高分辨率显微镜与常规和全息光学捕获能力建设
2013年4月22日
本文介绍的系统采用传统的光陷阱，以及一个独立的全息光阱线，能够创建和操作多个陷阱。这使得创建复杂的几何安排的折光颗粒，同时还允许同时高速，高分辨率测量生物酶的活性。
在此过程中，组装并对齐常规和全息光学捕获线 为此，首先测量光学元件的位置，然后将元件牢固地安装在适当的位置。接下来，对齐光学元件以允许陷印。最后一步是阻挡来自全息镜的 TED 光束。
最终，完成的系统允许同时进行全息和普通陷印。与现有方法（如单独的普通陷印）相比，该技术的主要优点是它允许在三个维度上同时定位多个折射物体并快速进行物体作测量。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为设计、布局和对齐可能具有挑战性。
本视频的起点是一个光学工作台，其中显微镜就位，可在 980 纳米处创建光阱。从该波长的现成半导体激光管之一开始。使用具有偏振功能的 Pig Tilt 激光器，保留已知模场直径的单模光纤。
光纤应足够长以用作模式滤波器，并应使用带有 FCPC 或 F-C-A-P-C 连接器的光纤通道连接器端接。单模光纤应小心处理，应避免扭曲。固定允许功率和温度控制的半导体激光管和支架。
支架应直接固定在光学工作台上，以最大限度地实现被动散热。接下来，将光纤连接器安装到光束整理光学元件上。确保所选光纤端口与二极管的模场直径匹配。
尾纤光纤将整理适配器连接到光学平台上，与显微镜保持足够的距离，以允许光束路由扩展和放置其他组件。杆颜色可用于固定镜头间距，以实现稳健的可重复定位。调整光纤端口，以确保在与显微镜的整体光路相当的距离上保持一致的光束浪费。
DDE 激光束的路径中有五个镜子。从激光器 dde 开始，有两个反射镜将其输出引导到显微镜外壳中。光束还必须穿过二向色镜，这允许半导体激光管光束以 45 度角与入射角的传输不减。
最后，两个额外的短通双光镜，它们透射可见光，但反射近红外及以上。将光束进出显微镜。无限远空间 1 位于显微镜外壳内，用于调整反射镜，移除显微镜物镜。
使用镜子和红外观察卡将光束穿过物镜安装台中的孔径。如果光束偏离中心，请调整镜子以固定对齐，使光束位于中心。安装镜头时，笼式系统可能会导致刚性组件。
卡尺可用于在安装前沿笼杆预先测量镜片之间的距离。临时安装带有定制适配器的红色激光指示器来代替物镜，使其光束沿显微镜的光轴。使用可见激光指示器光束放置并大致对准 980 纳米扩束器。
这种设置使用焦距为 60 毫米和 125 毫米的镜头，以 keary 排列方式将光束腰部增加大约一倍。接下来，在此处使用指针光束作为指南安装 980 纳米转向透镜。每个镜头都有一个 60 毫米焦距的支架，第一个镜头位于精密 X、Y、Z 平台上的光束路径中，具有至少半英寸的行程范围，以允许光束转向。
现在可以定位第二个镜头，与第一个镜头形成一一对应的 keary 排列。该镜头的位置必须与物镜的后焦平面光学共轭。要准备全息阱，请将 1064 纳米激光器安装在高架平台上，高度约为 980 纳米光束的高度。
在激光输出后立即放置半波片和偏振器。允许手动调整激光功率。安装此激光器的扩束器，以便扩展光束废料以匹配全息镜的对角线尺寸。
如果空间受限，请在此处使用小焦距的镜头，即 16 毫米和 175 毫米。现在使用激光指示器光束定位空间光调制器或 SLM，它是所使用的商业全息包的一部分。在本实验中，空间光调制器的位置必须使其与物镜的后焦平面光学共轭。
放置它时，应使激光指示器光束具有尽可能小的入射角，但要使其反射安全地清除光学平台上的所有硬件。在 1064 纳米激光扩束器前面放置另一面镜子，将其光线引导至空间光调制器。确保激光指示器光照射到扩束器孔径的中心。
最后，在空间光调制器和二向色镜之间安装一对望远镜透镜。这些镜头的焦距为 125 毫米和 200 毫米。取下激光指示器，留下定制的适配器支架作为航向对准孔。
仅使用 980 纳米光束开始检查对准。使用红外卡查看器将 980 纳米光束对准，使其沿定制适配器中孔径的中心轴移动。然后使用红外卡确保 1064 纳米光束沿其共享光束路径照射到 980 纳米光束相同的点。
完成此作后，将定制的激光指示器安装适配器更换为高数值孔径油或水物镜。接下来，通过移动激光束对齐 980 纳米陷阱，直到在全息镜关闭的情况下在相机上看到径向对称的干涉图案。通过使用空间光调制器和第一个二向色镜来移动 UN DEFRACT 1064 纳米光束，对齐 1064 纳米陷阱。
在此示例中，两个陷印的对齐图像表示对齐良好，可实现高效陷印，但可以进一步优化。圆形 1064 光束撞击方形 SLM 镜时也存在轻微的像差，这不能通过改进镜头对准来轻易消除。为了阻挡空间光调制器中作用不足的光束产生的陷阱，在作用不足的光的路径中插入一个小的不透明对象，该位置与该系统的采样平面共轭。
将直径为 100 至 300 微米的不透明微球（金属）粘在红外透明圆形玻璃盖玻片或窗口上。该块放置在透镜的公共焦点处，该焦点与样品平面光学共轭。如果将光阱光束注入显微镜的无限远空间，则可以定位光束阻挡器以阻挡未触发的光线，也可以移动光束阻挡器以允许所有光线通过。
组装的设置允许作员实时捕获多个折射物体，并将它们定位在视野的所有三个维度上。在这里，仪器的全息功能通过捕获悬浮在去离子水中的微球来显示，红色和绿色圆圈显示陷阱位置，绿色表示在此剪辑中选择了重新定位的陷阱，捕获对象后加快播放速度。其陷印位置是手动重新定位的。
最后的排列有 11 颗珠子，描绘了进行这项实验的犹他大学的标志。该系统还允许同时使用全息和常规陷阱。在这里，两行全息陷阱由作员定义和控制。
在两行之间定义了一个额外的常规陷阱。悬浮在去离子水中的微球被捕集阱结合。在相同情况下，中心拉延筋被移动到 4.1 微米的最大空间位移，然后回到其原始位置。
但是，当中心拉延筋以每秒 82 微米的速度移动时，会产生这一帧序列。请注意第二张和第三张图像中的运动模糊。观看此视频后，您应该对如何在同一设置中布置和对齐具有独立全息和法线陷印的双光阱系统有很好的了解。
不要忘记，使用高功率激光器可能非常危险，并采取预防措施，例如佩戴适当的防护眼镜。
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概述
本文描述了一种集成常规和全息光学捕获技术的系统，能够操控多个陷阱。这种创新方法能够创建复杂的折射粒子几何排列，同时允许对生物酶活性进行高速、高分辨率的测量。
关键研究组成部分
科学领域
- 光学捕获
- 生物物理学
- 酶活性测量
背景
- 传统的光学捕获方法在同时操控多个物体方面受到限制。
- 全息光学捕获在定位和操控粒子方面提供了更高的灵活性。
- 结合这些技术可以提高测量精度和速度。
- 新用户在光学元件的设计和对齐方面可能面临挑战。
研究目的
- 开发一个允许同时进行常规和全息光学捕获的系统。
- 实现对多个折射物体在三维空间中的操控。
- 促进对生物酶活性的快速测量。
使用的方法
- 光学捕获组件的组装和对齐。
- 光学组件位置的测量。
- 在指定位置安全安装组件。
- 对光学系统进行对齐以实现有效的捕获。
主要结果
- 该系统成功集成了常规和全息捕获技术。
- 它允许同时定位多个折射物体。
- 实现了酶活性的高速测量。
- 用户在初始设置时报告了挑战，但认识到了系统的优势。
结论
- 开发的系统增强了光学捕获技术的能力。
- 它为研究生物过程的研究人员提供了显著的优势。
- 新用户可能需要进一步培训来掌握设置。
常见问题
Executive Industry Relevance
Optical trapping systems enable precise manipulation of refractive objects for high-resolution force and motion measurements at nanometer and piconewton scales. Integrating conventional and holographic trapping allows simultaneous multi-object positioning and real-time 3D control, supporting mechanistic studies of molecular interactions and cellular mechanics. This capability enhances predictive confidence in target validation by enabling quantitative assessment of binding forces and conformational changes under physiological conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct measurement of molecular binding forces and complex formation dynamics.
