Name: 腺病毒转导朴素的CD4 T细胞调节性T细胞分化研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 33 s
Description: 了解利用腺病毒转导技术在初始CD4 T细胞中实现基因异位表达的方法，用于研究调节性T细胞分化的早期分子事件。该技术可在不影响细胞活力或分化潜能的前提下，实现高效、瞬时的基因过表达。

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作者感谢 Lirui Du 构建 pCAGAdDU 载体，以及 Oliver Gorka 提供固定方案。

1. 将目的基因克隆至入门载体
<ol>
	<li>将目的基因克隆至入门载体中。通过PCR扩增目的基因，随后进行平末端连接至拓扑异构酶偶联载体例如 pENTR/D-TOPO）或限制性酶切介导的克隆可用于此实验步骤。</li>
</ol>
2. 将目的基因转入 pCAGAdDu 靶向载体
<ol>
	<li>通过LR重组反应将目的基因从入门载体转移至目的载体（例如 Gateway LR Clonase II 酶混合物）。这将构建出腺病毒表达载体 （图1）.</li>
	<li>线性化10 μg的腺病毒表达载体 PacI 限制性酶切后，将DNA沉淀并重悬于水中，浓度为每100 μl含3 μg DNA。线性化可释放病毒的反向末端重复序列（ITR），该序列是病毒DNA复制及包装至病毒颗粒所必需的。</li>
</ol>
3. 初始病毒裂解物的制备
<ol>
	<li>在6孔板的一个孔中接种1 × 105个HEK293A细胞，加入2 ml细胞培养基（DMEM，10% FBS，5% PenStrep），于37 °C、10% CO2培养箱中培养6 – 14小时，使细胞贴壁。此时细胞融合度应约为50%。</li>
	<li>脂质体转染：将6 μl jetPEI试剂加入94 μl 50 μM NaCl中，短暂涡旋。在涡旋过程中将混合液加入100 μl线性化的腺病毒载体中，室温孵育转染混合物15 – 30分钟。</li>
</ol>
在进行以下所有步骤时，必须遵守针对腺病毒感染的适当生物安全条件！
<ol start="3">
	<li>将溶液逐滴加入含有 HEK293A 细胞的孔中，在 37 °C 和 10% CO2 条件下培养细胞。若使用荧光标记物，可在转染后 12 - 36 小时用倒置荧光显微镜直观评估转染效率。每 3 天添加 0.5 ml 新鲜培养基。</li>
	<li>每 2 - 3 天使用光学显微镜或荧光显微镜检查细胞病变效应（CPE），表现为细胞变大、变圆并开始脱落的区域，这表明病毒已高效生成。当出现较大范围的 CPE 区域时 （图 3），通常需 24 - 72 小时即可完成全部细胞的感染。</li>
	<li>当所有细胞均出现 CPE 现象，但尚未发生大面积细胞脱落时，通过轻柔吹打使细胞脱落，并将细胞连同上清液（SN，3 - 5 ml）转移至 15 ml 聚苯乙烯管中。</li>
	<li>将含有上清液的细胞置于干冰上冷冻 15 - 20 分钟，随后在 37 °C 快速解冻，以裂解细胞。重复此冻融循环（F/TC）两次。制备好的原始病毒裂解液可置于冰上并在一天内使用，或于 -80 °C 冷冻长期保存。额外的冻融循环将使病毒滴度降低 30 - 50%。</li>
