Name: MBP基于标记策略的Mgm101重组蛋白的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: 学习利用麦芽糖结合蛋白标记策略制备酵母线粒体核蛋白Mgm101的方法，通过亲和层析、离子交换和尺寸排阻层析获得高纯度可溶性蛋白，用于研究线粒体DNA重组与维护机制。

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我们感谢 Stephan Wilkens 在透射电子显微镜方面的帮助。本工作由美国国立卫生研究院资助项目 R01AG023731 支持。

先前的研究表明，Mgm101 的前 22 个氨基末端氨基酸残基在导入线粒体后会被切除19。为了在 Escherichia coli 中表达，通过 PCR 扩增缺失前 22 个密码子的 MGM101 开放阅读框，并将其插入到表达载体 pMAL-c2E 的一个修饰版本中，位于编码麦芽糖结合蛋白（MBP）的 malE 序列下游。由此构建出含有 PreScission 蛋白酶切割位点的连接序列的 MBP-Mgm101 融合蛋白（图 3）。首先通过在不含 IPTG 和 X-gal 的培养基上进行蓝白斑筛选，选择 E. coli 转化子以构建质粒。随后将构建好的质粒 pMAL-c2E-MGM101 转入 E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 菌株，并通过筛选氨苄青霉素和氯霉素抗性菌落获得阳性克隆。
1. 表达、诱导、细胞裂解和DNase I处理
<ol>
	<li>将新鲜转化子接种于10 ml LB培养基（1% Bacto胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1% NaCl）中，培养基中添加葡萄糖（0.2%）、氨苄青霉素（100 μg/ml）和氯霉素（50 μg/ml）。在37 °C、200 rpm振荡条件下过夜培养。</li>
	<li>将10 ml预培养物接种至2升上述添加成分的LB培养基中。在37 °C振荡培养，直至OD600达到0.5。</li>
	<li>加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.3 mM，诱导MBP-Mgm101融合蛋白的表达。在30 °C振荡培养5小时。</li>
	<li>使用Beckman JA-10转子离心收集细胞（5,500 × g，4 °C，10分钟）。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于30 ml裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.4，1 mM EDTA，pH 7.4）中，缓冲液含蛋白酶抑制剂（25 μM亮抑蛋白酶肽，1 μM胃蛋白酶抑制剂A和1 mM PMSF）。</li>
	<li>在冰上使用超声处理器（Heat Systems；型号W-385）以50%占空比对细胞悬液超声处理20秒，冰上冷却30秒，重复此步骤2次。</li>
	<li>加入1 ml浓度为2 mg/ml的DNase I储备液。在4 °C轻轻摇动细胞裂解物2小时。</li>
	<li>调节NaCl至终浓度500 mM。</li>
	<li>在4 °C以10,000 × g离心30分钟，去除细胞碎片。</li>
</ol>
2. 使用淀粉亲和层析进行纯化
<ol>
	<li>用裂解缓冲液平衡1.5 ml amylose树脂（50%悬浊液）。将平衡后的amylose树脂加入细胞裂解液中，4 °C轻柔摇动过夜。</li>
	<li>将裂解液-树脂混合物上样至安装于冷室中的Econo-Column层析柱。依靠重力使未结合的蛋白质流过柱体。</li>
	<li>用300 ml洗涤缓冲液I（20 mM Tris-HCl，pH 7.4；400 mM NaCl；1 mM EDTA，pH 7.4；0.2 mM PMSF）洗涤amylose树脂。</li>
	<li>用150 ml洗涤缓冲液II（20 mM Tris-HCl，pH 7.4；200 mM NaCl；1 mM EDTA，pH 7.4；0.2 mM PMSF）重复洗涤一次。</li>
	<li>向柱中加入5 ml洗脱缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.4；200 mM NaCl；1 mM EDTA，pH 7.4；0.2 mM PMSF，10 mM麦芽糖），4 °C孵育10分钟，收集洗脱液，并重复多次以提高回收率。</li>
	<li>合并洗脱液，取部分样品进行SDS-PAGE电泳并用考马斯亮蓝染色，以测定MBP-Mgm101的产量和纯度（图4）。</li>
</ol>
3. PreScission 蛋白酶切割与阳离子交换层析
<ol>
	<li>向MBP-Mgm101洗脱液中加入50单位的PreScission蛋白酶。在4 °C下过夜进行切割反应，并在透析缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.4；100 mM NaCl；2 mM DTT；1 mM EDTA，pH 7.4；以及0.2 mM PMSF）中继续透析。</li>
	<li>通过SDS-PAGE凝胶检测切割反应的效率（图5A）。</li>
	<li>将切割后的MBP-Mgm101通过多次进样加载到连接于Bio-Rad Biologic DuoFlow FPLC系统的Bio-Scale Mini Macro-Prep High S柱上。</li>
	<li>通过使用缓冲液A（5 mM NaCl；10 mM Na-磷酸盐，pH 7.2；1 mM PMSF）和缓冲液B（1 M NaCl；10 mM Na-磷酸盐，pH 7.2；1 mM PMSF）配制的5 mM、300 mM、500 mM、750 mM和1,000 mM NaCl阶梯盐浓度梯度，开始阳离子交换层析。流速设定为0.5 ml/min。收集Mgm101组分，并通过SDS-PAGE凝胶检测蛋白纯度（图5B）。</li>
</ol>
4. 尺寸排阻色谱
<ol>
	<li>合并阳离子交换层析所得的蛋白组分。将蛋白在GF平衡缓冲液（20 mM MOPS，pH 7.0；150 mM NaCl；1 mM EDTA，pH 7.4；5 mM 2-巯基乙醇；0.2 mM PMSF）中透析。</li>
	<li>使用VIVASPIN 15R超滤离心柱在4 °C、3,000 × g条件下离心浓缩蛋白，将体积减少至约1 ml。</li>
	<li>将Mgm101上样至经色谱缓冲液（20 mM MOPS，pH 7.0；150 mM NaCl；5 mM β-巯基乙醇；1 mM EDTA，pH 7.4；0.2 mM PMSF）预平衡的校准Superose 6制备级柱上。</li>
	<li>以0.5 ml/min流速的色谱缓冲液开始进行凝胶过滤层析。</li>
	<li>收集纯化后Mgm101峰对应的组分，并取各组分等分试样上样至12% SDS-PAGE，以检测蛋白的最终纯度。</li>
	<li>使用VIVASPIN 6超滤柱浓缩蛋白，随后将样品在液氮中快速冷冻，并保存于-80 °C。</li>
	<li>在6–12个月内使用Mgm101样品进行单链DNA结合实验（图8）以及透射电子显微镜下的结构观察（图9）。</li>
</ol>

