Name: 胰蛋白酶精华协议分析视网膜血管小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 学习胰蛋白酶消化法分离小鼠视网膜血管网络，用于清晰观察微动脉瘤和毛细血管退化等病理变化。该方法优化了血管可视化技术，有助于研究糖尿病视网膜病变等疾病的病理机制。

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本研究部分得到了美国国立卫生研究院（NIH RO1-EY019951，AAF）、伊利诺伊州防盲协会（JCC，AAF）、防盲研究组织（Research to Prevent Blindness，RPB）向眼科系提供的无限制资金（纽约）以及 RPB 医学生奖学金（JCC）的资助。

1. 视网膜制备
<ol>
 <li>摘除小鼠眼球。用一只手撑开眼睑，使眼球暴露。另一只手持弯头镊子（弯曲面朝上），在眼眶的上方和下方施加压力，直至眼球突出。然后在眼球后部轻轻闭合镊子，并以连续动作提起，将眼球摘除。</li>
 <li>用10%中性缓冲福尔马林固定眼球，至少24小时。</li>
 <li>将眼球置于盛有PBS溶液的小培养皿中。</li>
 <li>在显微镜下小心分离视网膜，注意避免造成较大撕裂。先用解剖剪在角膜上做初始切口。然后用直头镊子夹住切口处，继续用剪刀沿角膜与巩膜交界处剪开，去除角膜。使用精细的弯头和直头镊子，从视网膜边缘向视神经方向小心剥离巩膜和脉络膜。此步骤需要耐心，过快分离视网膜可能导致撕裂。去除晶状体以及附着在视网膜上的多余虹膜和碎片16。</li>
</ol>
2. 水洗
<ol>
 <li>将视网膜置于24孔板中，并加入约500 μl水（需使用孔径至少为45 μm的滤器过滤）覆盖。</li>
 <li>每隔30分钟至1小时更换一次水，至少更换4–5次。</li>
 <li>在室温下轻轻振荡，于水中过夜孵育。</li>
</ol>
注意： 洗涤步骤非常重要，因为它们有助于将神经视网膜层与血管分离。
3. 胰蛋白酶消化
<ol>
 <li>去除水分，将视网膜置于含有3%胰蛋白酶（Difco 1:250）的0.1 M Tris缓冲液（pH 7.8）中，于37 °C孵育 温和的 不进行振荡。当组织开始出现解离迹象时（约1.5小时），胰蛋白酶消化完成。 注意： 避免剧烈震荡，以免损伤血管系统。 </li>
 <li>小心地使用移液器在显微镜下将胰蛋白酶吸出至另一个孔中，注意避免接触视网膜。此多余的胰蛋白酶可在后续步骤4.3中显微镜下操作血管时再次使用。</li>
</ol>
4. 分离血管系统
<ol>
 <li>向视网膜中加入过滤水。然后尝试用镊子剥离内界膜，必要时可使用剪刀。轻轻振荡5分钟。在显微镜下小心地用移液器吸出水，避免损伤视网膜。</li>
 <li>重复水洗（每次5分钟），以帮助将血管网络从附着的视网膜组织中分离。当水洗后水中几乎无残留物时，水洗步骤即完成。</li>
 <li>现在需要在解剖显微镜下进行精细操作，以进一步分离血管网络。以下为几种实用技术，可根据技术偏好依次或单独使用，以达到理想效果：
 <ol class="lalpha">
 <li>使用200 μl移液器，小心地在血管附近上下吹吸水，使水流冲击血管，产生轻柔振荡。</li>
 <li>使用200 μl移液器，将胰蛋白酶上下吹吸数次，以使移液器内壁均匀覆盖。然后，小心地将整个血管网络上下吹吸一次，以帮助降解非血管组织。 注意： 将移液器尖端对准视神经中心而非血管网络边缘，也可防止血管粘附于尖端。 </li>
 <li>用精细镊子轻轻将血管组织从水中提起，以松动非血管成分。</li>
 <li>如果上述步骤无效，可向视网膜中加入胰蛋白酶以促进组织降解，并在37 °C孵育数分钟。随后去除胰蛋白酶，并重复步骤4.1–4.3。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
注意： 确保将所有会接触血管的器械（如移液枪头、镊子）均用胰蛋白酶包被。这有助于避免脉管组织黏附到器械上。
5. 血管系统的可视化
<ol>
 <li>在干净的载玻片上滴加一滴水。使用200 μl移液器或镊子将消化后的血管转移至水中，确保血管平铺展开。水的表面张力有助于展开现已透明的血管网络。如果组织未能展开，可添加更多水，并轻轻晃动载玻片以促进展开。</li>
 <li>通过移液或使用滤纸缓慢吸除多余的水分。</li>
 <li>让载玻片完全干燥。</li>
 <li>根据适当的染色方案，使用PAS/苏木精或H&amp;E染色法对载玻片进行染色。 注意： PAS/苏木精有助于识别血管壁和细胞核；H&amp;E染色还可显示红细胞。 </li>
 <li>脱水并封片（使用Permount封片介质）。</li>
</ol>