</ol>
4. 病毒扩增
<ol>
	<li>在14 cm的组织培养皿中将HEK293A细胞接种并培养至90%汇合度。</li>
	<li>用一半的初代病毒裂解液（1.5–2.5 ml）感染细胞，并将细胞孵育至少36小时。此时几乎所有细胞均应被感染，可通过荧光显微镜观察确认。对于已扩增病毒的再扩增（即 更高浓度的病毒原液，以感染复数（MOI）为50的条件感染HEK293A细胞（参见6.3）。</li>
	<li>细胞应在全部出现细胞病变效应（CPE）但尚未脱落时进行收获。在病毒高效产生的情况下，感染后48小时内即可达到此状态。（如果耗时长达一周，可考虑通过增加4.2步骤中用于感染的腺病毒原液用量，进行一轮扩增。）</li>
	<li>通过轻柔吹打使细胞脱离，并将细胞和上清液转移至50 ml聚苯乙烯管中。在4 °C下以300 x g离心10 min，沉淀细胞。</li>
	<li>去除上清液，并将沉淀重悬于适量培养基或上清液中约 1 ml。</li>
	<li>进行3次冻融循环以裂解细胞，于4 °C、800 x g离心15分钟。收集含有病毒颗粒的上清液（SN）即 将病毒裂解液分装后于 -80 °C 保存。</li>
</ol>
5. 病毒滴度测定
<ol>
	<li>在12孔板的每个孔中加入1 ml培养基，接种5个孔，每孔105个A549细胞，静置培养6小时使细胞贴壁。</li>
	<li>取1 μl浓缩的腺病毒（冰上解冻），用培养基进行系列稀释（1:5,000、1:10,000、1:50,000、1:100,000），每孔加入10 μl。留一个孔不感染，用于流式细胞术分析时调整设门。</li>
	<li>36小时后，吸除上清液，用PBS洗涤，并消化细胞（例如使用胰酶消化法）。出于生物安全考虑，建议将细胞在含100 μl 4%多聚甲醛的PBS中室温固定10分钟，再用PBS洗涤一次。</li>
	<li>进行FACS分析以检测感染标志物的表达。以“加入的病毒裂解液体积（μl）”为横坐标，以感染细胞的绝对数量为纵坐标作图 （图4）。确定感染的线性范围，并利用线性范围内的标准曲线，代入x = 1,000 μl计算未稀释病毒每毫升的滴度。</li>
</ol>
6. T细胞感染
<ol>
	<li>从 DO11.10 tg; CARΔ1 tg 小鼠中使用 MACS（Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II）或 FACS 分选（CD4+ CD25- CD62L+ CD44-）分离初始/静息 CD4 T 细胞。</li>
	<li>对于小规模实验，用移液器将适量体积的病毒裂解液加入96孔圆底板的一个孔中，以达到50的感染复数（MOI）。</li>
	<li>最多加入 4 x 105 50 μl T细胞培养基（RPMI1640，10% FBS，5% 青霉素-链霉素，5% 丙酮酸钠，1× NEAA，1× MEM必需维生素，1× L-谷氨酰胺，1:250,000 巯基乙醇，10 mM HEPES）中的T细胞终感染体积。 
	示例： 
	应使用感染复数（MOI）为50来感染3 x 105 T细胞； 病毒滴度为 3 x 109 毫升-1 
	病毒体积 = MOI × T细胞数量 / 病毒滴度 = 50 × (3 × 105) / (3 × 109 毫升-1) = 0.005 ml</li>
