品（表1 显示13种标准品）。使用Hydro-Rp色谱柱（250 × 2.0 mm内径），以含0.1%甲酸的水和乙腈作为流动相，可实现最佳分离效果和灵敏度。对野生型和 fat-3 突变体提取物如图所示 图2 在315至360原子质量单位的质量范围内检测离子的全局水平。 fat-3(wa22) 突变体缺乏大部分20碳多不饱和脂肪酸。一类F3型前列腺素被标出。在 图3，对野生型提取物进行MRM分析显示出F1的多种PG异构体图3A），F2（图3B）和 F3（图3C 和 3D）类别。F3 类可通过以下两个质量转换中的任意一个进行检测， m/z 351/193 或 m/z 351/191. CePGF2 主要由 PGF 组成2α对映体。CePGF1 很可能是 PGF1α 或其对映体。 图4 显示了CePGF2（保留时间=11.8）与PGF2的碰撞诱导解离对比α 标准品（RT=11.8）。产物离子的微小差异可能是由于CePGF2含量较低以及提取物中存在共洗脱化合物所致。
<img alt="脂质提取与纯化；氯仿分配示意图；离心；液相色谱；串联质谱分析。" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. C. elegans 磷脂酰甘油（PGs）提取及液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析的示意图。注意：丙酮/生理盐水和氯仿中均含有0.005% BHT，以最大限度减少脂质氧化。更多细节请参见正文。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig1large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="色谱-质谱图；野生型与 fat-3(wa22) 突变体的强度对比保留时间。" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
 图 2. 野生型与 fat-3(wa22) 突变体提取物在 m/z 315–360 范围内的全扫描图谱。 液相色谱保留时间（RT）显示于图 [A]。在 RT = 11.3 处提取的离子信号分别展示于野生型 [B] 和 fat-3(wa22) [C] 提取物。其中，质量数为 m/z 351 的 F3 类前列腺素被高亮标出。Cps：每秒计数；a.m.u.：原子质量单位。
<img alt="质谱色谱图；强度 vs. 保留时间；化合物鉴定峰；分析。" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 野生型提取物的 MRM 分析。 F1 类 PG 通过质荷比 m/z 355/311 的质量转换进行检测 [A]。注意，多个疏水性化合物（保留时间 &gt; 14 分钟），不太可能是 PG，也会在此转换下被检测到。F2 类 PG 通过质荷比 m/z 353/193 的质量转换进行检测 [B]。F3 类 PG 可通过质荷比 m/z 351/193 [C] 或 m/z 351/191 [D] 的质量转换进行检测。注意，提取物中含有每类 PG 的多种异构体。数字对应于 表 2 中列出的 PG。CePGF2 的浓度为 1.8 ng/mL。RT，保留时间；cps，计数/秒。
<img alt="质谱数据与化学结构分析图；脂质鉴定流程。" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
 图 4. 化学合成的 PGF2α 与 CePGF2 的碰撞诱导解离。 图中 [A] 面板的箭头指示 PGF2α 与 CePGF2（保留时间 RT=11.8）共有的产物离子或碎片离子。m/z 309 和 m/z 193 处的产物离子由标示的断裂位点（高亮的 a 和 b）产生，对应于所示结构，是 F 系列前列腺素（PGs）的特征性离子 [B]。Cps：每秒计数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig4large.jpg" target="_blank">点击此处查看高清大图</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>标准品</td>
			<td>保留时间（分钟）</td>
			<td>[M-H]- m/z</td>
			<td>MS/MS 中的关键产物离子</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-羟基 PGE2</td>
			<td>9.43</td>
			<td>367</td>
			<td>349, 331, 287, 234, 189, 129, 109</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGF3-</td>
			<td>11.26</td>
			<td>351</td>
			<td>333, 307, 289, 271, 245, 219, 209, 193, 191, 171, 165, 111</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>血栓素 B2</td>
			<td>11.66</td>
			<td>369</td>
			<td>289, 191, 177, 169, 151</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGF2-</td>
			<td>11.80</td>
			<td>353</td>
			<td>335, 309, 291, 273, 263, 247, 235, 209, 193, 171, 165, 111</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGF1-</td>
			<td>11.79</td>
			<td>355</td>
