Name: 一个手机上的宽视场荧光显微镜和荧光成像流式细胞仪 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-11T09:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: 学习将手机相机转换为宽视场荧光显微镜和荧光成像流式细胞仪的方法，利用紧凑型光流附件实现荧光成像。该技术可在资源有限环境中进行细胞分析和高通量筛选，为即时诊断提供轻便经济的解决方案。

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A. Ozcan 感谢以下机构的支持：美国总统科学家与工程师早期职业奖（PECASE）、美国陆军研究办公室（ARO）青年研究员奖、美国国家科学基金会（NSF）职业奖、美国海军研究办公室（ONR）青年研究员奖，以及美国国立卫生研究院（NIH）院长新创新者奖 DP2OD006427（由国立卫生研究院院长办公室颁发）。

在本节中，我们介绍基于手机的宽场荧光显微镜13和光流控成像细胞仪平台14的实验方案。我们将使用荧光微球和荧光标记的白细胞来测试这些成像平台。
A. 基于手机的宽场荧光显微镜和光流控成像流式细胞仪的制备
基于手机的宽场荧光显微镜或流式细胞仪主要由两部分组成：一部带摄像头的手机和一个紧凑型光流控附加装置。
1. 手机摄像头
尽管所介绍的技术几乎适用于任何手机摄像头，但我们选择索尼爱立信Aino作为这些设备的基础。该手机配备了一个约800万像素的RGB CMOS传感器，以及一个内置镜头，其焦距（f1）约为4.65 mm。
2. 用于宽场荧光显微镜的光流控附件
该光学附件由Autodesk设计，并使用Dimension Elite 3D打印机以ABSplus热塑性材料打印而成。在打印过程中，模型材料和支撑材料在打印机内部的挤出头中被加热，并逐层沉积在建模基座上。此步骤完成后，支撑材料可被溶解，从而留下一个坚固的所需原型三维模型。我们的光学附件设计包括发光二极管（中心波长约为470 nm，Digikey）、塑料滤光片（#NT54-46，Edmund Optics）、样品托盘以及一个平凸透镜 f2=15 mm（#NT45-302，Edmund Optics）。所有发光二极管和塑料滤光片均可根据荧光染料的光谱特性轻松更换。组装该光流控附件的步骤包括：
<ol>
	<li>将镜头放入其特定的镜头支架位置内的附件中。</li>
	<li>将塑料滤光片放置在滤光片托盘上，并将其滑入附件中；或者将塑料滤光片用胶带固定在手机摄像头镜头前方。</li>
	<li>将LED托盘插入附件中。</li>
	<li>将样本玻片放入样本托盘中，再将样本托盘滑入附件内，并使LED面向样本。</li>
	<li>将附件夹在手机上，确保附加镜头与手机摄像头镜头直接接触。</li>
	<li>使用附件上的开关打开LED灯。</li>
	<li>使用手机摄像头的“夜景模式”拍摄目标样本图像。</li>
</ol>
3. 用于荧光成像流式细胞术的光流控附件
当需要对大量液体样本进行检测以发现稀有事件时，可优先选择光流控流式细胞仪。我们可以改造现有的宽场荧光显微镜设计，将其转变为流式细胞仪，其中采用基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流控通道，持续将液体样本输送至成像区域。光学附件由Autodesk设计，并通过Dimension Elite 3D打印机打印而成。该附件还包括发光二极管（中心波长约为470 nm，Digikey）、塑料滤光片（#NT54-46，Edmund Optics）、样本托盘和一个非球面透镜（f = 4.5 mm）（产品编号#C230TME-A；Thorlab）。组装该光流控附件的步骤包括：
<ol>
	<li>将非球面透镜放入附件中。</li>
	<li>将塑料滤光片放置在滤光片托盘上，并将其滑入附件中；或者将塑料滤光片用胶带固定在手机摄像头镜头前方。</li>
	<li>将微流控通道滑入同一光学-流体附件中。</li>
	<li>将附件夹在手机上，使附加透镜直接接触手机摄像头镜头。</li>
	<li>使用附件上的开关打开LED灯。</li>
	<li>将微流控通道连接至注射泵，并以恒定流速将液体样品注入微流控装置中。</li>
	<li>使用手机摄像头的视频模式，拍摄荧光细胞/颗粒流经微流控通道的视频。</li>
</ol>
B. 样品制备
4. 荧光微粒样品的制备
<ol>
	<li>从 Invitrogen（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）购买直径为 10 μm 的荧光微球（红色微球：产品编号 #F8834，激发/发射波长 580 nm/605 nm；绿色微球：产品编号 #F8836，激发/发射波长 505 nm/515 nm）。</li>
	<li>将 10 μl 绿色荧光微球与 10 μl 红色荧光微球混合，并加入 40 μl 去离子水。</li>
	<li>使用微量移液器取 10 μl 微球混合液滴加到载玻片上，并在上方覆盖另一张载玻片，形成三明治结构。</li>
	<li>将此三明治结构插入样品托盘，并滑入手机附件中。</li>
</ol>
5. 荧光标记白细胞的制备
<ol>
	<li>从冰箱中取出SYTO16核酸荧光标记试剂盒（#S7578，Life Technology）和磷酸盐缓冲液（PBS），使其恢复至室温。</li>
	<li>将200 μl全血样本从EDTA采血管转移至1.5 ml聚苯乙烯管（#05-408-129，Fisher Scientific）中。</li>
	<li>向200 μl全血样本中加入1 ml红细胞裂解缓冲液（#R7757，Sigma-Aldrich），充分混匀。</li>
	<li>5分钟后，离心裂解后的血液样本，并弃去上清液。</li>
	<li>将白细胞沉淀重悬于200 μl PBS缓冲液中，并轻轻混匀。</li>
	<li>向白细胞样本中加入5 μl 1 mM SYTO16溶液，用铝箔纸包裹样本，在避光环境中孵育约30分钟。</li>
	<li>再次离心样本，弃去上清液，将标记后的白细胞沉淀重悬于PBS缓冲液中。</li>
	<li>取5–10 μl标记后的白细胞悬液滴加至一张盖玻片上，并在样本上方覆盖第二张盖玻片。</li>
	<li>将夹心式样本载片插入样本托盘中，使用手机荧光显微镜进行成像。</li>
</ol>
或者
<ol start="10">
	<li>使用自动注射泵通过微流控通道持续输送荧光标记的白细胞，同时使用手机摄像头在视频模式下捕获流动细胞的荧光显微视频。我们还应强调，可采用便携式电池供电的注射泵，甚至重力驱动的方式，推动液体流经微流控通道。</li>
</ol>

