基于MBP标签策略制备Mgm101重组蛋白

本实验的总体目标是利用麦芽糖结合蛋白（MVP）标签策略，制备较大的寡聚化DNA结合蛋白，例如MGM101。首先将MGM101的开放阅读框克隆至PMLC2E载体中MVP基因的下游，以实现在大肠杆菌（E. coli）中的表达。随后通过AMLO亲和层析法从大肠杆菌中纯化MVP-MGM101融合蛋白。

MGM 1 0 1 通过蛋白酶切从MVP上释放，并通过阳离子交换色谱与MVP分离。最后，MGM 1 0 1 环通过尺寸排阻色谱纯化至均一。最终获得约0.8毫克可溶性MGM 1 0 1。

从一升细菌培养物中可获得用于该蛋白质生化与结构表征的样品，该蛋白质在线粒体DNA修复过程中具有重要作用。使用带有可裂解标签的MGM101蛋白版本的主要优势在于，相较于无标签版本，该版本毒性更低、溶解度更高且更稳定。因此，我们能够在大肠杆菌中实现天然MGM101蛋白的高水平表达。

大家好，我叫Sarah Vicki。我是纽约州立大学上州医科大学Dr. Jji TEN实验室的高级研究支持专家。我的同事wan Wong和我将为大家演示MGM101蛋白的表达与纯化。首先，通过PCR扩增成熟的MGM101编码序列，以启动融合蛋白的表达。

不要包含已知在导入线粒体后会被切除的 MGM101 蛋白前 22 个氨基端氨基酸残基。将扩增后的 MGM101 基因插入表达载体 pMAL-c2e 的 MAL E 序列下游，该序列编码麦芽糖结合蛋白（MVP）的融合蛋白。由此构建出 M-V-P-M-G-M101 融合蛋白，其中包含一段带有 Precision 蛋白酶切割位点的连接序列。质粒的构建首先通过选择不含蓝白斑筛选的 E. coli 转化子完成。

将所得质粒PLC two E, MGM 1 0 1 转化至大肠杆菌BL two one codon plus DE three RIL菌株中，并在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上培养。首先，用大肠杆菌转化子接种10毫升新鲜的补充LB培养基，于37摄氏度、200 RPM振荡条件下过夜培养。次日，取10毫升预培养物接种至2升补充LB培养基中。

在 37 摄氏度下振荡培养细胞。当 OD 600 达到 0.5 时，加入 IPTG 至终浓度为 0.3 毫摩尔，诱导 M-B-P-M-G-M 1 0 1 融合蛋白的表达，并在 30 摄氏度下继续振荡培养 5 小时。5 小时后，将培养物转移至 500 毫升离心管中，通过离心收集细胞。

弃去上清液后，加入30毫升含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液，通过上下吹打重悬细胞沉淀。接着，在冰上对细胞悬液进行超声处理，持续20秒。使用超声处理器，设置占空比为50%，每次超声后在冰上冷却细胞30秒。

然后重复超声处理和冷却步骤，再进行两次，保持悬浮液置于冰上。加入1 mL浓度为2 mg/mL的溶液。

将DNA样品与细胞裂解液在4°C下孵育两小时。两小时后，向36毫升裂解液中加入4毫升5摩尔的氯化钠，将最终盐浓度调整至500毫摩尔。

然后在4°C条件下以10,000 × g离心30分钟，以去除细胞碎片。将上清液转移至新的离心管中。此时，可取20 µL等分试样，通过超声处理来监测裂解效率。

在SDS-PAGE凝胶上。接下来，将细胞裂解液通过一个淀粉酶柱。为纯化MVP-MGM101融合蛋白，首先向一个15毫升的圆底管中加入1.5毫升50% AMLO树脂悬液。

然后加入13毫升裂解缓冲液以平衡，于2000 × g离心5分钟。重复此洗涤步骤4次，随后将树脂重悬于0.75毫升裂解缓冲液中。将平衡后的AMLO悬液加入细胞裂解液中，于4°C轻轻摇动过夜。

第二天，将裂解液与 amylose 树脂的混合物上样至安装在冷室中的 Econo 柱层析柱中。打开活塞，使未结合的蛋白质通过重力过滤进入收集管。随后，加入 300 毫升洗涤缓冲液一，洗涤 AMLO 树脂。

待其完全通过后，用150毫升洗涤缓冲液二重复洗涤一次。按照文本方案中所述加入Elution缓冲液并收集EIT，通过将EIT样品上样至SDS-PAGE凝胶，测定M-V-P-M-G-M 1 0 1的得率和纯度。

电泳结束后进行考马斯染色，应可见一条约70千道尔顿的主要单一条带。向M-V-P-M-G-M 1 0 1 EITs中加入50单位的精密蛋白酶，并将其置入含透析缓冲液的透析袋中。在4摄氏度下孵育过夜，使切割反应充分进行。

按照之前的方法运行SDS-PAGE凝胶。为评估切割效率，完全切割应产生两条分别对应于MVP和MGM101的条带，大小分别为42和28千道尔顿。将切割后的MVP-MGM101通过多次进样加载到连接于BioRad Biologic DUO流式FPLC系统的生物级mini macro prep High S柱上。

通过应用五步盐梯度开始阳离子交换层析，梯度分别为5毫摩尔、300毫摩尔、500毫摩尔、750毫摩尔和1000毫摩尔的氯化钠，该梯度通过混合缓冲液A和缓冲液B制备。设定流速为每分钟0.5毫升。使用馏分收集器收集每管2毫升的馏分，通常MGM 1 0 1在500毫摩尔盐浓度下洗脱。

合并MGM101峰的组分，并通过SDS-PAGE凝胶检测蛋白纯度。合并阳离子交换层析所得的MGM101峰组分后，经透析去除盐分，蛋白在4°C下用GF平衡缓冲液透析过夜。随后，将蛋白转移至Aveva Spin 15R超滤离心柱中，在4°C、3000 × g条件下离心浓缩蛋白。

当体积减少至约一毫升时，将MGM101上样至已用层析缓冲液平衡的校准Supra6凝胶过滤柱中，以每分钟0.5毫升的流速开始尺寸排阻层析。大分子寡聚蛋白在早期洗脱组分中出现，而小分子蛋白则在后期洗脱组分中出现。MGM101环状结构的洗脱分子量约为400千道尔顿。

使用自动收集器收集纯化的MGM101蛋白峰的各组分，并取各组分等分试样加载至12% SDS-PAGE凝胶上，以检测蛋白的最终纯度。随后，使用Aveva浓缩蛋白样品，并在4°C、3000 × g条件下离心6分钟进行浓缩。

然后将微量离心管中的蛋白质分装样品浸入液氮中两分钟，迅速冷冻。样品在负80摄氏度下可保存六至十二个月。使用MGM 1 0 1样品进行单链DNA结合实验以及通过透射电子显微镜进行结构观察。

电泳迁移率偏移实验的结果表明，纯化的MGM101对单链DNA具有强烈的结合活性。随着寡聚体MGM101浓度的增加，单链DNA探针在天然聚丙烯酰胺凝胶的加样孔中滞留程度逐渐增强。

当MGM101的浓度高于400纳摩尔时。这些电子显微图像显示了MGM101的高级结构组织。新制备的MGM101呈直径为20纳米的独立环状结构，可通过负染透射电镜观察到。

在 4 摄氏度下储存数周后，MGM 1 0 1 会形成超分子螺旋丝状结构。一旦掌握，该技术可在一周内完成。

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