弱散射样品的数字同轴全息显微术

以下实验的总体目标是重建一串游动细菌细胞在空间几何中的三维位置。首先将细菌培养至适当浓度，以获得适合成像的样品；其次，设置并校准LED光源，从而获取全息图像。

接下来，使用重建软件以获取一串细菌细胞的三维坐标。结果表明，该方法能够基于全息成像重建细菌细胞的三维位置和构型。与共聚焦显微镜等现有方法相比，该技术的主要优势在于能够在高帧率下实现无标记的三维成像。

首先，取10毫升KTY培养基，加入来自链球菌V4051197冻存菌种的冰晶进行接种，将初始培养物置于35摄氏度、150 RPM条件下，在摇床中过夜培养。待菌液生长后，取500微升饱和初始培养物接种至10毫升新鲜KTY培养基中。在35摄氏度、150 RPM条件下继续培养3.5小时，直至菌液在600纳米波长处的光密度值达到0.8至1.0。

这相当于每毫升约五乘以十的八次方个细胞。然后将细胞按1:400的比例稀释于新鲜培养基中，以获得最终浓度约为每毫升100万个细胞。接下来，用凡士林填充注射器，并在显微镜载玻片上涂抹一个高度为1毫米的油脂环。

然后在中央滴加一滴样品溶液。将盖玻片轻轻覆盖在样品上，并轻压盖玻片以密封边缘，确保液体与载玻片和盖玻片均接触。最终形成的样品室深度应为100至200微米。

将60倍油镜旋转到位，并滴加一滴镜油。然后将样品室放置在显微镜载物台上，使盖玻片朝下。确保盖玻片与物镜之间无气泡产生。

聚焦于样品室的底面，然后调节聚光镜。接着关闭标准照明光源，将LED灯头放置在显微镜聚光镜孔径光阑后方。确保聚光镜处于明场模式，并将LED电源调至最大输出功率。

然后将聚光镜光圈完全关闭，并微调LED在其支架中的位置，直至照明光斑居中对准物镜光圈。打开计算机，随后将光路切换至显微镜的相机接口。在图像采集软件中，将帧率调整为每秒30帧，图像尺寸调整为512×512像素。

检查图像强度直方图，确保图像没有任何部分过饱和或曝光不足。帧曝光时间应在保持良好对比度的前提下尽可能缩短。如果细胞聚集在界面附近，应重新对焦显微镜，使细菌细胞略微失焦。

为了获得最佳重建效果，细胞应位于距焦平面约10至30微米的位置。重新对焦后，采集一系列视频帧，并保存为未压缩的AVI文件。然后启动可免费下载的DIHM软件，将视频帧转换为数值重对焦的图像堆栈。

软件提供了示例帧以开始重建。将目标帧及其背景分别作为独立的图像文件输入到相应框中。背景图像代表了全息图不存在时视频的背景，将用于抑制可能干扰全息定位与分析的任何固定模式噪声。

接下来，在全局设置框中输入输出堆栈参数。首先，在“起始焦距”中输入第一帧的轴向位置。然后，在“步数”中输入重建堆栈中的切片数量，最后，在“步长”中输入堆栈中每层切片之间的实际距离。

为了使用示例数据以正确的比例重建物体，应将步长设置为与横向像素间距相同。该值应为 0.233 微米。接下来，输入相机的照明波长、介质折射率以及横向采样频率。

在“微米像素数”框中，可通过将物镜放大倍数除以相机传感器的像素尺寸来计算相机的横向采样频率。以示例数据为例，计算结果为 60 倍除以 14 微米，等于 4.29 像素/微米。然后，如果全息图中物体中心呈暗色，请按下翻转 Z 梯度按钮。

这将应用一个滤镜，用于提取原始样本中焦平面以下的物体。然后开启带通滤波器，该滤波器用于抑制噪声像素对图像的贡献。它会在每张图像切片生成后立即被应用。

接下来，检查中间输出开关是否处于关闭状态，并确保将它们打开。当这些开关打开时，将生成两个视频。第一个输出是重聚焦图像序列，文件名以 stack a V 结尾。第二个序列是实际的梯度运算结果，文件名以 gradient a VI 结尾。理想情况下，第二个序列中目标物体将以明亮物体的形式在暗背景上突出显示。

设置完所有参数后，按主窗口中的“运行”按钮以执行命令。选定的帧将显示在软件的主窗口中。然后使用图像左侧工具栏中的放大镜工具进行放大或缩小。

使用矩形工具选择一个感兴趣区域（ROI），并尽可能在矩形内包含更多的全息图条纹，以优化重建效果。最后，按下处理按钮以生成两个独立的图像堆栈。使用该网站提供的 Image J 软件检查生成的堆栈。

如果在梯度图像序列中可以清晰看到目标对象，请继续进入渲染部分以提取对象坐标。开始渲染时，按下特征提取按钮以启用 X、Y、Z 坐标定位功能。然后输入输出坐标文件的路径和扩展名，在输出坐标样式框中选择 POV ray 样式。

这将使程序生成一个对象文件，该文件可使用免费的 POV-Ray 光线追踪软件包进行可视化，该软件可从此网站获取，并可对图像进行重新处理以提取对象的坐标。程序会将选定 ROI 中的一系列 X、Y、Z 坐标写入输出坐标框中指定的文件名。提取对象坐标所需的时间明显长于生成图像堆栈所需的时间。

确保重建代码提供的示例 POV 光线文件与输出坐标文件位于同一文件夹中。编辑示例点 pov 文件，将该行中引号内的文件名替换为重建代码生成的数据文件名称，即包含我的文件 NC。

然后在 POV Ray 中自定义相机位置、光照、纹理和渲染选项。完成后，单击运行按钮以渲染位图图像。这是一张链球菌细菌链的瞬时定向图像。

末端位于焦平面上。在此构型中，物体难以重建，通常在焦平面附近产生一个近似斑点的图像。此处显示的是一幅正确渲染的图像，代表了本系列中大多数帧的情况，其中链状结构并非直接沿光轴方向排列。

物体的形状和位置在右侧面板所示的渲染图中被真实再现。一旦掌握了该技术，即可在数分钟内完成。