Name: 平移血管复合同种异体移植（VCA）研究一种改进的异位猪后肢移植模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 了解猪后肢异位移植模型在血管化复合同种异体移植中的应用，该模型包含完整血管化骨髓，可用于研究免疫调节方案的免疫学结果，并支持开发减少免疫抑制需求的临床相关方案。

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我们谨向以下人士对本项目所做出的贡献表示感谢：Kakali Sarkar博士、Joani Christensen理学学士、Kate Buretta理学学士、Nance Yuan理学学士、William Lehao医学博士、Johanna Grahammer、Georg Furtmüller医学博士、Erin Rada医学博士、Mohammed Al-Rakan医学博士、Karim Sarhane医学博士、Saami Khalifian理学学士、Mao Qi医学博士，以及Angelo Leto Barone医学博士，VCA实验室，约翰斯·霍普金斯大学医学院整形与重建外科系；Janis Taube医学博士、Mark Fischer医学博士，约翰斯·霍普金斯大学医学院皮肤病学与病理学系；Sue Eller，约翰斯·霍普金斯大学医学院微创手术培训中心；以及林承宏医学博士，长庚纪念医院林口院区，中国台湾。
资助来源：军队再生医学研究所（美国国防部 W81XWH-08-2-0032）

在本视频出版物中，所有动物实验操作均依照约翰斯·霍普金斯大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的动物实验方案进行。
1. 术前规划
<ol>
	<li>在我们的肢体异体移植转化研究中，使用MHC定义的MGH近交系微型猪（15-20 kg），其中一只雄性供体为两只雌性受体提供肢体（图1）。手术前，由兽医对供体和受体动物进行全面的临床评估。</li>
	<li>为尽量减少麻醉和缺血时间，供体和受体手术在同一专用大型动物手术室内，于三张手术台上同时进行。手术团队与兽医人员之间的团队协作与协调对于整个手术的成功至关重要。手术计划将在手术日前1-2周内与兽医团队召开正式会议进行讨论。</li>
	<li>在移植前，为每只受体动物的外部或内部颈静脉置入带隧道的中心静脉导管（7 Fr双腔Hickman导管），用于免疫抑制药物浓度监测以及免疫抑制和/或免疫调节药物的静脉给药。这些导管通过直视下静脉切开技术置入，并经隧道从背部颈后上方穿出，使用单丝不可吸收缝线和颈部粘性绷带包扎固定。</li>
	<li>术前至少12小时禁食（可自由饮水，但禁止固体食物）。</li>
	<li>手术当天，通过肌内注射给予氯胺酮20 mg/kg和赛拉嗪2 mg/kg以实现动物镇静。</li>
	<li>插入合适尺寸的气管插管，并连接至麻醉机和呼吸机（维持异氟烷浓度0.5-3%）。</li>
	<li>在耳缘静脉置入静脉导管，并在整个手术过程中根据体重持续输注0.9%生理盐水。</li>
	<li>给予预先镇痛治疗（丁丙诺啡0.02 mg/kg，静脉注射）。</li>
	<li>在首次切口前，对供体和受体动物均给予预防性抗生素（头孢唑林20-25 mg/kg，静脉注射）。</li>
	<li>对供体和受体的所有操作均采用无菌技术，包括使用经高压灭菌或气体灭菌的器械、口罩、头帽、无菌手术衣和无菌手套。使用电动剃须刀剃除切口区域毛发，并交替使用聚维酮碘溶液和酒精进行消毒。</li>
</ol>
术中监测：
<ol>
	<li>诱导和插管后，使用含0.5-3%异氟烷的氧气混合气体维持麻醉。</li>
	<li>持续监测心率、脉搏血氧饱和度、心电图、呼气末CO2和直肠温度，每15分钟记录一次。</li>
	<li>使用Bair Hugger&#160;暖风毯防止低体温。</li>