<ol><li>Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSklar%2C+LA+%22Flow+Cytometry+for+BioTechnology%22">Flow Cytometry for BioTechnology</a>. , Oxford University Press Inc. (2005).</li>
<li>Nunez, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNunez%2C+R+%22Flow+cytometry+for+research+scientists%3A+principle+and+applications%22">Flow cytometry for research scientists: principle and applications</a>. , Horizon Press. Wymondham, UK. (2001).</li>
<li>Mertz, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMertz%2C+J+%22Introduction+to+optical+microscopy%22">Introduction to optical microscopy</a>. , Roberts and company publishers. Colorado, USA. (2010).</li>
<li>Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+deeper+than+microscopy%3A+the+optical+imaging+frontier+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology.</a> Nature Methods. 7, 603-614 (2010).</li>
<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+fluorescence+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Toward fluorescence nanoscopy.</a> Nature Biotechnology. 21, 1347-1355 (2003).</li>
<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+structured-illumination+microscopy%3A+wide-field+fluorescence+imaging+with+theoretically+unlimited+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 102, 13081-13086 (2005).</li>
<li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM.</a> Nature Methods. 3, 793-796 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophysical Journal. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Ma, Z., Gerton, J. M., Wade, L. A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+near-field+microscopy+of+DNA+at+sub-10+nm+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Fluorescence near-field microscopy of DNA at sub-10 nm resolution.</a> Physical Review Letters. 97, 260801(2006).</li>
<li>Chung, E., Kim, D., Cui, Y., Kim, Y., So, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+standing+wave+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%3A+superresolution+imaging+of+single+molecular+and+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional standing wave total internal reflection fluorescence microscopy: superresolution imaging of single molecular and biological specimens.</a> Biophysical Journal. 93, 1747-1757 (2007).</li>
<li>Greenbaum, A., Luo, W., Su, T. -W., Göröcs, Z., Xue, L., Isikman, S. O., Coskun, A. F., Mudanyali, O., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+without+lenses%3A+achievements+and+remaining+challenges+of+wide-field+on-chip+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging without lenses: achievements and remaining challenges of wide-field on-chip microscopy.</a> Nature Methods. 9, 889-895 (2012).</li>
<li>Zhu, H., Yaglidere, O., Su, T. -W., Tseng, D., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective+and+compact+wide-field+fluorescent+imaging+on+a+cell-phone%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Cost-effective and compact wide-field fluorescent imaging on a cell-phone.</a> Lab on a Chip. 11 (2), 315-322 (2011).</li>
<li>Zhu, H., Mavandadi, S., Coskun, A. F., Yaglidere, O., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optofluidic+fluorescent+imaging+cytometry+on+a+cell+phone%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Optofluidic fluorescent imaging cytometry on a cell phone.</a> Analytical Chemistry. 83, 6641-6647 (2011).</li>
<li>Suzuki, S., Abe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+Visualand+Graphics%5BTitle%5D)+AND+%22Image+Processing%22%5BJournal%5D)">Computer Visualand Graphics.</a> Image Processing. 30, 32-46 (1985).</li>
<li>Zhu, H., Sikora, U., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot+enabled+detection+of+Escherichia+coli+using+a+cell-phone%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Quantum dot enabled detection of Escherichia coli using a cell-phone.</a> Analyst. 137, 2541-2544 (2012).</li>
<li>Mudanyali, O., Dimitrov, S., Sikora, U., Padmanabhan, S., Navruz, I., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Rapid-Diagnostic-Test+Reader+Platform+on+a+Cellphone%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Integrated Rapid-Diagnostic-Test Reader Platform on a Cellphone.</a> Lab on a Chip. 12 (15), (2012).</li>
<li>Candes, E. J., Romberg, J. K., Tao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+signal+recovery+from+incomplete+and+inaccurate+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Communication+of+Pure+and+Applied+Mathematics%22%5BJournal%5D)">Stable signal recovery from incomplete and inaccurate measurements.</a> Communication of Pure and Applied Mathematics. 59, 1207-1223 (2006).</li>
</ol>

