Name: 纵向，非侵入性的移植到眼睛的前房单细胞分辨率的实时成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: 了解小鼠眼前房胰岛移植技术，利用共聚焦显微镜实现单细胞分辨率的纵向非侵入性实时成像。该方法可长期监测移植物存活与整合，为糖尿病治疗研究提供新工具。

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我们感谢 Camillo Ricordi 博士、Antonello Pileggi 博士、R. Damaris Molano 博士、Stephan Speier 博士和 Daniel Nyqvist 博士富有成效的讨论。同时感谢 Eleut Hernandez 和 Diego Espinosa-Heidmann 提供的技术支持，以及 Mike Valdes 和 Margaret Formoso 在视频录制方面的帮助。Byron Maldonado 负责视频的录制、编辑和最终制作。本研究得到了糖尿病研究所基金会（<a href="http://www.DiabetesResearch.org" target="_blank">www.DiabetesResearch.org</a>）的支持，以及美国国立卫生研究院/国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所/国家过敏与传染病研究所（NIH/NIDDK/NIAID）的资助（M.H.A. 获 F32DK083226；A.C. 获 NIH RO3DK075487；P-O.B. 获 U01DK089538）。P-O.B. 还获得了来自卡罗林斯卡学院、瑞典研究理事会、瑞典糖尿病基金会、Erling-Persson 家庭基金会、Knut 和 Alice Wallenberg 家庭基金会、Skandia 保险公司有限公司、VIBRANT（FP7-228933-2）、卡罗林斯卡学院糖尿病战略研究计划、诺和诺德基金会以及 Berth von Kantzow 基金会的额外研究资助。

以下操作在体视显微镜下分两步进行：第一步是将胰岛加载至套管中，第二步是将其实际移植到肾包膜下腔隙（ACE）。所有动物实验均经迈阿密大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
1. 将胰岛装载入导管以进行移植
<ol>
 <li>通过以逐渐缩小的圆周旋转培养皿，将胰岛居中。</li>
 <li>将套管从“储液器”上断开，并将套管及连接管路放置于清洁表面。储液器可使用无滤芯的300 μl一次性塑料移液枪头制作（图1a）。</li>
 <li>推动脚踏开关，驱动免手持电动注射泵向前推进，排出储液器中的气泡，以确保在吸取胰岛时能形成连续的流体。此操作同时可在注射器内留出空间，以便将胰岛吸入已预装无菌溶液（如生理盐水、PBS或培养基）的储液器中（图1b, c）。</li>
 <li>使用脚踏开关驱动电动注射泵向后回抽，轻柔地将所需数量的胰岛吸入储液器。胰岛进入储液器时会呈旋涡状，并聚集在底部。</li>
 <li>通过连接管路将套管重新连接至储液器。</li>
 <li>将套管尖端放回培养皿中，推动胰岛从储液器经管路进入套管。在回填管路/套管时，轻轻“弹击”（轻敲）管路，确保胰岛保持聚集状态（图1d）。可在所有位于胰岛前方的气泡被完全排出套管之前或之后停止操作。若不确定，建议在胰岛刚进入套管后端时即停止，保留部分前方气泡有助于防止胰岛从ACE装置中反流（回流）。残留气泡将在过夜期间消散。</li>
 <li>至此，您已准备好将胰岛注入ACE装置（请参见后续步骤）。</li>
</ol>
2. 胰岛移植至眼前房
<ol>
 <li>将麻醉后的小鼠置于体视显微镜下的保温垫上。</li>
 <li>将小鼠的鼻部放入连接氧气/异氟烷麻醉机的麻醉“面罩”中。该面罩由一个1 ml的一次性塑料移液器吸头（无滤芯）制成，并通过其狭窄端连接麻醉管路（图2a,b）。</li>
 <li>用非持器手的拇指和食指轻轻拉开待移植眼的眼睑，将眼球轻柔“挤出”，以获得更好的暴露和操作空间（图2c）。此操作需要一定练习，以避免因颈部受压过度而影响小鼠呼吸，或阻碍头部血液回流。</li>
 <li>使用一次性胰岛素注射器（29–31G）作为手术刀，仅将针尖小心刺入角膜，做单一侧向切口。切口位置应位于角膜顶点与角膜缘之间的中点，以最大限度减少胰岛在注射过程中从眼前房（ACE）反流（图2d）。</li>
 <li>将预装胰岛的套管经切口小心插入。</li>
 <li>缓慢将胰岛从套管中推出，并沉积于虹膜表面。为避免因眼前房（ACE）内压力升高导致胰岛反流，应在切口对侧象限以尽可能小的体积进行短暂、间歇性推注。通过在装载套管时将胰岛在管路中压紧，可进一步确保此效果（详见步骤1.6）。</li>
 <li>缓慢将套管从眼前房（ACE）中撤出。此步骤尤为关键，特别是当注射胰岛体积较大时，眼前房内压力积聚可能导致胰岛反流不可避免。为消除或最小化反流，可在套管仍位于眼前房内时轻轻旋转套管，使多余压力经套管周围的切口释放。在撤出套管时应观察是否有反流迹象，必要时需等待压力下降后再完全撤出套管。</li>
 <li>用无菌PBS或生理盐水冲洗移植眼。</li>
 <li>术后前48小时，皮下注射布托啡诺用于镇痛（0.05–0.1 mg/kg）。</li>
 <li>移植后立即在移植眼上涂抹红霉素眼用抗生素软膏。</li>
 <li>将动物放回加温的笼盒中，使其从麻醉中恢复。</li>
</ol>