</ol>
供体猪骨肌皮复合组织异体移植的切取：
<ol>
	<li>将供体动物仰卧位放置于手术台上，并以无菌方式铺巾。</li>
	<li>使用近红外激光血管造影技术识别通往前内侧皮肤的穿支血管。通过外周血管通路注射吲哚菁绿，剂量约为0.06 mg/kg，用2–5 ml生理盐水稀释。约10秒后，进行30秒至2分钟的近红外影像记录。利用这些记录的视频确定穿支血管的位置。根据穿支血管分布，标记一片皮肤区域（约100 cm²）2用于监测。</li>
	<li>使用手术刀沿皮瓣标记线在腹股沟处做皮肤切口图2).</li>
	<li>识别股动静脉并分别于膝上支远端及腹股沟韧带近端水平进行分离。</li>
	<li>解剖皮肤和皮下组织时，保留皮瓣区域的皮肤。将皮肤边缘缝合至下方肌肉，以防止在皮瓣切取过程中发生收缩。</li>
	<li>使用往复锯（Electric Pen Drive，Synthes，West Chester PA）在跗骨上方进行截骨。</li>
	<li>使用电灼器分离大腿近端的肌肉。</li>
	<li>在股骨中段截断，保留以血管蒂为基础的骨肌皮瓣。该皮瓣包含皮肤皮片、 underlying 大腿肌肉、膝关节、股骨远端和胫骨近端，其中含有具有独特免疫学特征的完整血管化骨髓。</li>
	<li>使用骨蜡实现髓腔内的止血。使用咬骨钳修整骨边缘，为受体做好准备。</li>
	<li>在准备受体股血管期间，保持移植物通过其血管蒂灌注图3).</li>
	<li>受体解剖完成后，尽可能靠近近端结扎供体股动静脉，并在移植前用组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐溶液（HTK, Custodiol, Newtown PA）灌注移植物。 
	注意：供体肢体被移植到受体的对侧 即 受体右侧使用左侧供体肢体，受体左侧使用右侧供体肢体。</li>
	<li>在采集第二条后肢后，立即通过静脉注射戊巴比妥钠（100 mg/kg）处死供体猪。由兽医人员根据既定方案确认动物死亡。</li>
</ol>
4. 受体手术（后肢异体移植）
<ol>
	<li>在供体初始切口后立即开始受体的诱导和插管，以便在获取供体肢体的同时准备受体血管。这可消除不必要的等待时间，并缩短供体和受体的总麻醉时间。</li>
	<li>将动物仰卧位放置，并向手术侧旋转30°，以暴露背外侧区域。</li>
	<li>做腹股沟切口，暴露股血管；从远端至腘上分支水平、近端至腹股沟韧带水平分离血管。</li>
	<li>从腹股沟至背外侧腹壁创建一个皮下 pocket，用于移植物的植入（图4）。</li>
	<li>结扎供体血管，并用HTK溶液冲洗移植物。</li>
	<li>以倒置方式实施移植物植入：使皮瓣朝向背外侧，便于站立位时进行免疫监测；股血管的断端朝向尾侧，以便在无张力状态下完成端对端血管吻合（图5）。</li>
	<li>如有条件，静脉吻合可使用血管连接装置（Synovis, St Paul MN，规格2.5–3.5适用于10–20 kg动物）。与传统方法相比，此法显著缩短缺血时间。</li>
	<li>采用传统缝合技术，使用9-0缝线完成动脉吻合（Synovis, St Paul MN）。</li>
	<li>确认血管通畅后，用3-0 PDS缝线将移植物固定到位（图5）。移植物肌肉应缝合至腹壁肌肉，不应缝合至受体大腿肌肉，以免动物在笼内活动时造成损伤。</li>
	<li>将皮瓣外置于背外侧，用于免疫监测（图6），并使用3-0 Vicryl皮下缝线和4-0单股可吸收间断皮肤缝线将其缝合至邻近皮肤。</li>
	<li>使用3-0 Vicryl皮下缝线和4-0单股可吸收间断皮肤缝线分层缝合腹股沟皮肤。</li>
	<li>术后使用50–100 mcg/hr芬太尼贴剂进行镇痛。</li>
	<li>完成后肢异体移植后，待动物清醒并能自主平稳呼吸后，将其送回饲养笼。</li>
</ol>

