用于无创热疗癌症治疗中评估射频与金纳米颗粒及生物系统相互作用的实验方案

本实验的总体目标是评估金纳米颗粒在体外和体内13.56兆赫射频电场中的加热特性。首先，通过检测高浓度金纳米颗粒及其缓冲液在石英比色皿中的升温速率来实现这一目标。实验的第二步是开展金纳米颗粒对培养癌细胞的体外毒性研究。

第三步是在异位小鼠癌症模型中进行金纳米颗粒的体内研究。最终，通过分析悬浮液中的纳米颗粒、体外实验及体内实验结果，可以确定所研究的纳米颗粒是否可作为射频介导热疗的有效试剂。该方法有助于回答纳米颗粒介导的非侵入性射频热疗领域中的关键问题，例如：产热效应是否源于纳米颗粒本身，以及其是否可用于治疗目的？

通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为目前尚无多少成熟完善的方案可用于开展此类实验。本实验操作将由研究助理 Cisneros、博士后科学家 Stuart Core 以及另一位博士后科学家 Leila Green 演示。以一个市售的 500 毫升金纳米颗粒溶液为例，其颗粒直径为 5 纳米。

取约 125 毫升的储备金纳米颗粒溶液，平均分装至六个 50 千道尔顿的离心过滤管中，在 3000 转/分钟条件下离心 2 分 5 秒。移除作为滤出缓冲液的上清液，并用更多储备溶液重新填充每个过滤管。

继续离心并弃去滤液，重新加样，直至所有纳米颗粒溶液均被过滤。最后一次加样后，将滤过的缓冲液替换为等体积的去离子水，并在将滤液样品加入RF仪器后，重复该过程约八次。使用红外相机软件在QVE区域划定方框，以捕获加热曲线。经过八次洗涤后，5纳米金纳米颗粒滤液的加热数据已接近去离子水的水平。

紫外-可见光谱分析也可用于监测污染物的吸收峰。图中显示的是一个干净的光谱。一旦缓冲液中的污染物被完全去除，我们将纳米颗粒悬浮于过滤管中的0.5毫升去离子水中，以将纳米颗粒从滤膜中分离出来。

然后将全部六种悬浮液合并至一个15毫升离心管中。现在，使用紫外-可见光谱（UV-VIS）和zeta电位分析样品以获得稳定性数据。采用电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES）和/或电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测定纳米颗粒浓度。

扫描电镜（SEM）和/或透射电镜（TEM）分析也可用于获取形态学数据，使用堪萨斯射频（RF）系统或其衍生的负载装置、一支1.3毫升注射器石英管（Q vete），并将射频电场设定为空气中约90千伏每米（kV/m），即Q vete所处位置的电场强度。对于含0.9%氯化钠的标准生理盐水样品，电场强度需降低至约1.1千伏每米。这些是用于在不同射频系统之间进行比较的大致实验条件。

现在，取一支洁净的石英小瓶，加入1.3毫升浓度为1000毫克/升的纯化金纳米颗粒悬浮液。将样品暴露于射频场中120秒，或直至样品温度达到70摄氏度。过度暴露可能导致电弧放电或剧烈沸腾。

使用红外相机及配套软件采集热成像数据以及对照区域。在同一样品上重复此步骤三次。现在将样品通过另一个50千道尔顿的离心过滤器，以从水缓冲液中提取金纳米颗粒。

然后将缓冲液单独重新暴露于射频场中。同样，金纳米颗粒胶体与滤液之间小时数差异的三倍即为金纳米颗粒本身所产生的氢自由基量。最后，我们将滤膜上残留的金纳米颗粒重新悬浮于1.3毫升水中，用于后续实验。

这些体外研究可应用于形成二维单层的任何类型的癌细胞。在此示例中，将使用人肝细胞癌来源的Hep three B细胞，在12孔板的三个孔中每孔接种约50,000个细胞，每孔加入一毫升培养基。

继续向细胞中加入培养基，直至纳米颗粒实验组填满三块培养板，同时作为对照组也填满三块培养板。将培养板在37.5摄氏度下孵育24小时。次日，向三块纳米颗粒组培养板的每个孔中加入0.1毫升浓度为1000毫克每升的金纳米颗粒溶液，对照组培养板则不加。