<ol><li>San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+eukaryotic+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of eukaryotic homologous recombination.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).</li>
<li>Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMC1%3A+a+meiosis-specific+yeast+homolog+of+E.+coli+recA+required+for+recombination%2C+synaptonemal+complex+formation%2C+and+cell+cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression.</a> Cell. 69, 439-456 (1992).</li>
<li>Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad51+protein+involved+in+repair+and+recombination+in+S.+cerevisiae+is+a+RecA-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein.</a> Cell. 69, 457-470 (1992).</li>
<li>Passy, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Dmc1+protein+binds+DNA+as+an+octameric+ring%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 10684-10688 (1999).</li>
<li>Story, R. M., Weber, I. T., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+E.+coli+recA+protein+monomer+and+polymer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer.</a> Nature. 355, 318-325 (1992).</li>
<li>Yu, X., Jacobs, S. A., West, S. C., Ogawa, T., Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+structure+and+dynamics+in+the+helical+filaments+formed+by+RecA+and+Rad51+on+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8419-8424 (2001).</li>
<li>Conway, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+Rad51+filament%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a Rad51 filament.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 791-796 (2004).</li>
<li>Bai, Y., Davis, A. P., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+allele+of+RAD52+that+causes+severe+DNA+repair+and+recombination+deficiencies+only+in+the+absence+of+RAD51+or+RAD59%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence of RAD51 or RAD59.</a> Genetics. 153, 1117-1130 (1999).</li>
<li>Bai, Y., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rad52+homolog+is+required+for+RAD51-independent+mitotic+recombination+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).</li>
<li>Paques, F., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathways+of+recombination+induced+by+double-strand+breaks+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).</li>
<li>Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+novel+recombinases+in+bacteriophage+genomes+unveils+Rad52%2C+Rad51+and+Gp2.5+remote+homologs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs.</a> Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).</li>
<li>Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+structure+and+quaternary+organization+of+the+bacteriophage+P22+Erf+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein.</a> J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).</li>
<li>Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rings+and+filaments+of+beta+protein+from+bacteriophage+lambda+suggest+a+superfamily+of+recombination+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).</li>
<li>Ploquin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+basis+for+a+bacteriophage+homolog+of+human+RAD52%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52.</a> Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).</li>
<li>Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MGM101%2C+a+nuclear+gene+involved+in+maintenance+of+the+mitochondrial+genome+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).</li>
<li>Meeusen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mgm101p+is+a+novel+component+of+the+mitochondrial+nucleoid+that+binds+DNA+and+is+required+for+the+repair+of+oxidatively+damaged+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA.</a> J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).</li>
<li>Mbantenkhu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mgm101+is+a+Rad52-related+protein+required+for+mitochondrial+DNA+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination.</a> J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).</li>
<li>Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+properly+configured+ring+structure+is+critical+for+the+function+of+the+mitochondrial+DNA+recombination+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mgm101.+J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein.</a> Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).</li>
<li>Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+core+of+the+mitochondrial+genome+maintenance+protein+Mgm101p+in+Saccharomyces+cerevisiae+determined+with+a+temperature-conditional+allele%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele.</a> FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).</li>
<li>Itoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+packaging+proteins+Glom+and+Glom2+coordinately+organize+the+mitochondrial+nucleoid+of+Physarum+polycephalum%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum.</a> Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).</li>
<li>Janicka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+RAD52-like+single-stranded+DNA+binding+protein+affects+mitochondrial+DNA+repair+by+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination.</a> Plant J. 72, 423-435 (2012).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