<ol><li>Barth, R. N., Rodriguez, E. D., Mundinger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+bone+marrow-based+immunosuppression+inhibits+rejection+of+vascularized+composite+allografts+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Vascularized bone marrow-based immunosuppression inhibits rejection of vascularized composite allografts in nonhuman primates.</a> Am. J. Transplant. 11 (7), 1407-1416 (2011).</li>
<li>Brandacher, G., Gorantla, V. S., Schneeberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hand%2FForearm+transplantation+using+a+novel+cell-based+immunomodulatory+protocol-experience+with+five+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Hand/Forearm transplantation using a novel cell-based immunomodulatory protocol-experience with five patients.</a> Am. J. Transplant. 11, 190(2011).</li>
<li>Brandacher, G., Grahammer, J., Sucher, R., Lee, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+basic+and+translational+research+in+reconstructive+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res.+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Animal models for basic and translational research in reconstructive transplantation.</a> Birth Defects Res. C Embryo Today. 96 (1), 39-50 (2012).</li>
<li>Brandacher, G., Lee, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hand+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Hand+Clin%22%5BJournal%5D)">Hand transplantation.</a> Hand Clin. 27, xiii-xiv (2011).</li>
<li>Hettiaratchy, S., Mendely, E., Randolph, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+to+composite+tissue+allografts+across+a+major+histocompatibility+barrier+in+miniature+swine%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Tolerance to composite tissue allografts across a major histocompatibility barrier in miniature swine.</a> Transplantation. 27, 514-521 (2004).</li>
<li>Ibrahim, Z., Busch, J., Awwad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selected+physiologic+compatibilities+and+incompatibilities+between+human+and+porcine+organ+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Selected physiologic compatibilities and incompatibilities between human and porcine organ systems.</a> Xenotransplantation. 13 (6), 488-499 (2005).</li>
<li>Kirk, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+the+bridge%3A+large+animal+models+in+translational+transplantation+research%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Crossing the bridge: large animal models in translational transplantation research.</a> Immunol. Rev. 19, 176-196 (2003).</li>
<li>Lee, W. P., Rubin, J. P., Cober, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+swine+model+in+transplantation+of+vascularized+skeletal+tissue+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Use of swine model in transplantation of vascularized skeletal tissue allografts.</a> Transplant Proc. 30, 2743-2745 (1998).</li>
<li>Mathes, D. W., Hwang, B., Graves, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+to+vascularized+composite+allografts+in+canine+mixed+hematopoietic+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Tolerance to vascularized composite allografts in canine mixed hematopoietic chimeras.</a> Transplantation. 92 (12), 1301-1308 (2011).</li>
<li>Mathes, D. W., Randolph, M. A., Solari, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+tolerance+to+a+composite+tissue+allotransplant+in+a+swine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Split tolerance to a composite tissue allotransplant in a swine model.</a> Transplantation. 75 (1), 25-31 (2003).</li>
<li>Mezrich, J. D., Haller, G. W., Arn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histocompatible+miniature+swine%3A+an+inbred+largeanimal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Histocompatible miniature swine: an inbred largeanimal model.</a> Transplantation. 75 (6), 904-907 (2003).</li>
<li>Petruzzo, P., Lanzetta, M., Dubernard, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+International+Registry+on+Hand+and+Composite+Tissue+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">The International Registry on Hand and Composite Tissue Transplantation.</a> Transplantation. 90, 1590-1594 (2010).</li>
<li>Sucher, R., Lin, C., Zanoun, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+hind+limb+transplantation%3A+a+new+composite+tissue+allotransplantation+model+using+nonsuture+supermicrosurgery%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Mouse hind limb transplantation: a new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery.</a> Transplantation. 90, 1374-1380 (2010).</li>
<li>Ustüner, E. T., Majzob, R. K., Ren, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swine+composite+tissue+allotransplant+model+for+preclinical+hand+transplant+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Swine composite tissue allotransplant model for preclinical hand transplant studies.</a> Microsurgery. 20, 400-406 (2000).</li>
<li>Ustüner, E. T., Zdichavsky, M., Ren, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+composite+tissue+allograft+survival+in+a+porcine+model+with+cyclosporine%2Fmycophenolate+mofetil+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Long-term composite tissue allograft survival in a porcine model with cyclosporine/mycophenolate mofetil therapy.</a> Transplantation. 661, 581-587 (1998).</li>
<li>Wachtman, G. S., Wimmers, E. G., Gorantla, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologicals+and+donor+bone+marrow+cells+for+targeted+immunomodulation+in+vascularized+composite+allotransplantation%3A+a+translational+trial+in+swine%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Biologicals and donor bone marrow cells for targeted immunomodulation in vascularized composite allotransplantation: a translational trial in swine.</a> Transplant Proc. 43, 3541-3544 (2011).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