</ol>
注意：对于较大数量细胞的感染，使用感染复数（MOI）为50，在聚苯乙烯管（管盖松开）中按每106个初始T细胞165 μl的感染体积进行放大（每管最多3 ml）。
<ol start="4">
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育90分钟。</li>
	<li>在室温下以300 × g离心5分钟，弃上清液，加入200 μl PBS重悬细胞。再次离心并弃去上清液。</li>
</ol>
（可选：可再次洗涤细胞，以更高效地去除病毒）
<ol start="6">
	<li>将细胞重悬于 200 μl T 细胞培养基中（不含刺激性抗体以及 IL-2 或其他细胞因子），在 37 °C、5% CO2 培养箱中静置培养 40 小时，以在激活前允许目的基因表达。</li>
</ol>
7. T细胞活化与极化
<ol>
	<li>移液加入与细胞数量等量的抗CD3和抗CD28偶联磁珠例如 4 x 105) 转移至小型试剂杯中，加入10倍体积的PBS，置于磁架上2分钟。移除上清液，将磁珠重悬于200 μl 极化培养基中（Treg细胞：T细胞培养基 + 1 ng/ml TGFβ、100 U/ml IL-2）。</li>
 </ol>
	注意： 也可使用包被抗CD28和抗CD3抗体的组织培养皿激活细胞，或采用经辐射处理的、负载卵清蛋白323-339肽抗原的BALB/c脾细胞，以DO11.10 T细胞受体特异性方式激活细胞。
 <ol start="2">
	<li>将静置后的细胞按前述方法离心，弃去上清液，并将细胞重悬于 200 μl 含抗 CD3 和抗 CD28 抗体偶联磁珠的极化培养基中。于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 72 小时，期间不更换培养基。</li>
</ol>
8. T细胞固定与染色用于流式细胞术
<ol>
	<li>洗涤细胞：在室温下以 300 × g 离心 5 分钟，弃上清液，加入 200 μl PBS 重悬细胞。再次离心并弃上清液。后续所有洗涤步骤均依此操作。</li>
	<li>将细胞重悬于 100 μl 可固定活死细胞染色液中，于 4 °C 孵育 30 分钟。</li>
	<li>洗涤细胞，加入 100 μl PBS 重悬，再加入 100 μl PBS 中的 4% 多聚甲醛，于室温孵育 15 分钟。</li>
	<li>洗涤细胞，将其重悬于 200 μl 冰冷的含 70% 甲醇的 PBS 中，于冰上孵育 30 分钟。</li>
</ol>
注意：此后可无需采取生物危害防护措施处理细胞！
<ol start="5">	
 <li>配制60 μl的主混合液，包含60 μl PBS + 10 μg/ml Fc阻断剂（抗FCR3，用于阻断非特异性结合）。洗涤细胞，将细胞重悬于40 μl PBS + 抗FCR3中，在室温下孵育15分钟。</li>
	<li>加入20 μl PBS + 抗FCR3，其中含有1 μg PE标记的抗Foxp3抗体，充分混匀后于4 °C过夜孵育。</li>
	<li>用PBS洗涤细胞两次，然后在流式细胞仪上分析细胞。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