Ozcan 博士是一家初创公司的创始人，该公司致力于将计算成像和显微技术进行商业化。

我们介绍了基于手机的宽场荧光显微镜和光学流体成像流式细胞仪的最新研究成果，该技术采用轻便紧凑的光学流体附件连接至手机摄像头。利用这一平台技术，我们对包括微粒和全血样本中荧光标记的白细胞在内的荧光物体进行了成像。因此，这种紧凑且经济高效的基于手机的荧光成像工具集可能适用于现场即时诊断，特别是在资源有限的地区，可用于应对各种全球健康问题，例如对 HIV 感染者进行 CD4+ T 淋巴细胞计数监测。
除了体液分析外，这种基于手机的光流控细胞计数平台还可用于其他传感需求，例如荧光免疫分析的定量检测 例如 在资源有限环境下的水质/食品安全监测。为此，我们近期已实现了对目标物的高灵敏度、高特异性及快速检测 大肠杆菌 O157:H7 (E. coli) 在水和牛奶样品中使用相同的光流控手机附件16我们利用表面功能化的玻璃毛细管特异性且灵敏地捕获 大肠杆菌 液体样品中流经每根毛细管的颗粒被捕获 E. coli 颗粒进一步用与量子点（QD）偶联的二抗进行标记。随后利用光流控手机成像平台检测...