历史上，异位后肢移植方案包括将皮瓣外置于腹壁腹侧，血管采用端-侧吻合方式（Hettiarachty 2004）。然而，在我们改进的方法中，采用倒置皮瓣嵌入技术及端-端吻合，使皮瓣位置更偏向外侧，从而便于在动物直立状态下进行免疫监测。通过近红外激光血管造影识别腓肠动脉及灌注最充分的区域，进一步提高了皮瓣血供的可靠性。
在我们改进的技术中，通过在股动静脉之间进行端对端吻合，以尽量减少与显微血管吻合相关的技术失败。端对端吻合还使我们能够使用血管连接装置（Synovis St. Paul MN）进行静脉吻合，从而进一步缩短了热缺血时间。根据我们的经验，使用连接装置可使缺血时间更加可预测；由于缺血时间的变异与免疫学结果直接相关，这一改进提高了该模型的可靠性。然而，使用连接装置会增加材料成本，但考虑到手术的总体成本以及避免潜在并发症的优势，仍被认为具有成本效益。
我们的异位下肢移植术后立即产生了循环中的供体来源骨髓细胞，这一点通过针对雄性供体SRY基因的定量PCR分析得到证实。此外，通过免疫组织化学方法证实了长期存活受体中移植物骨髓成分的...