病毒的制备与滴定
为了获得最佳的转染效果，线性化载体的质量和用量似乎最为重要。我们发现，初始培养物的过度生长对初级裂解液的制备没有负面影响，因为一旦病毒高效产生，感染过程将迅速进行。然而，插入片段过长可能会影响HEK293A细胞的病毒产量，从而降低效率。实际上，某些开放阅读框被发现会干扰病毒的产生。这些病毒储备液通常可通过多轮扩增得以挽救，仅有少数开放阅读框被发现与病毒产生不兼容。根据我们的经验，在病毒扩增感染后48小时内出现细胞病变效应（CPE），通常可获得约1 × 109 - 5 × 1010 个感染性颗粒/mL的病毒裂解液。
初始T细胞的腺病毒感染
腺病毒感染初始T细胞不会改变T细胞在刺激前后活化状态，这使得该转导系统成为研究T细胞从初始TCR刺激开始分化的有力实验工具。我们已确定，在感染后T细胞静息40小时时，目标基因可实现高效异位表达，此时细胞仍处于初始状态，且无活化迹象。这意味着在后续T细胞活化过程中，目标基因已在早期过表达，能...

调节性T细胞（Tregs）对于维持免疫耐受以及抑制过度的免疫反应至关重要。Tregs能够抑制旁观者T细胞的活化。因此，若清除Tregs将导致由活化的T细胞驱动的致命性自身免疫和自我组织破坏1。Tregs在胸腺中CD4单阳性前体细胞经历阴性选择时发育形成，但也可在外周由初始CD4 T细胞在低剂量抗原刺激及次优共刺激条件下分化而来1,2。胸腺来源的Tregs似乎主要抑制针对自身抗原的组织自身免疫反应，而外周诱导的Tregs则被认为在肠道或肺部耐受的建立中发挥重要作用。这些诱导产生的Tregs能有效防止T细胞在黏膜部位识别外来抗原后发生活化，这些外来抗原包括食物和空气中的环境抗原、共生细菌以及过敏原3,4。此外，Tregs在母体对胎儿肽段产生免疫耐受5以及预防移植物抗宿主病6过程中也具有关键作用。然而，Tregs同时也会产生不利影响，例如通过削弱对肿瘤细胞的免疫监视功能而促进肿瘤免疫逃逸7,8。Tregs的标志性特征是表达决定其亚群特性的转录因子Foxp3，这是一种含有叉头结构域的转录因子，对赋予Tregs功能具有必要性和充分性9,10。目前已有部分可诱导Foxp3表达的信号通路被揭示，但T细胞受体激活后调控Treg分化的分子机制仍尚不明确。
Tregs 可被非常有效地诱导 体外 通过在TGFβ和IL-2存在下，使用抗CD3和抗CD28抗体刺激初始CD4 T细胞 11. 由于新产生的调节性T细胞具有功能 体内，调控促进Treg分化的分子在未来的治疗中具有巨大潜力，例如用于哮喘、克罗恩病和器官移植的治疗 11,12相反，通过调节分子以阻断调节性T细胞（Treg）分化的治疗策略，可能为未来联合治疗肿瘤患者的方法提供益处。
体外 分化实验对于描述与T细胞亚群分化相关的分子变化具有重要作用。目前，由于最常用的异位基因表达方法在初始T细胞中均无法有效实施，导致研究人员在探索或筛选调控T细胞分化的基因产物时面临困难。例如，电穿孔和逆转录病毒转导仅在活化的T细胞中有效。与最初的预期相反，通常在静息细胞中有效的慢病毒转导也需通过细胞因子预先活化初始T细胞才能实现13此外，电穿孔过程中cDNA或mRNA的转移涉及细胞膜去极化，这一过程本身可赋予T细胞活化的特征，甚至可能引发Ca²⁺动员2+ 信号转导 并激活NFAT蛋白（未发表观察结果及参考文献） 14同样，在逆转录病毒转导过程中，初始T细胞需要被激活18–40小时。在此期间，细胞分裂过程中核膜发生解体，从而允许逆转录病毒载体随后整合到基因组中。 15因此，这些方法无法研究初始T细胞与抗原相遇时的早期分子调控过程，而该过程正是辅助性T细胞分化的决定性阶段。
腺病毒转导已知可在表达人柯萨奇腺病毒受体（CAR）的多种人类细胞类型中实现外源基因的瞬时表达。该过程无需细胞活化或细胞周期进展。CAR的表面表达对于病毒的有效附着和内化至关重要，而在T细胞特异性启动子驱动下转基因表达截短形式CARΔ1，可使小鼠胸腺细胞和T细胞对腺病毒感染具有易感性。 16重要的是，该转基因并不改变胸腺细胞的发育或 体外 初始CD4 T细胞向不同亚群的分化（数据未显示；参考文献 17）。先前已采用腺病毒介导的转导方法实现T细胞的过表达 17,18 和基因敲低方法 19,20转基因T细胞可从商业可得的DO11.10 tg; CARΔ1 tg小鼠（Taconic, Inc. 及参考文献）中纯化 17）。重要的是，腺病毒转导可在不诱导明显活化迹象的情况下，实现目的基因在初始T细胞中的高表达。T细胞保持初始状态（CD44低CD62L高）和静息状态（CD25-CD69-感染后仍可被激活并分化为调节性T细胞（Treg），其功能类似于未感染细胞。
 