<ol><li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+retinal+vascular+patterns.+I.+Normal+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture.</a> Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).</li>
<li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+vascular+patterns.+VII.+Acellular+change%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Retinal vascular patterns. VII. Acellular change.</a> Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).</li>
<li>Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathologic+and+trypsin+digestion+studies+of+the+retina+in+incontinentia+pigmenti%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti.</a> Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).</li>
<li>Danis, R. P., Wallow, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HRP%2Ftrypsin+technique+for+studies+of+the+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).</li>
<li>Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+studies+of+the+retina+in+a+new+diabetic+model%3B+SHR%2FN%3AMcc-cp+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Yonsei+Med.+J%22%5BJournal%5D)">Morphologic studies of the retina in a new diabetic model; SHR/N:Mcc-cp rat.</a> Yonsei Med. J. 39, 453-462 (1998).</li>
<li>Cuthbertson, R. A., Mandel, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+mouse+retina.+Endothelial+cell-pericyte+ratio+and+capillary+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the mouse retina. Endothelial cell-pericyte ratio and capillary distribution.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1659-1664 (1986).</li>
<li>Laver, N. M., Robison, W. G., Pfeffer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+procedures+for+isolating+intact+retinal+vascular+beds+from+diabetic+humans+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Novel procedures for isolating intact retinal vascular beds from diabetic humans and animal models.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2097-2104 (1993).</li>
<li>Midena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+retina+of+the+diabetic+db%2Fdb+mouse.+I.+Endothelial+cell-pericyte+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">Studies on the retina of the diabetic db/db mouse. I. Endothelial cell-pericyte ratio.</a> Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).</li>
<li>Chapter 30. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Diabetic+Retinopathy%22">Diabetic Retinopathy</a>. , Lippincott Williams and Wilkins. (2005).</li>
<li>Rosenblatt, B., Benson, W. E. Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRosenblatt%2C+B+%22Ophthalmology%22">Ophthalmology</a>. Yannoff, M., Duker, J. , 3rd edition, Mosby, Inc. (2008).</li>
<li>Friedenwald, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+some+problems+of+retinal+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A new approach to some problems of retinal vascular disease.</a> Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).</li>
<li>Podesta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bax+is+increased+in+the+retina+of+diabetic+subjects+and+is+associated+with+pericyte+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro.</a> Am. J. Pathol. 156 (10), 1025-1032 (2000).</li>
<li>Dagher, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+rat+and+human+retinas+predict+a+role+for+the+polyol+pathway+in+human+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).</li>
<li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinovascular+physiology+and+pathophysiology%3A+new+experimental+approach%2Fnew+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).</li>
<li>Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long-term+siRNA+strategy+regulates+fibronectin+overexpression+and+improves+vascular+lesions+in+retinas+of+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats.</a> Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+eNOS-knockout+mice+develop+accelerated+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).</li>
<li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse%3A+a+model+of+vessel+loss%2C+vessel+regrowth+and+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis.</a> Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).</li>
<li>The Jackson Laboratory [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://jaxmice.jax.org/strain/001800.html">http://jaxmice.jax.org/strain/001800.html</a> (2012).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

