诱导上皮和分析间质转化

该程序的总体目标是为体外诱导上皮到间充质转化或 EMT 提供一种简单可重复的方法。这是通过首先在 EMT 诱导培养基补充剂存在下接种感兴趣的上皮细胞类型来实现的。该程序的第二步是在初始铺板后三天用含有 EMT 诱导培养基补充剂的新鲜培养基更换培养基。

最后一步是在初始铺板后 5 天收获细胞，用于下游表征，例如免疫染色。最终，结果可以显示细胞通过光学显微镜、免疫细胞化学、蛋白质血液分析阵列或其他选择的分析程序获得间充质特征。与 TGF β 刺激或基因改造等现有方法相比，该技术的主要优点是这种方法快速简便，与基因改造不同，允许在多种细胞类型中诱导 EMT，其中一些细胞可能仅对 TGF β 刺激没有反应。

这些技术的影响延伸到癌症转移的治疗和诊断。该技术使研究人员能够开发可用于诊断的转移细胞的常见表达特征。它还提供用于药物筛选的细胞。

首先在水浴中将目标细胞的培养基加热至 37 摄氏度。接下来，使用解离溶液（例如使用 triple E express）收获细胞。然后将细胞悬浮在 15 mL 锥形管中的 Prewarm 培养基中，并以 400 Gs 离心细胞悬液 5 分钟。

上清液倒入废液容器中，小心地去除上清液，并将细胞沉淀悬浮在 Prewarm 培养基中。现在计数活细胞，在 0.4% Triam 蓝溶液中稀释细胞悬液样品。将 10 μL 稀释的样品放在血液、细胞仪上，对活细胞进行计数。

活细胞。在计算溶液板中的细胞密度后，不要变为蓝色。在含有一种 XEMT 诱导培养基补充剂的预热培养基中，每平方厘米 9 至 10， 000 个细胞使用组织培养处理的平板或培养瓶培养。

将细胞在 37 摄氏度下用 5% 二氧化碳电镀，并每天使用倒置光学显微镜监测其形态。三天后，用含有一种 XEMT 诱导培养基补充剂的新鲜预热培养基更换培养基。铺板 5 天后，细胞即可进行分析。

倒置光线下观察细胞形态 现在可以固定或收获显微镜细胞 用于下游研究。通过将盖玻片放入含有 95% 乙醇的培养皿中，为 24 孔板准备无菌的 12 毫米盖玻片。使用弯曲的镊子轻轻地从乙醇中取出盖玻片。

火焰对每个盖玻片进行消毒，并转移到 24 孔板的一个孔中处理盖玻片需要小心和练习。接下来在 0.5 毫升 Prewarm 培养基中，含有一种 XEMT 诱导培养基。补充细胞并每孔接种 16， 000 个细胞。

现在如前所述生长和喂养细胞。接种细胞 5 天后，去除培养基，并在一个 XPBS 中用每孔 300 微升 4% 多聚甲醛固定，使其在室温下固定 20 分钟。然后去除固定剂，用每孔 500 微升 1 XPBS 冲洗细胞两次。

接下来，将固定细胞在每孔 400 μL 封闭缓冲液中在室温下孵育一小时。应用封闭剂后，在每孔 400 μL 封闭缓冲液中制备制造商推荐浓度的一抗。然后从孔中取出封闭溶液，并将抗体混合物添加到细胞中。

将细胞在室温下孵育 3 小时或在 4 摄氏度下孵育过夜。如果一抗直接与荧光染料偶联，请在黑暗中孵育。接下来，去除一抗，用每孔 500 μL 的含 0.1% BSA 的 XPBS 洗涤孔 3 次，每次洗涤 5 分钟，如果需要，将细胞遮光。