在将腺病毒质粒转染至HEK293A细胞后，可实现重组腺病毒的制备（图1）。这些质粒通常包含人5型腺病毒基因组，其E1和E3基因已被删除，从而使产生的重组腺病毒不具备复制能力21。HEK293A细胞可弥补这种复制缺陷，因为该细胞系通过稳定整合剪切后的腺病毒基因组而获得永生化特性22。由于腺病毒载体较大（约40 kb），不适合采用传统的限制性内切酶介导的克隆方法，因此我们采用了Gateway系统。目的基因首先被克隆至一个较小的入门载体中，随后可通过λ噬菌体介导的重组反应（LR反应）将其高效转移至腺病毒目的载体中23。我们构建了pCAGAdDu载体，该载体将CAG启动子（鸡β-肌动蛋白启动子与CMV增强子）与一个表达盒相结合，该表达盒包含两侧带有LR位点的原核ccdB筛选标记24。该表达盒与内部核糖体进入位点（IRES）元件相融合，从而可共表达真核感染标记物——增强型绿色荧光蛋白（eGFP），而eGFP又连接了一段包含牛生长激素多聚腺苷酸信号（poly(A)信号）的序列。我们选用CAG顺式调控序列，是因为经典的CMV启动子被发现具有高度激活依赖性，因而不适用于初始T细胞中的基因表达。
在此，我们提供了一种高效的实验方案 体外 Treg 分化及在不激活条件下转导初始 CD4 T 细胞的方法 （图2）该方法可在初始状态的CD4 T细胞分化之前实现外源基因的表达或基因敲低，从而能够在初始TCR刺激后至T细胞亚群定向分化的早期信号事件中，检测目的基因过表达所产生的效应。我们的验证实验还为建立类似的腺病毒应用体系提供了基础，可用于其他T细胞亚群（如Th1、Th2、Th9、Th17、Th22或Tfh细胞）分化过程中的功能研究。

<table><tbody><tr><td>pENTR/D-TOPO 克隆试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>K240020</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II 酶混合物</td><td>Invitrogen</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R057S</td><td></td></tr><tr><td>jetPEI</td><td>Polyplus-transfection</td><td>101-10N</td><td></td></tr><tr><td>HEK293A 细胞系</td><td>Invitrogen</td><td>R705-07</td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>14 cm 组织培养皿</td><td>Nunc</td><td>168381</td><td></td></tr><tr><td>BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CAR&amp;Delta;1)1Jdgr</td><td>Taconic Farms</td><td>Model Nr. 4285</td><td></td></tr><tr><td>初始型 CD4+ T 细胞分离试剂盒 II</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41966-052</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAN Biotech</td><td>1502-P110704</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（PenStrep）</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠（NaPyruvate）</td><td>Lonza</td><td>BE13-115E</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸（NEAA 100x）</td><td>Lonza</td><td>BE13-114E</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液（1 M）</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>MEM 必需维生素混合物（100x）</td><td>Lonza</td><td>13-607C</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads 小鼠 T 细胞激活剂 CD3/CD28（用于细胞扩增与激活）</td><td>Invitrogen</td><td>114-56D</td><td></td></tr><tr><td>重组人 TGF-β1</td><td>R&amp;D Systems</td><td>240B</td><td></td></tr><tr><td>Proleukin S（18 × 10⁶ IE）</td><td>Novartis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 可固定蓝色死细胞染色试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>L-23105</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 BD Fc 封闭剂</td><td>BD Pharmingen</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠/大鼠 Foxp3 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5773-82</td><td></td></tr><tr><td>Mmu-miR-155 TaqMan microRNA 检测试剂</td><td>Roche Applied Biosystems</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 探针 Master 混合液</td><td>Roche Applied Biosystems</td><td>04902343001</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan microRNA 反转录试剂盒</td><td>Roche Applied Biosystems</td><td>4366596</td><td></td></tr></tbody></table>