从大肠杆菌（E. coli）中表达稳定且具有天然构象的重组Mgm101蛋白一直存在挑战，这可能是由于该蛋白在细菌细胞中不溶所致。在本报告中，我们证明MBP融合策略可使该蛋白达到相对较高的表达水平。我们此前已通过负染透射电子显微镜和凝胶过滤层析技术证实，MBP融合蛋白在体外（in vitro）能够形成均一的寡聚体18。Mgm101蛋白在细菌细胞中的折叠和寡聚化过程可能比在线粒体基质中更慢。未形成寡聚体的Mgm101可能迅速聚集，从而在体内（in vivo）产生毒性。MBP标签可能使Mgm101保持可溶性构象，促进其有效寡聚化，并降低其毒性。
高质量Mgm101制备的一个重要标准是DNA污染尽可能少。A280/A260比值用于估计样品中DNA污染物的水平。通常，该比值&gt;1.4时较易实现，表明样品质量良好，核酸污染物含量&lt;0.75%。若A280/A260比值低于此标准，建议延长DNA酶I的消化时间。未来或许可以进...

同源重组在双链断裂（DSBs）和链间交联的修复以及从坍塌的复制叉重新启动DNA复制过程中起着重要作用1。在传统的同源重组过程中，核心反应由ATP依赖性重组酶催化，原核生物中的RecA以及真核生物中的Rad51和Dmc1即属于此类重组酶1-3。这些重组酶在单链DNA（ssDNA）上形成核蛋白丝结构，这对于在双链DNA模板中启动同源序列搜索和链侵入至关重要（图1，左图）4-7。除了这种传统机制外，同源重组也可在不依赖RecA/Rad51的途径下进行（图1，右图）。例如，酵母中的Rad52和Rad59蛋白可直接催化由双链DNA断裂经末端切除后暴露的互补单链DNA之间的退火反应。这一重组过程被称为单链退火，通常不涉及与双链DNA模板的同源配对。退火完成后，异源末端由外切核酸酶切除，切口则通过连接酶连接，从而恢复基因组的连续性8-10。通过单链退火机制进行的修复通常会导致直接重复区域之间基因组序列的缺失。
Rad52 属于一类在噬菌体中广泛存在的重组蛋白 11这些蛋白质也被称为单链退火蛋白（Single Strand Annealing Proteins, SSAPs），因其能够促进同源单链DNA分子的退火而得名。目前研究最为清楚的噬菌体SSAPs包括来自噬菌体λ和P22的Redβ和Erf，以及来自前噬菌体的RecT。 rac 以及乳酸菌噬菌体ul36的Sak蛋白。SSAPs在结构上具有典型的β-β-β-α折叠，尽管它们的一级序列相似性几乎无法检测。它们均形成具有10至14重对称性的大型同源寡聚环状结构 体外 12-14这种特征性的高级结构组织的功能意义尚不明确。
我们致力于研究线粒体基因组中同源重组的机制。此前，我们已鉴定出对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）线粒体DNA（mtDNA）维持至关重要的MGM101基因15。MGM101随后被发现与线粒体核样结构相关，并在mtDNA耐受DNA损伤试剂的过程中发挥必需作用16。然而，在过去十年中，Mgm101的研究因难以获得重组Mgm101蛋白而受到阻碍。我们最近通过MBP融合策略，成功地从大肠杆菌（E. coli）中大量表达出可溶性的Mgm101蛋白。这一突破使我们得以证实，Mgm101在生化特性与结构上与Rad52家族蛋白具有相似性17,18。本文报道了一种三步纯化流程，可获得均一的Mgm101蛋白，用于后续的生化与结构分析（图2）。

