神经元的分化的人类Neuroprogenitor细胞培养激光捕获显微切割

以下实验的总体目标是开发人类神经元培养模型，识别神经元标志物并分离纯神经元群进行基因表达分析。这是通过首先扩增人类神经祖细胞以产生祖细胞的持续供应来实现的。作为第二步，在分化补充剂和神经营养生长因子存在下，在包被有附着因子的培养皿中培养神经祖细胞。

接下来，对神经元标志物进行免疫荧光染色以确定分化的神经祖细胞的命运。最后，对在 PEN 膜载玻片上培养的神经元进行激光捕获显微解剖，以促进神经元特异性基因表达分析。获得的结果表明，分化的神经祖细胞本质上主要是神经元的。

基于神经元的免疫荧光染色和捕获。通过激光捕获显微切割，人神经祖细胞可以扩增并分化为富含神经元的培养物。对于体外研究，由于这些培养物含有一些 gal 细胞，我们可以使用激光捕获显微解剖来分离纯神经元群。

演示这些程序的是我们显微镜核心设施的高级研究助理 Ron Bouchard。要开始此程序，通过快速加热至37摄氏度来恢复从胎儿脑中分离的人类神经祖细胞的冷冻原液，然后将它们添加到含有15毫升预热神经基础培养基的T 75中，补充有10纳克/毫升、EG、F 和 FGF。细胞培养 3 天后，将神经球转移到 15 毫升试管中，离心后以 1000 RPM 离心 5 分钟沉淀，弃去上清液，留下约 100 微升培养基，将细胞沉淀转移到 einor管中。

一个 100 μL 的细胞沉淀足以分成两个 T 75 培养瓶。如果较少，则减少烧瓶的数量，因为神经祖细胞无法增殖。如果裂成薄片，则通过上下移液 50 次，同时将 200 μL 吸头靠在管底，将神经球彻底分解成单细胞悬液。

使用显微镜目视检查进度，以确保神经球解离。接下来，将细胞悬液均匀分液并加入到两个 T 75 培养瓶中。一个用于持续扩展，另一个用于差异化。

然后孵育培养瓶。通过离心改变培养瓶中标记扩增的神经祖细胞的培养基。然后丢弃旧介质并添加新介质。

每 4 到 5 天更换一次培养基，直到神经球达到 300 到 500 微米的原始大小。为了开始神经祖细胞分化为富含神经元的培养物，将单个盖玻片放入 24 孔板的每个孔中，并向每个孔中加入 500 微升 100 微克/毫升的多聚 L 赖氨酸。将培养皿在室温下孵育 30 分钟，然后吸出多元醇赖氨酸溶液。

用去离子无菌水冲洗板并再次吸出。接下来，用 500 微升（每毫升 5 微克）小鼠层粘连蛋白包被板的孔，并在孵育后孵育 30 分钟，再次用 PBS 抽吸清洗孔，并在组织培养罩中晾干。分裂细胞 4 天后，将小神经球从标记用于分化的培养瓶转移到包被的 24 孔板中。

孵育 6 小时后，当神经球附着在培养皿上时，每孔添加约 500 个神经球的密度，去除增殖培养基并添加分化。培养基由神经基础培养基 B 27、补充剂 N-G-F-B-D-N-F-D-B-C 和视黄酸组成。在神经元分化培养基中培养神经祖细胞两周后，将板放回培养箱中，获得富含神经元的培养物。

在 PBS 中冲洗神经元一次，然后在 4% 多聚甲醛中固定 30 分钟。固定后，用 PBS 冲洗细胞 3 次。然后，通过在室温下将细胞与可渗透缓冲液孵育 60 分钟来制备用于免疫染色的细胞。

接下来，将 PBS 中 3% BSA 中的多克隆抗体和单克隆抗体添加到孔中。向每个抗体中加入不同的抗体对，第二天早上在 4 摄氏度下在摇床中孵育过夜。用 PBS 清洗盖玻片 3 次，然后在室温下与抗兔 P SI 3 和抗 US fitzy 二抗在室温下避光孵育 90 分钟。

用 PBS 清洗盖玻片 3 次。然后将 10 微升封固剂放在载玻片上。从培养皿中取出盖玻片，将其倒置在封固剂上。

轻轻擦去多余的封固剂，并用指甲油密封边缘。为了首先准备用于显微切割的细胞，将神经祖细胞分化为在 PEN 膜上富含神经元的培养物。涂有聚 L 赖氨酸和层粘连蛋白的载玻片。

在无 RNA 的条件下执行所有后续步骤。接下来，使用 histo 基因染色剂对培养物进行染色，以观察细胞组织基因对细胞核进行紫色染色，细胞质呈浅粉红色，从而很容易通过不同的形态区分神经元和神经胶质细胞。将玻片放入 75% 乙醇和去离子无菌水中 30 秒。

然后将载玻片放在 Kim 抹布上。加入 200 μL 组织基因并等待 20 秒。接下来，将玻片依次放入去离子无菌水、75% 乙醇、95% 乙醇和 100% 乙醇中各 30 秒。

然后放入二甲苯中 5 分钟，用 Kim 抹布擦干 5 分钟。然后将 PEN 膜载玻片放在常规载玻片上，并使用该软件将它们放入 Veritas 激光捕获显微解剖系统或 LCM 中。拍摄路线图图像以查找没有星形胶质细胞的纯神经元群的区域。

使用绘图工具标记这些神经元。接下来，使用计算机控制的精度和自动化技术分两步对这些区域进行激光捕获。首先，以 70 毫瓦的激光功率设置和 2， 500 微秒的脉冲向多个点发射 IR，以将膜连接到盖子上。

接下来，使用 UV 切割工具以 10 毫伏的低水平设置切除标记区域。这些过程的组合选择性地捕获标记区域到捕获 LCM 宏帽上。当捕获了至少 100 个神经元时，使用显微镜从盖子上取下膜并将其放在试管上。

使用 P OPU RNA 分离试剂盒从 LCM 样品中分离总 RNA，并用 DNA 处理。然后按照试剂盒中的说明使用 ribo 扩增 RNA 扩增试剂盒扩增分离的 RNA。最后，使用 TAC MAN 探针进行实时 R-T-P-C-R 分析，以检测人神经丝重链。

通过使用聚 L 赖氨酸和层压板包被表面结合分化特异性生长因子分化 4 日龄的神经球，获得富含神经元的培养物。两周后，在低密度区域获得此处所示的富含神经元的培养物。这些细胞可能会分化成星形胶质细胞，就像这里看到的一样。

也可以使用生长因子 CNTF 而不是用于神经元分化的生长因子来指导星形胶质细胞分化。可以使用针对特定神经元标志物、新 N 和突触素、乙酰胆碱酯酶和突触素的抗体以及 BDNF 和 GAAP 43 阳性染色证明分化细胞具有原代神经元的特征。此外，可以通过阳性 stat 3 和 GAP 免疫染色来识别星形胶质细胞。

在聚 L 赖氨酸和层粘连蛋白包被的 PEN 膜上分化的细胞进行神经元的激光捕获显微解剖，此处显示的载玻片是用组织染色染色的神经元。为了观察细胞，可以使用激光勾勒出感兴趣的细胞，激光熔化 PEN 膜，使其粘附在位于其上方的捕获帽上。最后，可以将许多细胞勾勒出轮廓并捕获到同一个帽上，用于 DNA 或 RNA 分析。

看完这个视频，你应该对如何使用激光捕获显微切割分离神经元有了很好的了解。