腺病毒转导初始cd4 t细胞以研究调节性t细胞分化

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

调节性T细胞（Tregs）对于维持对自身抗原以及某些外来抗原的免疫耐受至关重要。Tregs可由初始型CD4 T细胞诱导产生 体外 在TGFβ和IL-2存在下通过TCR和共刺激诱导。这一过程对未来治疗具有巨大潜力，然而调控分化的分子及信号通路在很大程度上仍不清楚。
初始T细胞可通过外源基因表达进行操控，但常规方法无法有效靶向T细胞在初次接触抗原前最重要的初始状态。本文提供了一种在初始CD4 T细胞中表达外源基因的实验方案 体外 在诱导Treg分化之前，采用复制缺陷型腺病毒进行转导，并阐述该腺病毒的构建与生产方法。腺病毒可容纳较大的插入片段（最多可达7 kb），并可携带启动子以实现T细胞中高水平且瞬时的过表达。若T细胞表达转基因的柯萨奇腺病毒受体（Coxsackie adenovirus receptor, CAR），则该病毒可高效转导初始小鼠T细胞。重要的是，感染后T细胞仍保持初始状态（CD44低表达）低CD62L高）和静息状态（CD25-CD69-）并可被激活和分化为调节性T细胞（Tregs），其分化行为与未感染细胞相似。因此，该方法能够从最初阶段即对CD4+ T细胞的分化进行操控，确保在初始TCR刺激所引发的早期信号事件导致细胞发生最终导向Treg分化的改变时，外源基因的表达早已建立。

病毒制备
为了获得高滴度的病毒，HEK293A细胞在初级病毒生产或病毒扩增过程中的收获时间至关重要。图3展示了具有病毒产生典型视觉特征的代表性荧光图像和相差显微镜图像。在将无插入片段的对照质粒pCAGAdDu转染至HEK293A细胞后10天可观察到细胞病变效应（CPE）。CPE的特征表现为出现细胞变大、变圆并开始脱落的区域，同时感染标志物GFP表达水平较高。CPE的程度反映了病毒生成的效率。表现出类似CPE的细胞培养板可在24至72小时内进行收获，并通过反复冻融循环制备粗制病毒裂解液。随后可通过病毒裂解液的系列稀释测定病毒滴度，以便使用相同的感染复数（MOI）进行感染实验的比较（图4）。在呈线性关系的范围内，可利用回归分析方程计算每毫升未稀释病毒裂解液中的感染性病毒颗粒数量。在本示例中，当x = 1 μl时，滴度为30,016,535 μl-1 ≈ 3 × 1010 ml-1。
评估腺病毒感染对T细胞活化与...

利用表达柯萨奇腺病毒受体的转基因技术，通过腺病毒介导的基因转移将外源基因导入初始CD4 T细胞，可实现对调节性T细胞分化的分子机制分析 体外.

腺病毒转导初始CD4 T细胞以研究调节性T细胞分化

调节性T细胞（Tregs）对于维持对自身抗原以及某些外来抗原的免疫耐受至关重要。Tregs可由初始型CD4...