<table><tbody><tr><td>表达载体 pMAL-c2E</td><td>New England Biolabs</td><td>#N8066S</td><td></td></tr><tr><td>PreScission 蛋白酶</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>#27-0843-01</td><td></td></tr><tr><td>BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 细胞</td><td>Strategene</td><td>#230245</td><td></td></tr><tr><td>亮抑蛋白酶肽（Leupeptin）</td><td>Roche Applied Science</td><td>#11034626001</td><td></td></tr><tr><td>胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）</td><td>Roche Applied Science</td><td>#11359053001</td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（Phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF）</td><td>Roche Applied Science</td><td>#10837091001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>#DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>异丙基-&amp;#946;-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）</td><td>Roche Applied Science</td><td>#11411446001</td><td></td></tr><tr><td>淀粉树脂（Amylose resin）</td><td>New England Biolabs</td><td>#E8021L</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Column 层析柱</td><td>BIO-RAD</td><td>#7372512</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Scale Mini Macro-Prep High S 柱芯（1 ml）</td><td>BIO-RAD</td><td>#732-4130</td><td></td></tr><tr><td>VIVASPIN 15R 超滤离心柱（10,000 MWCO）</td><td>Sartorius Stedium</td><td>#VS15RH02</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 prep grade 层析柱</td><td>Amersham Bioscirnces</td><td>#17-0489-01</td><td></td></tr><tr><td>VIVASPIN 6 超滤离心柱（5,000 MWCO）</td><td>Sartorius Stedium</td><td>#VS0611</td><td></td></tr></tbody></table>

基于mbp标签策略制备mgm101重组蛋白

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

MGM101 基因在20年前因其在维持线粒体DNA中的作用而被发现。多个研究小组的研究表明，Mgm101蛋白参与线粒体DNA的重组修复过程。最近的研究指出，Mgm101属于Rad52型重组蛋白家族。这类蛋白可形成大的寡聚环状结构，并促进同源单链DNA分子的退火。然而，由于难以获得重组蛋白，Mgm101的表征工作一直受到阻碍。本文描述了一种可靠的重组Mgm101蛋白制备方法。首先在Escherichia coli中表达带有麦芽糖结合蛋白（MBP）标签的Mgm101融合蛋白。该融合蛋白首先通过淀粉亲和层析进行初步纯化。经蛋白酶切释放后，利用阳离子交换层析将Mgm101与MBP分离。再通过分子筛层析获得单一分散状态的Mgm101蛋白。通常可从每升细菌培养物中获得约0.87 mg的Mgm101。所获得的重组Mgm101蛋白中DNA污染极低。制备的样品已成功用于Mgm101的生物化学、结构分析以及单颗粒图像分析。该实验方案也可适用于其他可能在细菌细胞中错误折叠且具有毒性的大型寡聚DNA结合蛋白的制备。

Mgm101 是一种与 Rad52 相关的线粒体重组蛋白。Rad52 在线粒体 DNA 重组中的作用已被广泛研究（图 1）。重组 Mgm101 可通过三步法进行制备（图 2）。该过程得益于 MBP 标签策略的应用，该策略可使 Mgm101 以可溶形式表达，并随后通过蛋白酶切去除标签而释放出目标蛋白（图 3）。
在常规制备中，经过淀粉亲和层析后，每升细菌培养物可回收约 2-3 mg 的 MBP-Mgm101 融合蛋白。在 SDS-PAGE 凝胶上，MBP-Mgm101 显示为一条主带，大小约为 70 kDa（图 4）。如果在洗脱前对树脂进行了适当的洗涤，则其他蛋白质的污染极少。经 PreScission 蛋白酶切割后，MBP 和 Mgm101 在 SDS-PAGE 上分别显示为 42 kDa 和 28 kDa 的条带（图 5A）。若消化不完全（表现为存在约 70 kDa 的条带），建议使用额外的 PreScissio...