- Operational Value: Provides functional target validation by measuring piconewton-scale forces generated by molecular motors or enzyme activity in real time.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating quantitative force-displacement data that correlates with target engagement and mechanism of action.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enabling controlled manipulation of dielectric beads or cellular organelles as force sensors.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through precise positioning and simultaneous readout of trap position relative to object motion.
- Scalability: Supports screening readiness via holographic pattern generation for parallel trapping of multiple objects in the field of view.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance by enabling measurement of nanoscale mechanical properties in primary cells or tissue-derived models under near-physiological conditions.
- Mechanistic De-risking: Connects discovery observations to preclinical validation through force-production readouts that inform target modulation strategies.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by quantifying how perturbations affect mechanical output in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The system fits within the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing quantitative biophysical readouts that inform target prioritization and mechanism elucidation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct measurement of intermolecular forces and conformational changes in protein complexes.
- Screening: Delivers assay readiness through high-speed, high-resolution position tracking of trapped objects, facilitating reliable compound evaluation via force-based readouts.
- Analytics: Generates nanometer-scale displacement and piconewton-force measurements that allow teams to compare conditions and assess target modulation efficacy.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling mechanical phenotyping in disease-relevant cellular systems, supporting biomarker alignment for mechanotransduction pathways.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for multi-parametric analysis across projects, reducing redundant setup and enabling cross-team standardization of force measurement protocols.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence through direct, label-free measurement of mechanical outputs that reduce ambiguity in target mechanism interpretation.
- Operational Value: Ensures standardization and scalability via holographic trapping patterns and simultaneous multi-object control, improving throughput in force measurement campaigns.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by enabling early de-risking of targets through quantitative force data, reducing late-stage failure due to unanticipated mechanical liabilities.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by delivering objective, quantitative data on target engagement strength and conformational dynamics across candidate molecules.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, laser safety, and beam path optimization for dual-wavelength trapping systems.
- Depends on stable optical bench infrastructure, precision translation stages, and infrared-compatible components for 980 nm and 1064 nm laser integration.
- Necessitates cross-team standardization of trapping protocols, calibration procedures, and data analysis pipelines for force and displacement readouts.
- Involves adaptation considerations when transitioning from bead-based assays to primary cells or tissue explants due to varying refractive indices and sample viability constraints.
- Limited by alignment complexity and potential aberrations from mismatched beam profiles, particularly when holographic patterns interact with spatial light modulator geometry.