本方案提供了一种用于生产感染性腺病毒颗粒的工作流程，这些腺病毒颗粒可用于将目的基因转导至初始T细胞中，使其在异位表达该转基因后分化为调节性T细胞（tregs）。首先将目的基因克隆至腺病毒载体中，随后将该载体转入腺病毒生产细胞系HC 293 A，从而产生具有感染性的腺病毒颗粒。将获得的病毒用于感染携带腺病毒受体转基因的小鼠的初始T细胞。感染后，细胞进行静置培养以确保目的基因的表达。在初始T细胞中，通过极化条件激活T细胞以诱导调节性T细胞（Treg）的分化。然后对细胞进行固定并染色，用于流式细胞术分析。最终可获得结果显示调节性T细胞（Treg）分化标志物FoxP3和感染标志物GFP的表达情况，这些表达可能受到目的基因过表达的影响。该技术相较于现有的逆转录病毒基因转导等方法的主要优势在于，能够在初始T细胞中实现目的基因的过表达。这会导致在T细胞激活时出现高水平的过表达。该方法有助于回答调节性T细胞领域中的关键问题，例如，关于建立T-Rex细胞身份的转录后基因调控机制。首先将目的基因克隆至入门载体中。通过 PCR 扩增获得的目的基因为平末端，连接至与拓扑异构酶偶联的 P enter D topo 载体中。随后通过 LR 重组反应将目的基因转移至 P kakadu 毕载体中。其中包含腺病毒基因和一个内部核糖体进入位点（IRES），随后连接绿色荧光蛋白（GFP）的开放阅读框，以构建带有感染标记的腺病毒表达载体。接下来，将10 µg腺病毒表达载体进行线性化。在PAC I限制性消化后，对DNA进行沉淀，并重悬于水中，浓度为每100 µL含3 µg。线性化可释放病毒的反向重复序列（ITR），这些序列是病毒DNA复制及其包装进病毒颗粒所必需的。以下所有步骤均应在适用于腺病毒感染的相应生物安全条件下进行。为准备用于共转染的线性化载体，将六微升 jet PEI 试剂加入94微升50微摩尔氯化钠溶液中，涡旋混匀。简而言之，在涡旋混匀的同时，将混合溶液加入100 µL线性化的腺病毒载体中。将该转染混合物在室温下孵育15至30分钟。接下来，从培养箱中取出在六孔板上生长至50%融合度的HEK 293A细胞。将溶液逐滴加入含有HEC 293A细胞的孔板中，在37摄氏度和10%二氧化碳条件下培养。每三天添加0.5毫升新鲜培养基，并以GFP表达作为感染标志。每隔两到三天，使用倒置荧光显微镜观察转染效率，并检查细胞病变效应，其特征为细胞变大、变圆并开始脱落的区域。这表明病毒生成效率较高。一旦出现更大范围的细胞病变效应区域，所有细胞将在24至72小时内被感染。当所有细胞均表现出细胞病变效应，但在细胞整体脱落之前，通过轻柔吹打收集细胞，并将其连同上清液转移至15毫升聚苯乙烯管中。接下来，将细胞悬液在干冰上冷冻15至20分钟以裂解细胞，然后在37摄氏度下快速解冻。重复此冻融循环过程两次。此时的裂解细胞悬液称为原始病毒裂解液。所有病毒裂解液均需置于冰上保存。若需长期储存，则应在使用后一天内将其于负80摄氏度冷冻。请注意，任何额外的冻融循环将使病毒滴度降低30%至50%。为扩增原始病毒裂解液，取半量原始病毒裂解液感染已生长至90%汇合度的15个组织培养皿中的HC 293 A细胞，并孵育至少36小时。感染36小时后，通过荧光显微镜检查感染情况，几乎所有细胞都应被感染。当所有细胞均表现出细胞病变效应但尚未脱落时，轻柔吹打收集细胞，此时病毒产量较高。感染后48小时内可达到此状态，将细胞及上清液转移至50毫升聚苯乙烯管中。在4°C条件下，以300 × g离心10分钟沉淀细胞。离心后，弃去上清液，并将沉淀重悬于适量培养基中。1毫升培养基中的病毒滴度应达到每毫升10的10次方。进行三次冻融循环以破碎细胞，方法同前。然后在4°C条件下以900 G离心20分钟。离心后，小心转移上清液，此上清液现称为浓缩病毒裂解物，将其转移至冻存管中。将样品分装用于多次感染，并在负80摄氏度保存。最后，通过Fax分析549细胞中感染标志物的表达来测定病毒滴度。根据随附文件中的说明，本实验方案的这一部分使用从小规模实验中分离的D1110转基因car delta1转基因小鼠的未经刺激的CD4+ T细胞进行。向96孔圆底板的一个孔中加入适量的病毒裂解液，以达到MOI为50的感染复数。