酵母线粒体核样区蛋白 Mgm101 是一种 Rad52 型重组蛋白，能够形成大的寡聚环状结构。本文描述了一种利用麦芽糖结合蛋白（MBP）标签策略，结合阳离子交换层析和尺寸排阻层析来制备可溶性重组 Mgm101 的实验方案。

基于MBP标签策略制备Mgm101重组蛋白

MGM101 基因在20年前因其在维持线粒体DNA中的作用而被发现。多个研究团队的研究表明，该……

本实验的总体目标是利用麦芽糖结合蛋白（MVP）标签策略，制备较大的寡聚化DNA结合蛋白，例如MGM101。首先将MGM101的开放阅读框克隆至PMLC2E载体中MVP基因的下游，以实现在大肠杆菌（E. coli）中的表达。随后通过AMLO亲和层析法从大肠杆菌中纯化MVP-MGM101融合蛋白。MGM 1 0 1 通过蛋白酶切从MVP上释放，并通过阳离子交换色谱与MVP分离。最后，MGM 1 0 1 环通过尺寸排阻色谱纯化至均一。最终获得约0.8毫克可溶性MGM 1 0 1。从一升细菌培养物中可获得用于该蛋白质生化与结构表征的样品，该蛋白质在线粒体DNA修复过程中具有重要作用。使用带有可裂解标签的MGM101蛋白版本的主要优势在于，相较于无标签版本，该版本毒性更低、溶解度更高且更稳定。因此，我们能够在大肠杆菌中实现天然MGM101蛋白的高水平表达。大家好，我叫Sarah Vicki。我是纽约州立大学上州医科大学Dr. Jji TEN实验室的高级研究支持专家。我的同事wan Wong和我将为大家演示MGM101蛋白的表达与纯化。首先，通过PCR扩增成熟的MGM101编码序列，以启动融合蛋白的表达。不要包含已知在导入线粒体后会被切除的 MGM101 蛋白前 22 个氨基端氨基酸残基。将扩增后的 MGM101 基因插入表达载体 pMAL-c2e 的 MAL E 序列下游，该序列编码麦芽糖结合蛋白（MVP）的融合蛋白。由此构建出 M-V-P-M-G-M101 融合蛋白，其中包含一段带有 Precision 蛋白酶切割位点的连接序列。质粒的构建首先通过选择不含蓝白斑筛选的 E. coli 转化子完成。将所得质粒PLC two E, MGM 1 0 1 转化至大肠杆菌BL two one codon plus DE three RIL菌株中，并在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上培养。首先，用大肠杆菌转化子接种10毫升新鲜的补充LB培养基，于37摄氏度、200 RPM振荡条件下过夜培养。次日，取10毫升预培养物接种至2升补充LB培养基中。在 37 摄氏度下振荡培养细胞。当 OD 600 达到 0.5 时，加入 IPTG 至终浓度为 0.3 毫摩尔，诱导 M-B-P-M-G-M 1 0 1 融合蛋白的表达，并在 30 摄氏度下继续振荡培养 5 小时。5 小时后，将培养物转移至 500 毫升离心管中，通过离心收集细胞。弃去上清液后，加入30毫升含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液，通过上下吹打重悬细胞沉淀。接着，在冰上对细胞悬液进行超声处理，持续20秒。使用超声处理器，设置占空比为50%，每次超声后在冰上冷却细胞30秒。然后重复超声处理和冷却步骤，再进行两次，保持悬浮液置于冰上。加入1 mL浓度为2 mg/mL的溶液。将DNA样品与细胞裂解液在4°C下孵育两小时。两小时后，向36毫升裂解液中加入4毫升5摩尔的氯化钠，将最终盐浓度调整至500毫摩尔。然后在4°C条件下以10,000 × g离心30分钟，以去除细胞碎片。将上清液转移至新的离心管中。此时，可取20 µL等分试样，通过超声处理来监测裂解效率。在SDS-PAGE凝胶上。