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</ol>

P-O.B. 是生物技术公司 Biocrine 的创始人之一，该公司计划将眼睛的前房用作商业服务平台。A.C. 是保护该技术专利的发明人之一。

采用胶原酶消化法分离小鼠胰岛，随后通过密度梯度纯化，方法如前所述33。分离的胰岛在移植前进行过夜培养。尽管此步骤可能并非必需，但建议让胰岛从分离操作中恢复。当移植操作在糖尿病受体中进行时，这一步骤尤为关键，可确保移植存活且功能健全的胰岛。
移植手术在全身麻醉下进行，通过吸入氧气/异氟烷混合气体（1.5–3%）以达到麻醉效果。也可使用其他吸入性或注射性麻醉剂（例如氯胺酮）。若使用注射麻醉，则跳过方案中的步骤2.2。手术过程中需为麻醉动物提供热源，以防止低体温。在某些小鼠中，于通常无血管的角膜上做切口时可能损伤血管。例如，裸鼠的角膜往往存在血管化现象；应尽可能避开血管化区域。每次切口应使用新的注射器。做切口时避免针头刺穿虹膜。为避免与虹膜接触，可将针头斜面朝向虹膜侧。切口后不要干燥或抽吸房水。在“湿润”的角膜上更易于将导管穿过切口；必要时可在角膜上滴加少量无菌PBS或培养基。
术后镇痛可在前48小时通过皮下注射布托啡诺（0.05–0.1 mg/kg）或首选镇痛药实现。在步骤2.9中，我们在手...