			<td>337, 319, 311, 301, 293, 275, 265, 237, 211, 195</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>脂氧素 B4</td>
			<td>12.38</td>
			<td>351</td>
			<td>201, 191, 189, 165, 155, 115, 107, 71, 59</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGD2</td>
			<td>12.56</td>
			<td>351</td>
			<td>315, 271, 203, 189</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(S), 6(R)-脂氧素 A4</td>
			<td>12.83</td>
			<td>351</td>
			<td>235, 217, 189, 144, 135, 115, 99, 59</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGA2</td>
			<td>14.02</td>
			<td>333</td>
			<td>315, 297, 271, 235, 191, 189, 175, 163, 137, 113, 109</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Δ12-PGJ2</td>
			<td>14.20</td>
			<td>333</td>
			<td>271, 189, 123</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>白三烯 B4</td>
			<td>14.73</td>
			<td>335</td>
			<td>181, 109, 93, 71, 69, 59, 57</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15d-Δ12,14-PGJ2</td>
			<td>16.80</td>
			<td>315</td>
			<td>297, 271, 217, 203, 158</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(S)-HpETE</td>
			<td>17.88</td>
			<td>335</td>
			<td>97, 83, 81, 57</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 13种二十碳衍生物标准品在LC-MS/MS方法中的保留时间及关键产物离子3 . 开发LC-MS/MS程序时使用了30多种标准品。色谱保留时间（RT）在结构非常相似的前列腺素（PG）之间也存在差异，PGF1α和PGF2α是例外。然而，这些PG可通过其母离子质量（[M-H]- m/z）和碰撞诱导解离谱（MS/MS）加以区分。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>前列腺素类别</td>
			<td>图3中的编号</td>
			<td>[M-H]- m/z</td>
			<td>MS/MS中的关键产物离子</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F1 (CePGF1)</td>
			<td>1</td>
			<td>355</td>
			<td>319, 301, 311, 293, 275, 265, 237, 223, 211, 195, 157</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F1</td>
			<td>2</td>
			<td>355</td>
			<td>311, 301, 293, 275, 265, 211, 195, 167, 157</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F2 (CePGF2)</td>
			<td>3</td>
			<td>353</td>
			<td>309, 291, 273, 263, 247, 209, 193, 171, 165, 127</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F2</td>
			<td>4</td>
			<td>353</td>
			<td>309, 291, 273, 263, 255, 247, 219, 209, 193, 171, 113</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F3</td>
			<td>5</td>
			<td>351</td>
			<td>315, 307, 289, 275, 249, 205, 193, 191, 167, 153, 139</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F3</td>
			<td>6</td>
			<td>351</td>
			<td>333, 289, 271, 261, 245, 223, 193, 191, 163</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 图3中所示的几种主要C. elegans F1、F2和F3 PGs的碰撞诱导解离产物离子。其他丰度较低的异构体的MS/MS结果未显示。这些数据来自多次分析，单次运行中可能无法观察到所有产物离子。鉴于提取物的复杂性，一些丰度较低的产物离子可能来源于具有相似保留时间的其他母离子，或由干扰导致。峰2可能是CePGF1的立体异构体，峰4可能是CePGF2的立体异构体。更多数据参见Edmonds, et al. (2010)3。