显微镜和流式细胞术是生物医学与科学研究以及临床诊断中广泛使用的技术1-12，用于对各类细胞进行计数和表征。然而，传统的显微镜和流式细胞仪相对复杂且昂贵，限制了其主要在设备完善的中心实验室中使用。最近，我们开发出一种紧凑轻便的荧光成像细胞仪与显微镜装置，并将其集成于手机上13,14，有望以较低成本将荧光显微镜、流式细胞术及相关微分析技术应用于资源有限的环境，推动影响全球健康的多种远程医疗应用。
在光流控流式细胞仪配置中（参见 例如 图1C 和 1D），一个定制设计的基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流控通道被放置在手机相机单元前方，发光二极管（LEDs）与通道的边缘直接耦合。该微流控芯片连同样品液体共同构成一个光流体平面波导（例如由PDMS-液体-PDMS组成），使得激发光能够被引导并均匀地激发微通道内荧光标记的样本。这些标记物发出的荧光信号， 例如 细胞随后通过紧接在手机相机单元后方的附加透镜进行成像，并投射至手机互补金属氧化物半导体（CMOS）图像传感器上。由于荧光发射光的收集方向垂直于激发光光路，因此仅需使用低成本的塑料吸收滤光片即可有效去除散射的激发光，从而为荧光成像提供所需的良好暗场背景。采用类似的光电微流控设计，我们还可以在静态模式下对荧光物体进行成像（参见 图1A 和 1B），其中荧光微粒被夹在两块玻璃载片之间，而非流经微流控通道，荧光微粒的发射光由手机CMOS图像传感器捕获，用于微粒计数与表征。根据不同的应用需求，可选择流式细胞术或宽场荧光显微镜技术。例如，基于手机的流式细胞仪装置在筛查大量液体样本时可能特别有用（例如 少量（几毫升）即可用于稀有细胞或病原体的检测。
本文综述了我们近期在利用紧凑且低成本的光电微流控附件，将荧光显微镜和成像流式细胞术工具集成于手机上的部分研究成果。这些基于手机的微分析、成像细胞术和传感平台可为远程医疗和即时诊断提供多种可能性，尤其有助于应对全球资源有限地区面临的重大健康挑战。

<table><tbody><tr><td>手机</td><td>Sony</td><td>Sony Ericsson Aino</td><td></td></tr><tr><td>平凸透镜</td><td>Edmund Optics</td><td># NT45-302</td><td></td></tr><tr><td>非球面透镜</td><td>Thorlab</td><td># C230TME-A</td><td></td></tr><tr><td>滤光片</td><td>Edmund Optics</td><td>#NT54-46</td><td></td></tr><tr><td>蓝色LED</td><td>Digikey</td><td>#365-1201-ND</td><td></td></tr><tr><td>电池</td><td>Digikey</td><td>#P032-ND</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯管</td><td>Fisher Scientific</td><td>#05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>红色荧光微球（10 &amp;mu;m）</td><td>Life Technologies</td><td>#F8834</td><td></td></tr><tr><td>绿色荧光微球（10 &amp;mu;m）</td><td>Life Technologies</td><td>#F8836</td><td></td></tr><tr><td>SYTO16 核酸荧光标记试剂</td><td>Life Technologies</td><td># S7578</td><td></td></tr></tbody></table>

基于手机的宽场荧光显微镜与荧光成像流式细胞术

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

荧光显微镜与流式细胞术是生物医学研究与临床诊断中广泛使用的工具。然而，这些设备通常体积较大且成本较高，限制了其在资源有限环境中的应用。为应对这些局限，我们近期已证明可通过紧凑、轻便且经济的光电微流控附件，将宽场荧光显微镜与成像流式细胞术功能集成于手机平台。在我们的流式细胞术设计中，荧光标记的细胞经由一条位于手机摄像头单元上方的微流控通道流过。由电池供电的发光二极管（LED）紧耦合至该微流控芯片侧面，芯片本身作为多模平面波导，使激发光被引导并均匀激发荧光标记的目标。手机摄像头记录荧光细胞流经微流控通道的延时影像，通过对影像的数字帧进行处理，可统计目标溶液中荧光标记细胞的数量。采用类似的光电微流控设计，我们亦可在静态模式下对这些荧光标记细胞进行成像。 例如 将荧光颗粒夹在两张载玻片之间，并利用手机摄像头捕获其荧光图像，可实现的空间分辨率为 例如 约 10 μm，覆盖约 81 mm 的大视野范围2基于手机的荧光成像流式细胞术与显微镜平台在资源有限的环境中可能特别有用，用于 例如 CD4+ T细胞计数用于监测HIV阳性患者，或用于检测饮用水中的水源性寄生虫。