手部和面部移植等带血管复合组织异体移植（VCA）如今已成为临床现实，全球已成功实施了多例手部和面部移植手术12。尽管早期和中期结果良好且令人鼓舞2，但长期多药联合免疫抑制治疗的需求仍限制了其广泛临床应用。小鼠VCA模型的进展，包括超显微外科吻合技术和无缝线套管技术13, 3，为深入理解VCA中的同种免疫反应奠定了基础。基于对VCA免疫机制的进一步认识，已提出多种免疫调节方案用于临床应用，但这些方案需在大型动物模型中加以验证，以合理预测其在人体中的效果7。鉴于人类与猪在生理学和免疫学系统上的相似性6，猪VCA模型可被视为比犬类9和非人灵长类模型1更为可靠且经济的替代方案。
本文详细介绍了我们用于MHC定义的异种异位后肢移植猪模型的方法学，该模型为当前和未来旨在诱导对血管化复合组织移植（VCA）免疫耐受的免疫调节策略奠定了基础，从而拓展其临床应用。我们采用经过充分表征的近交系猪，其在猪白细胞抗原（SLA）基因座上具有纯合性，专为移植相关研究而培育11。基于股动静脉构建一个带血管的骨-肌-皮瓣，该皮瓣包含远端股骨和近端胫骨中完整的带血管骨髓。移植物还包括股前内侧的大腿皮肤，并将其移植至受体动物背外侧部位，以便对VCA中免疫原性最强的组分进行免疫监测。将皮肤移植物置于背外侧位置有利于在站立和坐卧体位下进行临床检查，同时有助于保持移植物皮肤相对清洁。
Ustener 等通过在外来杂种农场猪中移植桡骨前肢骨肌皮瓣，首次建立了VCA领域中最早的大型动物转化模型之一15。该研究团队利用此模型首次证明，包含高度免疫原性皮肤组分的VCA急性排斥反应可通过一种具有临床相关性的策略进行延迟和治疗，且未出现显著的药物特异性并发症和副作用。该研究取得的良好结果为设计用于人类重建移植的药物方案奠定了基础。尽管早期的猪VCA模型非常适合用于开发预防皮肤、肌肉、骨骼、神经和血管排斥反应的方案，但其缺乏关节软骨和关节滑膜等特殊结构。后续研究重点转向包含动物内侧趾部的移植，但这需要使用全长固定夹板以防止移植物脱落14。虽然该模型适用于研究肢体移植中所有主要组分的排斥反应，但其主要局限之一是由于夹板固定导致术后动物行走困难。因此，研究人员建立了异位猪肢体同种异体移植模型，该模型包括胫骨、腓骨、膝关节、股骨远端、周围肌肉以及一块皮肤皮瓣，主要用于研究VCA的免疫学特性，同时使动物在术后能够自由行走，并将并发症降至最低&#160;8。
通过David H. Sachs博士的开创性工作，建立了经过充分表征的SLA定义的近交系猪，这开启了转化性血管化复合组织移植（VCA）研究的新时代。Mathes 等10利用异位后肢移植模型，在次要抗原不匹配的条件下，证明了仅需短期环孢素治疗即可实现骨骼肌成分的无限期存活。然而，皮肤成分的存活时间仅相较于未治疗对照组有所延长。移植物皮肤成分的丢失被认为是由孤立且高度强烈的免疫反应所致，尤其是针对表皮的免疫反应。类似地，在完全不匹配的猪模型中，尽管采用T细胞耗竭、短期环孢素治疗以及细胞因子动员的供体外周血单个核细胞，仅能诱导对骨骼肌成分的耐受，而皮肤成分仍被排斥5。这一现象被称为“分离性耐受”，它使VCA研究发生了范式转变，更加关注高度免疫原性的皮肤成分——迄今为止大多数重建性移植手术中不可或缺的关键组成部分。
在该改良模型中，我们通过结扎受体股动脉并将其向头侧旋转，进行端端吻合（图1）。这种方法不仅可通过使用常规耦合装置缩短缺血时间，还可降低吻合失败的风险。在我们的受体动物中，股动脉结扎后未观察到任何缺血事件，表明侧支循环足以维持下肢原有的血液供应。此外，在该改良方法中，外置的皮肤组分依据其下方的穿支血管进行游离，并置于侧方位置（图1），而传统模型则位于腹股沟腹侧10。这种设计使得在动物站立或坐立状态下均可方便地观察移植物，便于免疫监测。
因此，建立可靠且可重复的大型动物模型对于研究针对VCA皮肤组分的耐受诱导策略，以及开发新型无创免疫监测方法以更好预测移植物存活至关重要。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>HTK</td><td>Custodial</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>电动摆锯</td><td>Synthes, Westchester PA</td><td>05.001.011</td><td>往复锯</td></tr><tr><td>血管吻合装置</td><td>Synovis, Newtown PA</td><td>21003B</td><td></td></tr></tbody></table>

一种改良的异位猪后肢移植模型在转化性带血管复合组织异体移植（vca）研究中的应用

A Modified Heterotopic Swine Hind Limb Transplant Model for Translational Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Research

手部和面部移植等血管化复合组织异体移植（VCA）是治疗复杂肌肉骨骼创伤和严重组织缺损的有效治疗选择。尽管早期和中期功能结果良好且令人鼓舞，但VCA中高度免疫原性的皮肤成分可能发生排斥反应，以及长期多药联合免疫抑制可能带来的不良反应，仍阻碍着VCA的广泛临床应用。因此，这一新兴领域的研究需要聚焦于与VCA独特免疫学特征相关的转化研究，并致力于开发新的免疫调节策略，以在无需长期免疫抑制的情况下实现移植后的免疫调节和免疫耐受。
本文描述了一种可靠且可重复的转化型大动物VCA模型，该模型由主要组织相容性复合体（MHC）定义的猪异位后肢同种异体移植中的骨-肌-皮瓣组成。简言之，使用近红外激光血管造影技术在股前内侧区域识别出具有良好血供的皮瓣。在股血管蒂的基础上，获取其下方的肌肉、膝关节、股骨远端及胫骨近端。该异体移植物因其独特的免疫豁免特性，可同时被视为一种血管化复合组织移植（VCA）和血管化骨髓移植。移植物被移植至受体动物的腹壁皮下袋中，其皮肤部分外置于背部外侧区域，以便进行免疫监测。
三个外科团队以高度协调的方式同时开展手术，以缩短麻醉和缺血时间，从而提高该模型的效率，并减少实验方案中潜在的混杂因素。该模型为未来治疗策略的建立奠定了基础，旨在减少甚至消除血管化复合组织移植（VCA）中对长期多药免疫抑制治疗的需求。