活体显微技术的进步揭示了先前未被预测的生理现象 体外 研究1这凸显了在将传统方法获得的研究结果进行转化时所面临的挑战 体外 将方法应用于活体动物。在过去十年中，随着成像技术的不断进步，活体动物组织的可视化水平得到了显著提升2, 3, 4, 5, 6这促使人们迫切需要 体内 可在实验动物模型中应用的成像方法，以实现对目标组织的无创纵向可视化观察。 
磁共振成像、正电子发射断层扫描或生物发光等成像技术已实现对体内深层器官/组织的无创成像7-8, 9但这些技术由于背景信号较高且空间分辨率较低，即使使用了高对比度材料或组织特异性发光物质，也无法达到单细胞分辨率。4这随着双光子荧光共聚焦显微镜的出现而得到解决10双光子显微镜实现了活体成像研究，能够以前所未有的细节可视化并量化细胞事件11, 12这促进了对健康与疾病状态下关键生物过程的表征研究13, 14, 15, 16. 尽管早期的活体成像研究主要采用“模拟”方式 体内 离体组织中的条件（例如 淋巴结），其他研究则采用侵入性方法对暴露的目标组织进行成像 原位17, 18, 19, 20, 21其他研究也已采用“窗式观察室模型”来克服侵入性方法及成像分辨率有限所带来的局限性 体内22, 23, 24, 25在窗式培养皿模型中，将带有透明窗口的培养皿通过手术植入动物体内的不同部位（如背部皮肤、耳部皮肤、乳腺脂肪垫、肝脏等）例如 小鼠、大鼠、兔子）。尽管该方法显然能够实现高分辨率 体内 成像需要进行侵入性手术以植入观察窗，且可能无法支持持续数周或数月的纵向成像研究22.
最近的研究表明，将高分辨率共聚焦显微镜与一种微创手术——眼前房（ACE）移植技术相结合，可提供一个“天然的体内窗口”，具有强大且多样的应用潜力。 体内 成像平台26, 27将组织移植到ACE中已在过去几十年中被用于研究多种组织的生物学特性 28, 29, 30；最近与高分辨率成像技术结合，使得能够以单细胞分辨率对胰岛生理进行无创且纵向的研究26, 27该方法已被用于研究动物模型中1型糖尿病发展过程中的自身免疫反应（未发表数据）。此外，还通过分别移植到ACE胰腺芽或单个肾小球，用于研究胰腺发育以及肾脏功能（未发表数据）。最近一项采用该方法的研究进一步证明了其在胰岛移植后免疫反应研究中的应用价值。31重要的是，本研究表明，将组织移植至眼前房可提供一个天然的体内观察窗口，用于实现：（1）对移植组织进行纵向、无创成像 体内; (2) 体内 细胞标记以评估细胞表型和活力 原位（3）对靶组织中浸润的免疫细胞进行实时追踪；以及（4）通过局部给药或眼内注射进行局部干预。
在此，我们演示如何使用胰岛进行眼前房移植。

<table><tbody><tr><td>异氟烷（Isoflurane）</td><td>Buttler Animal Health Supply</td><td>11695-6775-2</td><td>99.9% 异氟烷/ml</td></tr><tr><td>氯胺酮注射液（Ketaset, Ketamine HCL）</td><td>Fort Dodge Animal Health</td><td>0856-2013-01</td><td>替代性注射用麻醉剂</td></tr><tr><td>布托啡诺盐酸盐（Beprenex, Buprenorphine HCL）</td><td>Reckitt Benckiser Health Care (UK) Ltd.</td><td>12496-075-7-1</td><td>0.3 mg/ml</td></tr><tr><td>红霉素眼膏 USP，0.5%</td><td>Akron</td><td>17478-070-35</td><td>用于移植眼的预防性涂抹</td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠（生理盐水）</td><td>Hospira Inc.</td><td>0409-7983-03</td><td>用于静脉注射，无菌</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>1X，无菌</td></tr><tr><td>CMRL 1066 培养基</td><td>Cellgro</td><td>98-304-CV</td><td>添加物补充，CIT 改良型，胰岛培养首选培养基</td></tr></tbody></table>

移植至眼前房以实现纵向、非侵入性 在体 实时单细胞分辨率成像

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

活体成像已成为生物研究中不可或缺的工具。在此过程中，已发展出多种成像技术，用于非侵入性地研究动物体内的不同生物学过程。然而，现有活体成像方法面临的主要技术局限在于难以同时实现非侵入性、长期纵向成像与单细胞分辨率。本文展示了将样本移植至眼前房如何克服这一重大限制，提供了一个多功能的实验平台，可实现具有细胞分辨率的非侵入性、长期纵向成像 体内我们展示了小鼠体内的移植操作，并采用具有临床相关性的胰岛移植模型提供了代表性结果。该方法不仅能够实现对移植至眼前房的各种组织进行直接可视化观察，还提供了一个通过长期随访和靶组织监测来筛选药物的平台。由于其多功能性，眼前房组织/细胞移植不仅有利于移植治疗的发展，还可拓展至其他领域 体内 用于研究生理和病理生理过程，如信号转导以及癌症或自身免疫性疾病的发生。

