小鼠提睾肌微循环中周围干细胞迁移分析的活体显微镜观察

本实验的总体目标是体内可视化干细胞与内皮细胞的相互作用。首先，将股动脉导管插入镇静动物体内，以实现动脉内通路；第二步，对外侧肌进行外科处理，为活体荧光显微镜观察做好准备。

接下来，将目标干细胞群体通过股动脉导管注入。最终，可对过继转移的干细胞与主要骨骼肌微循环内皮细胞之间的相互作用进行可视化观察和定量分析。该方法有助于解答再生医学领域的一些关键问题，例如：治疗性应用的干细胞在活体生物体内的迁移过程是如何被调控的？

开始显微手术前，将连接至1毫升注射器的导管中装入0.9%氯化钠溶液。然后，轻轻剃除一只20至25克重的雄性小鼠右侧阴囊的前表面，以及右大腿和腹股沟区域的毛发。用湿润的棉签收集所有松散的毛发，随后将小鼠仰卧位放置于一块有机玻璃制成的定制观察台上；该观察台由一块底板和一块位于底板边缘用于抬高后肢及阴囊的第二块板组成。

用弹性手术巾固定动物四肢后，将手术台置于加热垫上，以维持动物体温在37摄氏度。然后使用10至16倍放大倍数的解剖显微镜，用剪刀在右大腿处从膝部至腹股沟区域、股血管前方稍前位置做初始切口。辨认股动脉，并向近端追踪，将动脉从周围软组织中游离出来。

然后使用热灼术识别并切断通向左侧睾丸的一条主要动脉分支。在左侧睾丸浅层放置一根6-0 Prolene固定缝线。随后识别并使用热灼术处理大腿内侧走行的一条较大动脉分支。

接下来，使用轻柔牵引，在右大腿远端结扎股动脉，然后尽可能靠近动物体中线的位置，在近端股动脉周围放置一缝线。现在，在股动脉周围打一个松结，但不要拉紧。随后对缝线施加轻柔牵引，以形成动脉扭曲。

建立血管扭曲后，使用显微剪刀小心地修剪动脉，特别注意不要损伤股静脉。接着，将先前准备好的微导管插入切口。仔细松解血管扭曲部分，以利于导管通过。

导管内应立即可见动脉血流。将导管缓慢向前推进数毫米，超过先前发生折曲的位置。然后扎紧已准备好的结扎线，以固定导管。

现在用氯化钠溶液轻轻冲洗导管，然后抽吸溶液以确认导管位置正确。使用一段胶带将导管进一步固定在手术台上。在导管充分固定并移开后，切开右侧阴囊腹侧上方的皮肤和筋膜。

注意操作时避免任何器械接触深层组织。将切口向上延伸至腹股沟皱襞，向下延伸至阴囊远端。随后，在不接触提睾肌鞘本身组织的前提下，仔细分离其上方的软组织和结缔组织。

然后在提睾肌远端放置一根6-0 Prolene缝线作为牵引线，以轻微拉伸该肌肉。接着，轻柔地将肌肉向头侧和前侧牵拉，切除肌鞘下方残留的软组织。在完全游离周围结缔组织后，使用剪刀从提睾肌鞘头侧边缘开始切开，并从该切口沿肌肉远端方向延长切口。

在使用热灼法封闭附着于提睾肌上的小血管后，用剪刀剪断提睾肌与睾丸之间的其余连接组织。此时打开的提睾肌将平铺于载物台上。接着在组织边缘放置四根6-0 Prolene缝线作为固定缝线，并用弹性铺巾将其固定。

从此处开始，为了展开提睾肌组织，使用1毫升注射器持续用PBS润湿组织。样本静置15分钟后，通过左侧股动脉注射0.05至0.1毫升的1%罗丹明葡聚糖，以增强微血管的对比度。现在，将小鼠和载物台移至电荷耦合器件下进行观察。

连接摄像机的荧光显微镜经改装用于落射照明，操作时需特别注意避免移位股动脉导管。调整水浸物镜以充分观察chma微循环，并随机选定六条后毛细血管小静脉（ES），用于后续分析干细胞牢固黏附情况。随后，用1毫升注射器吸取200微升先前标记的荧光供体骨髓干细胞。

轻轻敲击注射器以重悬细胞，混匀细胞悬液，然后通过股动脉导管以每次40 µL进行注射，共连续注射五次。在细胞注射后立即记录干细胞的滚动行为。将滚动定义为细胞沿内皮壁移动时速度降低超过50%，并结合典型的细胞黏附与脱离运动。

完成活体显微镜观察后，小心取出提睾肌并保存，以备后续分析。通常情况下，直接注射的干细胞或祖细胞与提睾肌微循环中血管内皮的相互作用是一种罕见事件，仅发生在毛细血管后微静脉中，这得益于荧光标记。如黑色箭头所示的滚动细胞，以及如白色箭头所示的牢固黏附的干细胞，均可与静脉中循环的内源性白细胞明确区分。

由血流速度和管壁剪切率所代表的微循环状况，在接受不同趋化因子处理的各个实验组之间通常没有显著差异。对骨骼肌组织局部施加不同的趋化因子或炎症反应介质，例如基质细胞衍生因子-1α（SDF-1α）或肿瘤坏死因子-α（TNF-α），能够模拟特定的微环境条件。

这些条件会因所应用的特定趋化因子或介质以及注射的干细胞群体不同，而在不同程度上增强干细胞与内皮细胞之间的相互作用。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过活体显微镜观察CreER肌肉微循环，从而在体内可视化干细胞与动脉细胞之间的相互作用。