本文中，我们描述了一种利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）从秀丽隐杆线虫（C. elegans）中提取和分析前列腺素及其他二十碳衍生物的优化流程。

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）正作为一种强大的动物模型被广泛应用于脂质生物学研究1-9。前列腺素是一类重要的二十碳脂肪酸衍生物（eicosanoids），……

本实验旨在鉴定并测定海葵提取物中的前列腺素及其他类二十烷酸。首先，大规模培养蠕虫。然后采用液-液萃取技术，从蠕虫组织中提取亲水性脂质，将脂质提取物注入与质谱仪联用的高效液相色谱柱中。然后分析液相色谱串联质谱法获得的数据。最终，这种针对纯化温提物的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法不仅能够鉴定新的代谢物，还能定量已知的代谢物，例如S系列前列腺素。因此，与现有的酶联免疫分析等方法相比，该技术的主要优势在于其高灵敏度和高特异性，同时兼具全面性和灵活性。本技术将由我实验室的研究生 Hugh Hong 演示。关于线虫的补充喂养，请使用NA22菌株的菌苔。通过离心收集细菌，弃去上清液，并将菌体沉淀重悬于100毫升M9缓冲液中。将浓缩的细菌溶液在4°C下保存。在五块超大型NGM平板上开始线虫培养。继续传代培养线虫三到四代，直到培养皿中充满线虫。为防止成虫饥饿，根据需要向线虫培养皿中加入约一毫升浓缩细菌。在盖上盖子前，彻底空气干燥。接下来，用M9缓冲液将平板上的抓取型雌雄同体线虫冲洗下来。将线虫收集到一个50毫升的圆锥形聚丙烯管中。然后让线虫沉降到管底。弃去含有细菌卵和幼虫阶段线虫的上清液。现在进行重悬，将剩余的线虫加入15毫升M9缓冲液中并轻轻混匀。将200微升线虫悬液分配至60个已接种NGM平板中的每一个。在接种完所有培养板之前，始终充分混匀线虫溶液，以确保各培养板中的线虫数量大致相等。将线虫均匀分散至各培养板中。培养线虫两到四代，每12至24小时为每块板补充一毫升浓缩细菌溶液。当培养皿中充满GR成虫时，依次收获每种品系的线虫。用M9缓冲液将线虫从培养皿中冲洗下来，并转移至六个50毫升聚丙烯管中。用M9缓冲液充满各管，以洗涤线虫。当成虫沉降至底部后，移除约 35 毫升上清液。然后将线虫转移至一个或两个离心管中。使用大口径巴斯德移液管重复用 M9 溶液洗涤三次，或直至上清液变得透明。尽可能将更多线虫转移至一个15毫升聚丙烯圆锥管中。在1000 RCF下离心5分钟，弃去上清液。对其他菌株重复进行收集、洗涤和合并步骤。将收获的线虫品系贮存于-80摄氏度。使用烧红的剃须刀片标记聚丙烯锥形管的重量。在含有收获线虫的冷冻聚丙烯管六毫升刻度附近进行切割。在无菌条件下，将约六克冷冻虫体沉淀转移至目标样品中。加入一纳克内标物和12毫升冰冻丙酮盐溶液。加入BHT混合液后，将1.5毫升的线虫悬液均匀分配至12个5毫升自立式塑料管中，每管一份。向每管加入0.7毫升经稳定处理的氧化锆珠。如有需要，对线虫悬液进行匀浆处理。使用9英寸牧草移液管，重复该步骤1分钟，使完整虫体少于10%。小心地将匀浆液（不包括珠子）转移至四个10毫升锥形玻璃管中。合并其中三个管中的珠子，并用1毫升含BHT的丙酮盐溶液洗涤。对剩余含有珠子的离心管重复此洗涤步骤。将洗涤液转移至冰上的玻璃管中。接着，将匀浆以 1000 ×g 离心 10 分钟。在 4 摄氏度条件下，将每支试管中的上清液转移至洁净的 10 毫升玻璃锥形管中。随后在化学通风橱中，向每支试管中加入等体积的正己烷，涡旋振荡 30 秒（最大速度）。然后在 4 摄氏度、1000 ×g 条件下离心 10 分钟。弃去含有己烷和中性脂质的上层相，加入两毫摩尔甲酸以酸化下层水相，用 pH 试纸检测至 pH 为 3.5。随后，向每支试管中加入等体积的氯仿，涡旋振荡 30 秒，速度调至最大。将样品在 4 摄氏度、约 1000 ×g 条件下离心 10 分钟。将玻璃移液管尖端插入下层氯仿相中，倾斜试管以尽量避免接触中间的固体界面。将四根试管中的提取物转移至一个 15 毫升锥形玻璃管中。用氮气排尽玻璃管中的空气，于零下20摄氏度孵育24小时至两周。解冻提取物后，若存在剩余的乳白色水相上层，弃去该层。使用新的移液管。在通风橱中，将氯仿转移至已标记且带有聚四氟乙烯衬垫的半容量DRM玻璃小瓶中。用温和的氮气气流蒸发有机溶剂，将样品在-20摄氏度下保存，最长可保存两周。首先，用甲醇配制各种参考前列腺素的储备溶液。现在，用80%甲醇进行系列稀释，制备标准曲线。接着，将干燥的海刺参脂质提取物溶解于200微升80%甲醇中用于分析。取20至50微升样品注入反相色谱柱，按照文本方案中所述条件，采用负离子模式电喷雾电离（ESI）接口进行梯度分析。将色谱柱流出物引入质谱仪。设定碰撞气体为10电子伏特，碰撞能量为-35电子伏特。在600摄氏度下的温度。在负90和负11时的去杂潜力生成标准曲线，使用analyst软件分析提取样品中存在的不同类别的前列腺素。处理数据以鉴定蠕虫提取物中存在的前列腺素。野生型与fat three突变型线虫提取物的全扫描显示了质荷比在315至360原子质量单位范围内的离子整体水平。与野生型线虫相比，fat three突变体几乎缺失了大多数20碳PFAS，例如F three类前列腺素。通过将母离子电荷比3 51以灰色高亮显示，多反应监测（MRM）分析可识别不同类别的前列腺素。例如，F1 类前列腺素存在于野生型提取物中，以及其他几种保留时间更长的疏水性化合物；通过改变质荷比转换，可进一步分析 F2 和 F3 类前列腺素，表明线虫提取物中含有各类前列腺素的多种异构体。通过比较秀丽隐杆线虫前列腺素与标准前列腺素的碰撞诱导解离图谱，可用于定位预期断裂位点的产物离子。为防止脂质氧化，请注意采取适当的预防措施。例如，将抗氧化剂VHT加入指定溶液中，并用氮气对提取物进行吹扫。