每孔加入 0.1 毫升水，将所有培养板再孵育 24 小时。再孵育 24 小时后，吸除细胞培养基，并用 PBS 洗涤细胞，以去除任何表面结合的金纳米颗粒。然后更换细胞培养基。

细胞现已准备好进行射频暴露。将每个12孔细胞板放入射频场中，并等待细胞冷却至31摄氏度。待细胞稍冷却后，对其进行3.5分钟的射频暴露。

细胞培养基的最终温度约为37摄氏度。将细胞转移至培养箱中，并在分析前等待24小时。当细胞准备就绪后，吸除培养基，并更换为含有25% MTT试剂的培养基，每孔加入2毫升。

然后让细胞继续孵育4小时。接着，将MTT培养基更换为2毫升DMSO。将细胞培养板置于摇床上振荡10分钟，使DMSO充分溶解MTT试剂。

最后，从每个孔中吸取100微升样品至96孔板中，并在570纳米波长下进行光密度读数。这些体内研究可应用于在原位或异位移植模型中形成实体瘤的任何类型癌症。在此示例中，采用Hep three B肝癌细胞与BPC裸鼠进行实验。

取约100,000个细胞，用胰蛋白酶消化细胞并制备成每25微升含200万个细胞的溶液。向细胞悬液中加入等体积的预冷Matrigel，通过反复吹打充分混匀。然后将混合悬液注射到每只动物背部的预定位置。

数周后，肿瘤将长至直径约0.5至1厘米。此时开始射频治疗，通过腹腔注射酮胺和赛拉嗪混合溶液对小鼠进行麻醉，并保持其体温。随后使用1 cc注射器（配27或30号针头）将金纳米颗粒直接注入一半的肿瘤内。用外科棉签吸去血液，并用酒精棉片擦拭注射部位。

作为对照，在另一半肿瘤中仅注射 PBS。现在，对每组中一半的小鼠进行处理。将小鼠固定在射频发生器的接收头上，并使用铜胶带屏蔽非处理区域，包括眼睛、耳朵和脚趾。

本实验最重要的部分是正确地对小鼠进行接地。若接地不当，动物体表电荷积聚可能导致热损伤或电皮肤损伤。这种情况很容易避免。

将肿瘤置于透射头之外，距离至少比所需治疗区域的宽度多出一厘米。现在调整红外热成像仪的位置，使肿瘤和治疗区域均可见。开启射频持续五分钟，并记录相应的温度曲线。

如果皮肤表面温度升高至42摄氏度以上，射频暴露后应立即停止治疗。将小鼠置于温暖的环境中恢复，直至其恢复意识。每周重复治疗两次，持续三周。

然后在最后一次射频暴露后48小时处死小鼠，并处理肿瘤。通过比较纯化的金纳米颗粒与背景去离子水缓冲液之间的温差来确定射频加热效果。对于5纳米和10纳米的纳米颗粒，结果均符合预期。

纯化的金纳米颗粒被整合到人源肝细胞癌衍生的 Hep three B 细胞中。当此类细胞暴露于射频场时，其存活率通常低于未内化纳米颗粒而仅暴露于射频的细胞。图三描绘了一种理想化的情景：所用金纳米颗粒本身毒性有限，但具有优异的射频诱导细胞毒性；有关迄今使用各类纳米材料的体外实验结果的全面综述，请参阅相关文献。

使用 Hep three B 肝癌细胞在裸鼠背部诱导生成肿瘤。将悬浮于 PBS 中的金纳米颗粒注射至这些肿瘤中，随后进行射频照射。经托马斯分析法进行治疗后评估表明，该治疗可控制肿瘤生长并减小肿瘤体积。

观看本视频后，您应能够充分理解如何通过测定纳米颗粒在体外和体内的射频响应特性及溶液行为，来评估其在射频介导低温治疗中的应用。请务必注意，操作高功率射频电场可能具有极高危险性。切勿触碰或伸手进入正在工作的电场区域。

测量电场强度，如有必要，使用适当的屏蔽措施，例如法拉第笼。通常情况下，应始终尽量减少暴露于持续高强度电场中的时间。