小鼠模型视网膜血管分析的胰蛋白酶消化方案

本实验的总体目标是分离视网膜血管网络。首先对分离的视网膜进行一系列水洗，实现初步处理。第二步，将视网膜在37°C条件下用胰蛋白酶消化约1至1.5小时，具体时间取决于视网膜的大小。

接下来，通过进一步的水洗和在显微镜下的解剖分离血管系统。最终，可以观察到诸如微动脉瘤、毛细血管退化以及内皮细胞与寄生虫比例异常等病理性血管改变。因此，与制备视网膜铺片等现有方法相比，该“尝试与消化”方法的主要优势在于能够以极高的清晰度完整显示整个血管网络。

通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为该技术操作难度较高，且难以稳定重复。对该方法进行可视化演示至关重要，因为仅通过文字描述很难掌握血管分离步骤。对于开展视网膜血管生物学研究（例如糖尿病视网膜病变等疾病）的实验室而言，这是一项非常有价值的工具。本次技术演示将由我实验室的优秀医学生 Jonathan Chow 进行。

将去核的小鼠眼球在10%中性缓冲甲醛中固定24小时后，将眼球置于培养皿中，并加入少量水覆盖。开始解剖时，使用一对解剖剪在角膜上小心地进行初步切割。然后，用直镊夹住已切开的部位，同时用剪刀沿角膜与巩膜的交界处剪开，以去除角膜。

接下来，使用精细的弯头和直头镊子，缓慢而小心地将巩膜和脉络膜从视网膜表面向视神经方向剥离。然后移除晶状体以及残留的虹膜组织和碎片，以帮助将神经视网膜层与血管分离。

向24孔板中加入约500微升45微米滤过的水，将视网膜放入孔中，室温下轻轻振荡4至5小时，每30至60分钟更换一次水。随后在水中继续于室温下轻轻振荡过夜。次日，移除水并加入3%胰蛋白酶，在显微镜下检查以确保孔内无残留碎片。为避免脉络膜黏附，随后将组织在37摄氏度孵育1至1.5小时，孵育过程中保持轻微振荡或不振荡。

当组织开始出现解体迹象时，将培养皿置于显微镜载物台上，避开视网膜区域。小心地加入胰蛋白酶以分离血管系统。首先，使用镊子向视网膜中加入过滤水。

剥离内界膜，该膜呈现为一层薄而透明的结构。轻轻振荡培养板。五分钟后，再次将培养板置于显微镜载物台上，并小心更换水分，避免损伤视网膜，以帮助血管网络从附着的视网膜组织中分离。

按照上述方法清洗视网膜，直至最后一次清洗后水中几乎无残留碎片。通常，去除所有非血管组织是该操作中最困难的部分。以下技术可依次使用或单独使用，以帮助分离血管网络。一个重要的技巧是在操作视网膜前，将所有工具浸入胰蛋白酶中润湿。

这有助于防止组织黏附到设备上。用预留的胰蛋白酶包被一支200微升微量移液器吸头，然后在靠近视网膜血管并朝向血管的方向反复吹打液体，产生轻柔的搅动。如果无血管组织仍然难以去除，可在视神经部位使用经胰蛋白酶包被的微量移液器吸头，并轻轻上下吹打整个血管网络，以帮助分解无血管组织。

最后，可使用精细镊子轻轻将血管网络从水中提起，以去除任何附着的非血管成分。最终结果应为完整且无碎片的视网膜血管网络。

为了观察血管系统，首先在干净的载玻片上滴加一滴水。然后在显微镜下将消化后的血管转移至水中进行检查。若血管的贴壁状态发生折叠或展开，折叠的血管会导致视野不清。

染色后，如果组织发生折叠，需添加更多的水并轻轻晃动载玻片以促进其展开。然后使用微量移液器缓慢吸除多余的水分。成功操作的最终结果是获得一个完整的小鼠视网膜血管网络的平铺标本，其结构保持完整，并用伊红、曙红和伊红（hemat, toin, eoin）染色。

如图所示，视网膜中内皮细胞与周细胞之间存在明显分化。由白色箭头指示的内皮细胞核呈椭圆形或长形，完全位于血管壁内。黑色箭头所指示的周细胞核较小、呈球形、染色深，通常沿毛细血管壁突出分布。

胰蛋白酶消化是分析糖尿病动物模型中血管病理的常用方法。该图像显示了DB DB小鼠（2型糖尿病模型）视网膜中毛细血管退化的示例，白色箭头所指示处即为退化区域。尽管该方法已针对小鼠视网膜进行优化，但在大鼠视网膜中也可获得类似结果。

需要注意的是，如图所示的大鼠视网膜比小鼠视网膜更大，因此使用12孔板而非24孔板。大鼠视网膜的血管网络也比小鼠的更不易受损。尽可能彻底地去除非血管组织极为关键。

任何残留物都会导致非特异性染色，从而影响血管系统的清晰观察。例如，在此图像中，可见未能完全去除非血管组织。同样，在封片时保持视网膜展开也非常重要，以改善血管结构的可视化效果。

此图像显示了一次不成功的血管平铺制备。在掌握这一技术难度较高的操作后，组织透明化与消化处理可成为一种极为有效的方法，实现对整个血管网络的详细可视化。

通过改进小鼠眼部的这一技术，研究人员可以利用基因改造小鼠来研究多种能够调控视网膜血管系统的信号通路，从而帮助我们理解各种视网膜疾病的病理生理机制。由此，我们能够进一步加深对糖尿病性视网膜病变等疾病病理机制的认识。通过对DVDB小鼠等小鼠模型的研究，最终有望发现靶向视网膜血管系统的新潜在治疗干预手段。