接下来，将细胞裂解液通过一个淀粉酶柱。为纯化MVP-MGM101融合蛋白，首先向一个15毫升的圆底管中加入1.5毫升50% AMLO树脂悬液。然后加入13毫升裂解缓冲液以平衡，于2000 × g离心5分钟。重复此洗涤步骤4次，随后将树脂重悬于0.75毫升裂解缓冲液中。将平衡后的AMLO悬液加入细胞裂解液中，于4°C轻轻摇动过夜。第二天，将裂解液与 amylose 树脂的混合物上样至安装在冷室中的 Econo 柱层析柱中。打开活塞，使未结合的蛋白质通过重力过滤进入收集管。随后，加入 300 毫升洗涤缓冲液一，洗涤 AMLO 树脂。待其完全通过后，用150毫升洗涤缓冲液二重复洗涤一次。按照文本方案中所述加入Elution缓冲液并收集EIT，通过将EIT样品上样至SDS-PAGE凝胶，测定M-V-P-M-G-M 1 0 1的得率和纯度。电泳结束后进行考马斯染色，应可见一条约70千道尔顿的主要单一条带。向M-V-P-M-G-M 1 0 1 EITs中加入50单位的精密蛋白酶，并将其置入含透析缓冲液的透析袋中。在4摄氏度下孵育过夜，使切割反应充分进行。按照之前的方法运行SDS-PAGE凝胶。为评估切割效率，完全切割应产生两条分别对应于MVP和MGM101的条带，大小分别为42和28千道尔顿。将切割后的MVP-MGM101通过多次进样加载到连接于BioRad Biologic DUO流式FPLC系统的生物级mini macro prep High S柱上。通过应用五步盐梯度开始阳离子交换层析，梯度分别为5毫摩尔、300毫摩尔、500毫摩尔、750毫摩尔和1000毫摩尔的氯化钠，该梯度通过混合缓冲液A和缓冲液B制备。设定流速为每分钟0.5毫升。使用馏分收集器收集每管2毫升的馏分，通常MGM 1 0 1在500毫摩尔盐浓度下洗脱。合并MGM101峰的组分，并通过SDS-PAGE凝胶检测蛋白纯度。合并阳离子交换层析所得的MGM101峰组分后，经透析去除盐分，蛋白在4°C下用GF平衡缓冲液透析过夜。随后，将蛋白转移至Aveva Spin 15R超滤离心柱中，在4°C、3000 × g条件下离心浓缩蛋白。当体积减少至约一毫升时，将MGM101上样至已用层析缓冲液平衡的校准Supra6凝胶过滤柱中，以每分钟0.5毫升的流速开始尺寸排阻层析。大分子寡聚蛋白在早期洗脱组分中出现，而小分子蛋白则在后期洗脱组分中出现。MGM101环状结构的洗脱分子量约为400千道尔顿。使用自动收集器收集纯化的MGM101蛋白峰的各组分，并取各组分等分试样加载至12% SDS-PAGE凝胶上，以检测蛋白的最终纯度。随后，使用Aveva浓缩蛋白样品，并在4°C、3000 × g条件下离心6分钟进行浓缩。然后将微量离心管中的蛋白质分装样品浸入液氮中两分钟，迅速冷冻。样品在负80摄氏度下可保存六至十二个月。使用MGM 1 0 1样品进行单链DNA结合实验以及通过透射电子显微镜进行结构观察。电泳迁移率偏移实验的结果表明，纯化的MGM101对单链DNA具有强烈的结合活性。随着寡聚体MGM101浓度的增加，单链DNA探针在天然聚丙烯酰胺凝胶的加样孔中滞留程度逐渐增强。当MGM101的浓度高于400纳摩尔时。这些电子显微图像显示了MGM101的高级结构组织。新制备的MGM101呈直径为20纳米的独立环状结构，可通过负染透射电镜观察到。在 4 摄氏度下储存数周后，MGM 1 0 1 会形成超分子螺旋丝状结构。一旦掌握，该技术可在一周内完成。感谢观看。

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MBP基于标记策略的Mgm101重组蛋白的制备

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