采用我们改进的技术，共完成了24例根据SLA定义的猪异位后肢移植，平均缺血时间为78分钟（范围：62–94分钟）。所有动物均顺利完成了移植物植入及背外侧皮瓣的定位。近红外激光血管造影显示，所有受体的移植物灌注良好。最初的12例静脉吻合采用传统缝合技术完成，而后续12例静脉吻合则使用血管耦合装置完成。在采用传统缝合技术的一例动物中，术后即刻发现静脉血栓，需行再次吻合。使用耦合装置完成的所有吻合均未出现并发症。受体动物接受短期（30天）他克莫司单药治疗，部分动物联合供体骨髓（BM）输注及共刺激阻断治疗。他克莫司剂量根据血药浓度调整，目标浓度为10–15 ng/ml。仅接受短期他克莫司治疗及未接受治疗的动物作为对照组。基于共刺激阻断的免疫调节方案使移植后存活时间超过6个月。所有受体均未出现移植物抗宿主病（GVHD）的证据。所有长期存活者（移植后超过150天）在安乐死时均存在有活性的血管化骨髓，表明该模型在研究VCA中骨髓成分独特免疫学特征方面的可靠性（图7）。

<p class="jove_content" fo:keep-together.wit...

带血管复合组织异体移植（VCA）已成为临床现实。然而，VCA 的广泛应用受到长期多药免疫抑制治疗的限制。作者介绍了一种可靠且可重复的大动物模型，用于转化新型免疫调节策略，以减少甚至可能消除 VCA 中对免疫抑制治疗的需求。