采用我们的光流控泵送/激发方案（图1C 和 1D），可使用注射泵将荧光标记的细胞持续注入微流控通道，同时利用手机摄像头记录流动细胞的荧光显微延时影像。随后可使用轮廓检测与追踪算法快速分析这些荧光影像14,15 自动确定流经微流控通道的细胞的绝对数量和密度，发挥荧光成像流式细胞仪的功能。基于上述平台（图1C 和 1D）和样本制备方案，我们实现了对人血样本中白细胞总数（WBCs）的准确计数，其结果与标准血液分析仪的检测结果相当。14 或者，我们也可以在静态模式下对荧光细胞/颗粒进行成像，13 从而在无任何流体流动的情况下，实现极大的样品视场 例如 约 81 毫米2 空间分辨率为约 ~10 μm 如图所示 例如 图2 和 3光学像差的来源可以通过设计更复杂的透镜系统来减少。或者，也可以通过表征像差来源及其空间分布模式，利...

我们回顾了近期在手机上利用紧凑且低成本的光流控附件集成荧光显微镜与成像流式细胞术工具的研究成果。这些基于手机的微分析装置可能适用于细胞计数分析，例如执行多种细胞计数任务，或在资源有限的环境中对水样等样品进行高通量筛选。

荧光显微镜和流式细胞术是生物医学研究和临床诊断中广泛使用的工具。然而，这些设备通常……

本实验的总体目标是将手机摄像头改装为荧光显微成像平台或荧光成像细胞仪。首先，通过安装在手机摄像头与待测样本之间的附加镜头收集荧光发射信号。随后，附件中的一个简易塑料滤光片可滤除散射的激发光，从而为荧光成像提供暗背景，将手机摄像头转化为荧光显微镜或成像细胞仪。在最后一步中，使用手机在夜间模式下的摄像头对目标荧光颗粒进行拍照或录像。最终，可通过手机摄像头对荧光微球或细胞进行成像和表征。该技术相较于现有方法（如使用传统荧光显微镜）的主要优势在于，基于手机的显微镜具有体积小、重量轻、成本低的特点，并在即时诊断领域具有应用潜力。在缺乏常规医疗服务的资源有限环境中，要组装用于宽场荧光显微成像的光流控装置，首先将平凸透镜放入光学附件中特定的透镜安装位置。然后将塑料滤光片放置在滤光片托盘上，并将其滑入附件中。接下来，将LED托盘插入附件中。将样品玻片放入样品托盘中，然后将样品托盘滑入附件。将LED灯朝向样品夹后，将组装好的光学微流控宽场荧光显微镜附件置于手机上，使附加镜头直接接触手机摄像头镜头。现在使用附件上的开关打开LED灯，并用手机摄像头对目标样品进行成像。在夜间模式下。当需要对大量液体样本进行筛选以检测稀有事件时，可组装一种光流控流式细胞仪。首先将A球面透镜放入固定装置中。然后将塑料吸收滤光片用胶带固定在相机镜头前方，并将微流控芯片插入装置中。接着，将组装好的用于荧光成像流式细胞术的光电微流控装置夹在手机上，使附加镜头与手机相机镜头直接接触，并通过装置上的开关打开LED灯。随后，将微流控通道连接至注射泵，以恒定流速将液体样品注入微流控装置中。然后使用手机摄像头的视频模式，拍摄荧光细胞流经微流控通道的录像，以制备荧光微粒样品。首先将10 µL绿色荧光微珠与10 µL红色荧光微珠加入40 µL去离子水中混匀。使用微量移液器吸取10 µL微珠混合液滴加到载玻片上。然后使用另一张载玻片构建三明治结构。最后，将该三明治结构插入宽场荧光显微镜附件的样品托盘中，并将其推入手机附件内。为制备荧光标记的白细胞样本，首先将200 µL抗凝全血样本从EDTA采血管转移至1.5 mL聚苯乙烯离心管中。然后向200微升全血样本中加入1毫升红细胞裂解缓冲液，充分混匀，5分钟后离心裂解后的血液样本。去除上清液，将白细胞沉淀重悬于200微升PBS中，轻柔混匀细胞，再次离心。再次去除上清液，并用PBS重悬。接下来，向白细胞中加入5 µL的1 mM细胞色素16溶液，并用铝箔包裹样本，孵育30分钟。然后将样本离心后，再次用更多PBS重悬标记的白细胞沉淀，并将5至10 µL细胞样本转移至盖玻片上。在样本上方放置第二张盖玻片，随后将夹心结构的盖玻片插入样品托中。使用手机荧光显微镜附件对样品进行成像。或者，可通过便携式电池供电的自动注射泵将标记细胞持续注入微流控通道。随后，使用手机摄像头的视频模式记录流动细胞的荧光显微影像。可以在静态模式下对荧光细胞或颗粒进行成像，即在无流体流动的条件下，实现约10微米空间分辨率的大视野样本观察。例如，在本图中对绿色和红色荧光微球进行了成像。在中心视野边缘区域，约81平方毫米的视场范围内仍可获得良好的图像质量。然而，此处存在畸变区域，显示的是荧光标记白细胞的手机成像结果。该插图展示了从主图像中裁剪出的荧光标记白细胞的手机图像经数字放大后的效果。在此插图中，展示了对第一个插图进行压缩解码的结果，解码后的图像清晰度与使用传统荧光显微镜在相同视野下以10倍物镜观察的同一细胞样本相当。在观看本视频之前，您应充分了解如何将手机改装成法医显微镜或成像细胞仪，从而实现对法医微珠或细胞的成像表征与内容分析。

