从培养的人类神经前体细胞分化获得的神经元进行激光显微切割分离

以下实验的总体目标是建立一种人类神经元培养模型，鉴定神经元标志物，并分离出高纯度的神经元群体用于基因表达分析。该目标首先通过扩增人类神经前体细胞，以持续获得前体细胞供应来实现。第二步，将神经前体细胞培养在包被有黏附因子的培养皿中，并添加分化补充物和神经营养生长因子，以诱导其分化。

接下来，进行神经元标志物的免疫荧光染色，以确定分化后的神经前体细胞的命运。最后，对培养在PEN膜载玻片上的神经元进行激光捕获显微切割，以利于神经元特异性基因表达分析。获得的结果显示，分化后的神经前体细胞主要具有神经元特性。

根据免疫荧光染色和神经元捕获结果，通过激光显微切割技术，可将人神经前体细胞扩增并分化为富含神经元的培养物。对于体外研究，由于这些培养物中仍含有部分胶质细胞，我们可利用激光显微切割技术分离出高纯度的神经元群体。

演示这些操作的是我们显微镜核心设施的高级研究助理 Ron Bouchard。开始该操作时，将一份来自胎儿大脑组织分离的人类神经前体细胞冻存株快速复苏至 37 摄氏度，然后将其加入含有 15 毫升预热的神经基础培养基的 T75 培养瓶中，该培养基中添加了 10 纳克/毫升的 EGF 和 FGF。细胞培养三天后，将神经球转移至一个 15 毫升离心管中，以 1000 转/分钟离心 5 分钟形成细胞沉淀。离心结束后，弃去上清液，保留约 100 微升培养基，然后将细胞沉淀转移至一个 Eppendorf 管中。

100 微升的细胞沉淀足以分种到两个 T 75 培养瓶中。若细胞量较少，则应减少培养瓶的数量，因为神经前体细胞无法在过稀的条件下增殖。若分种较稀，则需通过反复吹打 50 次，将神经球彻底解离为单细胞悬液，操作时保持 200 微升枪头紧贴管底。

使用显微镜观察神经球解离的进展情况。随后，将细胞悬液等量分装至两个 T75 培养瓶中，一个用于继续扩增，另一个用于诱导分化。

然后将培养瓶放入培养箱孵育。通过离心更换标记为扩增的培养瓶中神经前体细胞的培养基，随后弃去旧培养基并加入新鲜培养基。

每四到五天更换一次培养基，直至神经球达到其原始大小，即 300 至 500 微米。为开始将神经前体细胞分化为富含神经元的培养物，将单个盖玻片放入 24 孔板的每个孔中，并通过向每个孔加入 500 微升浓度为每毫升 100 微克的多聚-L-赖氨酸进行包被。在室温下孵育培养板 30 分钟，然后吸除多聚赖氨酸溶液。

用去离子无菌水冲洗培养板，然后再次吸干。接着，向培养板的各孔中加入500 µL浓度为5 µg/mL的小鼠层粘连蛋白（mouse laminin），孵育30分钟。孵育结束后，用PBS洗涤各孔，再次吸干，并置于组织培养超净台中使其干燥。细胞传代后第四天，将标记为用于分化培养的小神经球从培养瓶转移至包被好的24孔板中。

将神经球以每孔约500个的密度接种，在孵育6小时神经球贴壁后，移除增殖培养基，加入分化培养基。分化培养基由Neurobasal培养基、B27添加剂、N-G-F-B-D-N-F-D-B-C和视黄酸组成。将培养板放回培养箱中继续培养，神经前体细胞在神经元分化培养基中培养两周后，即可获得富含神经元的培养物。

用 PBS 冲洗神经元一次，然后在 4%多聚甲醛中固定 30 分钟。固定后，用 PBS 洗涤细胞三次。随后，将细胞在室温下用通透缓冲液孵育 60 分钟，以进行免疫染色前处理。

接着，将多克隆抗体和单克隆抗体加入含3% BSA的PBS中，并分别加入各孔。每孔加入不同的抗体组合，4°C摇床上孵育过夜，次日早晨继续孵育。用PBS清洗盖玻片三次，然后在室温避光条件下，加入抗兔IgG-PSI3和抗小鼠IgG-FITC二抗，孵育90分钟。

用 PBS 清洗盖玻片三次。然后在载玻片上滴加 10 微升封片剂。从培养皿中取出盖玻片，并将其倒置在封片剂上。

轻轻擦去多余的封片剂，并用指甲油封固边缘。为准备显微切割，首先将神经前体细胞在聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白包被的PEN膜上分化为富含神经元的培养物。

所有后续步骤均需在无 RNA 条件下进行。接着，使用 Histo Gene 染色剂对培养物进行染色，以观察细胞；Histo Gene 将细胞核染成紫色，细胞质染成浅粉色，从而可根据其独特的形态学特征轻松区分神经元与胶质细胞。将载玻片先后置于 75% 乙醇和去离子无菌水中各 30 秒。

然后将玻片置于Kimwipe纸巾上，加入200 µL Histo Gene，静置20秒。接着将玻片依次放入去离子无菌水、75%乙醇、95%乙醇和100%乙醇中，每种溶液中各放置30秒。

然后置于二甲苯中5分钟，并在Kim擦拭纸上干燥5分钟。接着将PEN膜载玻片覆盖于普通载玻片上，放入Veritas激光显微切割系统（LCM）中，并使用软件操作。采集导航图像，以识别不含星形胶质细胞的纯神经元细胞区域。

使用绘图工具标记这些神经元。接下来，通过计算机控制的精确度和自动化，以两步法进行激光显微切割。第一步，以70毫瓦的激光功率和2,500微秒的脉冲，向多个位点发射红外激光，使膜与帽结合。

接下来，使用紫外切割工具在10毫伏的低功率设置下切除标记区域。通过上述步骤的组合，可将标记区域选择性地捕获到LCM捕获宏帽上。当捕获的神经元数量达到至少100个时，使用显微镜将膜从帽上取下，并将其放置于试管中。

使用 P OPU RNA 提取试剂盒从激光显微切割样本中分离总 RNA，并用 DNase 处理。随后按照试剂盒说明书，利用核糖扩增 RNA 扩增试剂盒对提取的 RNA 进行扩增。最后，使用 TAC MAN 探针进行实时反转录聚合酶链式反应分析，以检测人神经丝重链。

通过使用多聚L-赖氨酸和层粘连蛋白包被的表面，并结合特定分化的生长因子，对培养4天的神经球进行诱导分化，可获得富含神经元的培养物。两周后，在低密度区域可获得如图所示的富含神经元的培养物。这些细胞也可能分化为星形胶质细胞，如图中所示。

星形胶质细胞的分化也可通过使用生长因子CNTF来诱导，而非用于神经元分化的因子。神经元分化可通过针对特异性神经元标志物new N和synapsin、乙酰胆碱酯酶以及突触素、BDNF和GAP-43的抗体进行鉴定。阳性染色表明分化后的细胞具有原代神经元的特征。此外，星形胶质细胞可通过STAT3和GAP的免疫染色阳性结果进行鉴定。

对在聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白包被的PEN膜载玻片上分化的神经元进行激光显微切割。图中所示为经组织染色剂染色的神经元。为观察细胞，可使用激光勾勒出目标细胞的轮廓，激光会熔化PEN膜，使其粘附至上方放置的收集帽上。最终，可将大量细胞依次勾勒并收集至同一个收集帽中，用于DNA或RNA分析。

观看本视频后，您应能充分了解如何利用激光捕获显微切割技术分离神经元。