一种改良的异位猪后肢移植模型在转化性带血管复合组织异体移植（VCA）研究中的应用

带血管复合组织异体移植（VCA），如手部和面部移植，是治疗复杂肌肉骨骼创伤的一种可行治疗方案……

以下实验的总体目标是建立一种可靠且可重复的转化型大型动物后肢移植模型，该模型包含完整的带血管化骨髓组织，用于研究临床相关免疫调节方案的免疫学结果。首先，通过切取带血管的骨肌皮瓣，以研究血管化复合组织异体移植（VCA）中皮肤组分与血管化骨髓所具有的独特免疫学特征。随后，将异体移植物移植至腹壁皮下袋内，从而构建一种技术上可行的模型，且不影响受体动物的正常运动功能。然后将皮肤组分外置于腹侧外侧腹壁，以便通过直立位动物的直接视觉观察来监测移植物。结果表明，这是一种可靠且可重复的模型，可用于测试临床相关的免疫调节方案，利用基于细胞的治疗和生物制剂。该技术相较于现有的VCA模型（如犬类和非人灵长类动物模型）的主要优势在于成本更低、人畜共患病感染风险最低，并且存在SLA定义的供体和受体品系。该方法有助于解答重建性移植领域中关于血管化骨髓独特免疫豁免特性的关键问题，并将为开发一种具有临床相关性的免疫调节方案铺平道路，从而最大限度地减少免疫抑制。我们首次提出这一移植模型的设想是在近二十年前，当时我们测试了肢体同种异体移植物各个组分的免疫原性，并证明了分离耐受现象的存在。在获取同种异体移植物肢体之前，需先对供体猪进行镇静处理，并连接呼吸机，以便在整个手术过程中持续输送异氟烷、氟气和氧气。剃毛、清洗并消毒手术部位后，将供体动物仰卧位放置于手术台上，并用无菌巾覆盖。接着，使用近红外激光血管造影技术识别穿支血管至中间皮肤区域。然后通过外周血管通路在生理盐水中注入吲哚菁绿。大约 10 秒后，进行 30 秒至两分钟的近红外记录。然后根据所识别的穿支血管标记一块皮肤区域，作为皮瓣，后续将用于免疫监测。通过检查动物的眼睑反射和脚趾夹捏反射以确认麻醉深度后，使用手术刀沿皮瓣标记线连续做腹股沟皮肤切口，分离皮肤及皮下组织，同时保留该皮瓣区域的皮肤。缝合皮肤边缘至下方肌肉，以避免皮瓣切取过程中发生收缩。随后辨认股血管，并向近端游离至腹股沟韧带水平。远端结扎所有分支，直至皮瓣区域，以获得理想长度为四厘米的血管蒂。使用往复锯在踝关节上方进行截骨术。然后使用电凝术分离大腿近端的肌肉。在股骨中段水平离断供体的股骨，保留以血管化皮瓣为蒂的骨肌皮瓣。该皮瓣包含皮瓣下方的大腿肌肉、股骨下段和膝关节、胫骨上段，从而保留完整的血管化骨髓。由于其独特的免疫学特征，在受体股血管准备就绪之前，需通过其血管蒂持续灌注供体移植物。一旦开始供体切口，立即将受体猪连接至呼吸机，并按照供体猪的操作示范，开始异氟烷麻醉。插入导管用于生理盐水输注，并预先给予布托啡诺及预防性抗生素。将动物置于仰卧位，充分暴露背外侧表面，并检查麻醉深度。接着，在腹股沟区做一切口以暴露股血管，并在腹股沟韧带水平向远端和近端分离血管约三至四厘米。然后，从腹股沟区至背外侧腹壁皮下创建一个皮下隧道，用于移植物的植入。现在结扎供体血管，并使用组氨酸、色氨酸酮戊二酸或 HTK 溶液冲洗移植物组织。如果这是来自供体的最后一次取材，则应立即根据动物实验方案对动物实施安乐死，以进行移植物植入。将移植物倒置放置，使股骨切断端朝下，以便使用血管连接装置在无血管张力的情况下完成吻合。如有条件，先进行静脉吻合。该装置将显著缩短缺血时间。随后在确认血管通畅后，使用8-0缝线及常规缝合技术进行动脉吻合。使用三根OPDS缝线将移植物肌肉与受体腹壁肌肉缝合，以固定移植物并便于免疫监测。将皮肤皮瓣置于背外侧显露。然后使用三根Vicryl缝线缝合深层组织，并使用四根单丝、可吸收的间断皮肤缝线将组织与受体皮肤缝合。最后，使用3-0号Vicryl缝线逐层缝合腹股沟皮肤的皮下组织，随后使用4-0号单丝可吸收缝线行间断缝合皮肤。术后镇痛：当动物清醒并能自主平稳呼吸后，为其贴敷一片释药速率为50微克/小时的芬太尼透皮贴剂。将动物放回圈舍，任其自由进食和饮水。在术后最初24小时内每4小时观察一次动物是否有疼痛或痛苦的迹象，之后每日观察两次。采用我们改进的技术共完成了19例主要组织相容性复合体（MHC）定义的猪异体后肢移植。这些移植手术旨在开发诱导VCA中免疫耐受的治疗策略。该模型已成功用于开发针对VCA长期排斥反应的新型免疫耐受治疗策略，对照组在停止常规免疫抑制后表现出移植物排斥加速。一旦掌握，若操作得当，每例供体肢体的手术可在一至两小时内完成，每例受体手术则需两至三小时。在实施该手术时，需注意供体对侧肢体将被移植至受体腹壁袋中，具体为右侧肢体移植至左侧腹股沟，左侧肢体移植至右侧腹股沟，反之亦然。该技术为重建性移植领域的研究人员探索新型免疫调节方案铺平了道路，这些方案可最大限度地减少终身免疫抑制治疗的需求，从而有利于改善这种创新治疗模式的风险-获益平衡。观看本视频后，您应能充分理解包含完整血管化骨髓的异位后肢移植在技术层面的关键要点。这一可靠且可重复的肢体移植模型将为开发新型免疫调节方案奠定基础，以最小化甚至消除对长期多药联合免疫抑制治疗的需求。

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