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生物分子研究 体内 对于理解生物体系中分子功能至关重要。本文描述了一种新方法，可实现荧光生物分子（如 DNA 或蛋白质）向活体微生物内部的导入。对 体内...

通过电穿孔法将荧光生物分子导入活体微生物并进行观察

本方案描述了一种用于超快微流控流动中单细胞成像的非对称检测时间拉伸光学显微系统，及其在成像流式细胞术中的应用。...

基于非对称检测时间拉伸光学显微术（ATOM）的微流控成像流式细胞仪

了解细菌中必需过程的功能具有挑战性。利用靶向特异性染料进行荧光显微镜观察，可为微生物细胞生长和细胞周期进程提供关键见解。本文以Agrobacterium...

活细胞荧光显微镜观察微生物细胞生长过程中的关键过程

本文介绍了一种从三维空间中分布的每一个活细胞中光学提取并编目其固有细胞荧光特征（即细胞自发荧光）的实验方案。该方法适用于在单细胞分辨率下研究多种生物系统的固有荧光特征，包括来自细菌、真菌、酵母、植物和动物的细胞。...

通过共聚焦显微镜重建单细胞固有荧光特征

本文介绍了多种多细胞球体的形成方法，用于后续的多参数活细胞显微成像。通过荧光寿命成像显微技术（FLIM）、细胞自发荧光、染色染料和纳米颗粒，展示了对活体三维（3D）肿瘤细胞和干细胞来源的球体中细胞代谢、缺氧状态及细胞死亡进行分析的方法。...

多细胞球体的制备及多参数活细胞荧光寿命成像显微镜（FLIM）分析

学习将手机相机转换为宽视场荧光显微镜和荧光成像流式细胞仪的方法，利用紧凑型光流附件实现荧光成像。该技术可在资源有限环境中进行细胞分析和高通量筛选，为即时诊断提供轻便经济的解决方案。

基于手机的宽场荧光显微镜与荧光成像流式细胞术

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