在最终体积为50 µL的T细胞中加入最多4 × 10⁵个T细胞进行感染。中等培养基。此设置可实现平行实验操作。将细胞置于含5%二氧化碳的培养箱中，在37摄氏度下孵育90分钟。孵育结束后，在室温下以300 G离心5分钟，离心后弃上清，将细胞重悬于200 µL PBS中，再次离心并去除上清。将细胞重悬于200 µL不含刺激性抗体、不含IL-2或其他细胞因子的T细胞培养基中。然后将细胞置于37°C、5%二氧化碳培养箱中静置40小时，以在激活前允许目的基因表达。随后，用移液器将包被有抗CD3和抗CD28的磁珠加入一个小试剂杯中，磁珠数量应与细胞数量相等，再加入10倍体积的PBS，置于磁铁上2分钟。接下来，弃去上清液并重悬。将磁珠悬浮于200微升极化培养基中，将静置后的细胞在室温下以300 G离心5分钟，离心后弃去上清液，并将细胞重悬于200微升含有抗体偶联磁珠的极化培养基中，在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育72小时，期间不更换培养基。染色与固定的操作流程简述如下。首先，用 PBS 清洗细胞，并与可固定的死细胞染色溶液孵育。再次洗涤后，用甲醛固定细胞，固定后可无需腺病毒生物安全防护措施进行后续处理。再次洗涤细胞后，用甲醇进行透化。经过另一次洗涤步骤后，将细胞与抗 FcR 三抗体孵育以阻断非特异性结合。最后，将细胞与抗 FCR 三抗体以及 PE 标记的抗 fox P 三抗体共同孵育。由于固定和染色过程中多次洗涤步骤的存在，存在大量细胞丢失的风险，为避免损失，请在离心后立即小心吸走上清液，注意不要用移液器尖头扰动细胞沉淀。细胞染色完成后，用 PBS 洗涤两次，并通过流式细胞仪进行分析。使用流式细胞仪上的96孔板读板器，可在同一块96孔板中完成T细胞感染、分化、固定和染色，从而为多种条件的平行分析提供高效的实验流程；但也可在标准流式管中进行分析，以评估腺病毒感染对T细胞活力及调节性T细胞（Treg）分化的影响。从DO 1110转基因car delta one转基因小鼠中分离的初始T细胞，用对照腺病毒以不同感染复数（MOI）进行感染，并在Treg极化条件下激活。经固定和染色后，通过流式细胞术检测细胞中感染标志物的表达水平。死细胞染料和分化标志物的GFP整合，如图所示。将MOI从1增加到50，会导致感染细胞的比例升高。尽管细胞活力和Treg分化均未受到影响，但仍需确定腺病毒感染是否影响T细胞的活化状态。通过流式细胞术分析感染与未感染细胞的活化及静息标志物的表达情况，如图所示。当细胞在Treg极化条件下被激活后，感染与未感染细胞中这些标志物的表达无明显差异。激活标志物的上调以及初始T细胞标志物的下调在合并的感染细胞与非感染细胞中表现非常相似。这些数据表明，初始状态的T细胞感染并不影响其后续的T细胞活化。为检测所述腺病毒转导方案所达到的过表达水平，初始T细胞以50的感染复数（MOI）感染编码microRNA-155的腺病毒或对照腺病毒，细胞分别静置40小时、活化40小时，或先静置40小时后再活化40小时。提取cDNA，并相对于snRNA U6（snow RNA 202）测定microRNA-155的表达水平。通过定量PCR检测，经40小时静息的初始T细胞中miR-155的过表达水平与内源性miR-155表达水平相当。在T细胞激活40小时后，这些细胞的激活仍可诱导依赖激活的miR-155上调。这表明在初始T细胞中，腺病毒介导的过表达水平很高，超过了内源性激活所诱导的微小RNA表达。一旦掌握该技术，病毒克隆、病毒制备及T细胞感染的整个流程可在四周内完成。所获得的病毒可长期保存，或在三天内重新扩增。进行该实验操作时，重要的是需牢记使用空载体严格设置对照实验，并首先明确腺病毒感染本身对所研究过程的影响。请注意，腺病毒感染及过表达是瞬时的，持续时间仅为大约五至七天。

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科研

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