定义一次“良好”移植手术的参数有若干项。良好的移植手术在切开时应无出血，如视频中所示。通过仅将手术刀（针头）的尖端刺入ACE，可防止或尽量减少出血。图3a这也有助于防止与虹膜接触或刺穿虹膜，同时确保切口较小，愈合良好，长期不会引起角膜混浊。图3c，d）。成功移植的另一个重要方面是能够将所需数量的胰岛全部移植，避免因胰岛从胆总管反流而导致损失。如方案步骤1.6所述，可通过以尽可能小的体积注射胰岛，以及在适用情况下，于套管从胆总管撤出前使用气泡帮助封闭切口，从而最大限度减少反流。图3b）。此外，将胰岛递送至瞳孔边缘与角膜缘之间的虹膜表面，可使胰岛处于一个极为适宜的位置，便于后续观察和操作。 体内 成像（图3d）。从实际角度来看，将胰岛置于虹膜的这一中间位置，可减少覆盖整个胰岛所需的成像z轴堆栈的厚度（图4）。这在荧光共聚焦/双光子显微镜成像过程中尤为重要 体内 成像时，较薄的z轴堆栈可减少组织对光的散射，从而在成像组织的深层区域实现更优的...

一种结合眼内移植与共聚焦显微镜的新方法，可实现对移植组织内细胞的纵向、无创实时成像，分辨率达单细胞水平 体内我们展示了如何将胰岛移植到小鼠眼球前房。

活体成像已成为生物研究中不可或缺的工具。在此过程中，已开发出多种成像技术用于研究……

您好，我是来自迈阿密大学米勒医学院糖尿病研究所的Doretta。在本视频中，我将演示如何将胰腺胰岛移植到小鼠眼球的前房内。该操作包含两个步骤。第一步是将分离的胰岛细胞装入套管中，第二步是实际的移植操作。有关仪器和试剂的详细信息，请参阅配套文本。在此我们重点介绍配备已安装注射器、储液器及套管附件的电动注射泵，接下来的视频将重点展示这一装置。首先将套环装入套管中。所有操作均在体视显微镜下进行。通过顺时针或逆时针旋转培养皿，使套环居中。当居中后，将套管从储液器上断开，并通过推动电动注射泵向前运行来排出任何气泡，此操作通过踩下前进脚踏板完成。准备就绪后，开始将电动注射泵反向驱动，从而将小孔吸入储液器中。再次踩下后退脚踏板。注意观察小环如何倾向于积聚在储液槽底部。然后将套管重新连接至储液槽，并将小环从储液槽中推出。然后将套管插入导管，以使小环从储液器中脱出，并促使其保持紧密排列在导管内。推动电动注射泵前进时，轻敲储液器。注意观察当小环开始进入套管后端时在导管内紧密排列的情况。此时，您应已准备好进行眼杯移植。将NS大小的小鼠放置在垫子上，用食指和拇指拉住头部皮肤，暴露或将待移植的眼球挤出。将斜面朝下的针头接近眼球，以避免与虹膜接触造成损伤。将针尖刺入角膜，并做一侧向切口。接着，通过切口将预先装有眼睑的套管插入眼内腔，然后通过推动电动注射泵向前，开始再次向眼内腔灌注眼环。不必担心套管内可能滞留的气泡，因为它们随后会自行消散。这些气泡将起到天然屏障的作用，以尽量减少或防止眼睑从腔室中反流出来。缓慢而小心地将套管从腔室内抽出。现在用无菌 PBS 冲洗眼睛。注射你选择的镇痛剂，最后，涂抹眼用抗生素软膏。移植手术完成。我们现在展示将胰腺类眼状结构移植到眼内腔后的代表性结果。在移植后第7天，对单个类眼状结构进行纵向成像研究。移植后第28天，类眼状结构明显地成功植入虹膜表面。小孔的位置与移植后42天观察到的位置相同。这些小孔在相同位置清晰可见。同时请注意切口愈合良好，完全不会影响对各个小孔成像的观察。

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纵向，非侵入性的移植到眼睛的前房<em在体内</em&gt;单细胞分辨率的实时成像

在不同遗传背景下对单个野生型视网膜前体细胞进行活体追踪，可评估细胞非自主性信号在神经发生过程中的作用。本文结合基因敲低、通过胚胎移植构建嵌合体以及 体内...