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空间与时间上对 C. elegans 生殖系中活性 ERK 的分析

我们提出一种用于三维重建的自动化方法 秀丽隐杆线虫 生殖系.

计算分析 秀丽隐杆线虫 生殖系中细胞核、蛋白质及细胞骨架分布的研究

本实验方案演示了如何利用绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白作为标记，并结合4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色，在热应激条件下追踪蛋白质的核转位过程。DAPI染色步骤快速，且能有效保留GFP及蛋白质亚细胞定位信号。...

通过绿色荧光蛋白标记与4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色检测蛋白质亚细胞定位 秀丽隐杆线虫

精子必须成功穿过输卵管才能使卵子受精。本文中，我们描述了一种用于检测秀丽隐杆线虫（C.

测量精子导向性与运动能力 秀丽隐杆线虫 雌雄同体生殖道

本文介绍了生成、纯化和定量的方法 秀丽隐杆线虫...

纯化与分析 秀丽隐杆线虫 细胞外囊泡

动态微管成像方案 体内 使用荧光标记的末端结合蛋白对秀丽隐杆线虫后侧微管（PLM）神经元中动态微管进行标记、成像和分析的方法已得到描述。 秀丽隐杆线虫.

秀丽隐杆线虫神经元中微管动态与取向的活体评估

本文介绍了一种使用市售组织试剂盒从一个或少数几个秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

小规模提取 Caenorhabditis elegans 基因组 DNA

本方案描述了一种RNA干扰和染色质免疫沉淀实验，用于研究RNA干扰诱导的沉默及其相关染色质修饰在C.

利用荧光报告基因与染色质免疫沉淀（ChIP）分析秀丽隐杆线虫（C. elegans）中的跨代表观遗传

本方案建立了提取和量化秀丽隐杆线虫（C.

秀丽隐杆线虫中挥发性性信息素的提取与化学吸引测定

学习从秀丽隐杆线虫中提取和分析前列腺素及其他类花生酸的方法，利用液相色谱-串联质谱技术实现高灵敏度和特异性检测。该方法为脂质代谢研究提供了可靠工具。

秀丽隐杆线虫中前列腺素的提取与分析

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