现在，如果需要，在制造商推荐浓度的二抗中孵育细胞。将抗体稀释为每孔 400 μL 的含 1% BSA 的 XPBS。一小时后，在室温下避光孵育 1 小时。

洗涤细胞 3 次，就像洗涤后去除一抗一样。如果需要，对细胞进行 DPI 复染。最后，用去离子水冲洗细胞，并使用封固剂将盖玻片面朝下安装在载玻片上。

同样，在处理盖玻片时要小心。EMT 诱导培养条件为在多种细胞类型中诱导 EMT 提供了一种可靠的方法。这在四种不同的人类细胞系上进行了测试。

用 EMT 诱导培养基补充剂处理的细胞从经典的上皮形态变为间充质纺锤形形态。E 钙粘蛋白和纤连蛋白表达的双重染色显示红色上皮标志物 e 钙粘蛋白的下调和绿色间充质标志物纤连蛋白的上调，un 诱导的 CF 10 A 样品包含紧密堆积的簇，周围环绕着更松散的细胞。这些簇是 E 可以在此处显示为阳性，以红色显示。

用 EMT 诱导培养基补充剂治疗后，簇消失。这与绿色纤连蛋白表达的增加相吻合。T 98.

发现 G 在 EMT 诱导前具有极低的基础 terrin 水平，这排除了其分析。然而，使用该标志物，发现纤连蛋白水平随着这些细胞中 EMT 的诱导而显着增加。通过总细胞裂解物的 western blotting 进一步证实 e adhere 和纤连蛋白的表达水平。

虽然蛋白质印迹没有显示 HT 29 细胞中总 EAD herrin 蛋白水平显着降低，但免疫化学观察到的 terrin 表面表达降低，以进一步评估 EMT 状态 EMT 绿色芒顿和红色蜗牛的间充质标志物特征在 EMT 诱导前后进行了分析，与之前的结果一致。此处灰色的 Eki 在检查的所有细胞系中下调，表明 EMT 被诱导。此外，据报道，在 5 49 T 98 G 和 MCF 10 A 细胞中，红色的蜗牛和绿色的芒顿上调，CCF 7 人乳腺癌细胞和 PanIN 人胰腺癌细胞均未单独通过 TGF β 信号传导进入 EMT。

这些报告单独使用重组 TGF beta one 得到证实。在 EMT 诱导培养基补充剂中的浓度下，细胞保留了其上皮形态，表面 E 相干水平与对照细胞相似。相比之下，用 EMT 诱导培养基补充剂刺激的细胞显示其表面 E 钙粘蛋白水平急剧降低。

这些细胞也获得了更多的间充质形态。间充质细胞的另一个标志是它们迁移和侵袭的能力。使用 96 孔 BME 细胞侵袭测定法对其进行分析。

根据制造商的说明，5 49 和 pan one 细胞的细胞迁移均显著增加。EMT 诱导后，使用基底膜提取物涂层过滤器进行相同的测定以测试侵袭。与未处理的细胞相比，EMT 诱导的细胞显示出侵袭能力显着增加。

EMT 的稳健诱导可用于分析这些细胞中发生的基因表达变化和信号传导。使用来自 MCF 7 和 a 5 49 细胞的裂解物的基于抗体的商业化阵列来分析磷酸化 MA 激酶家族成员的水平。与对照相比，两种细胞类型在 EMT 诱导的细胞中均表现出 kreb irk one 和 irk two 的磷酸化增加。

A 5 49 细胞也显示 GSK 3 β 磷酸化增加。Mc 7 细胞显示 P 70 S 6 K 磷酸化增加，此外 kreb 或 1 和 DIRK 2 的磷酸化增加。在尝试此过程时，请务必记住，不同细胞类型（而不是所有细胞）的结果可能存在一些差异。

我们使用相同的下游途径进行 EMT 诱导，导致细胞类型之间标志物表达的差异。此外，EMT 的许多标志物没有表现出严格的开启和关闭状态，并且在上皮细胞中可能具有基础水平。按照此程序，此类标记物可以显示间充质转化时定位交换的增加。

药物筛选等其他方法可用于回答其他问题，例如哪些化合物能够调节上皮到间充质的转化。这些化合物在治疗癌症和纤维化方面可能非常有用。