体内成像嵌合体斑马鱼胚胎中单个视网膜前体细胞的转基因表达以研究细胞非自主性影响

视网膜色素上皮细胞可作为干性年龄相关性黄斑变性晚期的细胞替代疗法。本方案描述了地理样萎缩的大眼模型的建立，以及将人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞移植至该疾病模型的视网膜下腔的过程。...

地理萎缩大眼模型中人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞的视网膜下移植

关键词：人胚胎干细胞，视网膜色素上皮细胞，地理萎缩，视网膜下移植，大眼模型

本实验方案的目的是通过激光扫描显微镜对植入小鼠眼前房的胸腺组织中的胸腺细胞进行纵向活体实时追踪。由于角膜透明且移植物具有血管化特性，可连续记录前体细胞的招募过程以及成熟T细胞的迁出过程。...

实时 体内 通过激光扫描显微镜追踪眼前房中的胸腺细胞

本文展示了一种用于活体小鼠眼表成像的多光子显微成像平台。利用荧光转基因小鼠，可实现对眼表内的细胞核、细胞膜、神经纤维及毛细血管的可视化观察。来源于胶原结构的非线性二次谐波生成信号，可实现对基质结构的无标记成像。...

一种用于小鼠角膜和结膜活体成像的定制多光子显微镜平台

本方案的目的是持续监测人胰岛移植过程的动力学变化以及宿主细胞与供体细胞的贡献情况。通过将人胰岛移植到NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-小鼠受体的眼前房（ACE），随后进行多次双光子成像，即可实现该目标。...

活体纵向成像与定量分析人胰岛移植物及前房眼内微环境宿主细胞的贡献

活体成像是研究健康与疾病状态下生物学的有力工具。本方案描述了使用标准双光子显微镜对小鼠视网膜进行经瞳孔成像的方法。同时展示了多种活体成像技术，用于对视网膜中多个细胞群体进行荧光标记。...

经瞳孔双光子活体小鼠视网膜成像

该方案介绍了一种利用倒置共聚焦显微镜简化活体成像的新工具。...

简化的小动物活体成像方法用于倒置共聚焦显微镜下长期监测上皮组织动态变化

在此，我们介绍一种可实现非侵入性 体内 小鼠眼前房移植肝类器官的成像。该实验流程涵盖从原代肝细胞生成类器官，到将其移植至小鼠眼前房的全过程 体内 通过共聚焦显微镜实现细胞分辨率成像。...

活体成像小鼠眼前房移植的肝类器官

高频多普勒超声是一种用于评估局部心肌功能的新型技术。本研究首次证明了这种多功能成像平台在缺血-再灌注（IR）小鼠心脏中重复测量心肌应变、dp/dt及二尖瓣反流的可行性。...

高频高分辨率超声心动图：非侵入性重复测量缺血-再灌注小鼠心脏心肌应变、收缩力及二尖瓣反流的首次证据

本文介绍一种大鼠肾移植模型，通过使用18F-氟脱氧葡萄糖的正电子发射断层扫描技术，无创评估急性同种移植排斥反应。...

使用18F-FDG PET对大鼠肾移植后急性移植物排斥反应进行无创成像

了解小鼠眼前房胰岛移植技术，利用共聚焦显微镜实现单细胞分辨率的纵向非侵入性实时成像。该方法可长期监测移植物存活与整合，为糖尿病治疗研究提供新工具。

移植至眼前房以实现纵向、非侵入性在体实时单细胞分辨率成像

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