胰蛋白酶消化是评估视网膜血管结构的常用方法。然而，该技术操作难度较高，若操作不当，容易导致样本大量丢失。此外，该方法在小鼠中尤为困难，这限制了其在常用遗传性眼病动物模型中的应用。本文提供了在小鼠眼球中有效且稳定地进行该操作的技术指导。
该方案中有几个关键步骤。首先，必须小心地分离出视网膜，避免出现大的撕裂，以确保血管网络保持完整。其次，将视网膜在过滤水中过夜清洗非常重要，这有助于将神经视网膜层与血管分离，从而在胰蛋白酶消化后更易于分开。一种可能加快该过程的改进方法是将视网膜置于含有1% Triton X-100的过滤水中处理1–2小时，随后通过一系列水洗去除Triton X，即可在同一天进行胰蛋白酶消化。
在胰蛋白酶消化过程中，必须持续监测视网膜组织，以避免血管组织意外溶解。根据我们的经验，大约1-1.5小时足以完成神经组织的消化，同时保持血管结构完整。对于较年轻的 小鼠，所需时间更短。在胰蛋白酶消化过程中可进行轻柔振荡，以促进血管与其余组织的分离，但并非必需。应注意避免剧烈震荡，以免导致血管撕裂。
<p class=...

观察视网膜血管系统是解析多种眼病（如糖尿病视网膜病变）发病机制的重要方法。该技术能够评估早期血管异常，包括微动脉瘤、毛细血管退化和周细胞丢失8,9。迄今为止，已有多种技术被开发用于分析视网膜血管系统。通过灌注不同染料可使血管显影，但这些方法均存在类似局限性：除非在高压下注射，否则难以完整显示整个视网膜血管网络，而高压注射又可能造成血管破裂和损伤1。利用荧光标记的G型植物凝集素B4（Alexa Fluor 594偶联；I21413；Invitrogen；1:100稀释）对血管内皮进行免疫染色，并结合视网膜平铺片技术，可显示血管的整体结构，但无法清晰呈现毛细血管、基底膜及周细胞的细节。Friedenwald曾指出，可通过过碘酸-希夫（PAS）染色或苏木精-伊红（H&amp;E）染色对视网膜平铺片进行染色以显示血管10。然而，此类染色对血管无特异性，同时也会使非血管组织显色，因而难以区分血管结构。20世纪60年代，Cogan和Kuwabara开发了胰蛋白酶消化法，通过消化视网膜中的非血管成分，使视网膜血管更易于观察1。自此以后，胰蛋白酶消化法已成为分析视网膜血管系统的金标准方法2-5。然而，需要指出的是，已有其他替代技术被用于分离血管系统。渗透裂解法可用于分离血管组织，从而进行组织的生化研究11,12，但该方法并未被广泛用作解剖学研究的主要手段。组织印迹法可用于分离大段微血管，并可用于研究血管的电紧张性结构13。理论上，该技术也可用于研究解剖学变化，因其能较好地保持血管形态。但该方法仅能分离整个血管网络的部分片段。尽管这些方法尚不能取代胰蛋白酶消化法，但值得注意的是，它们各有优缺点，在应用中可互为补充。
胰蛋白酶消化法在技术上具有挑战性，难以稳定地重复操作6,7。此外，已有研究指出，在小鼠模型上进行胰蛋白酶消化尤为困难，特别是当需要完整保留视网膜整体血管结构时6,7。主要挑战包括：（1）视网膜过度消化，导致血管系统及非血管组织均发生丢失；（2）消化不足，需进行大量机械性分离操作，进而可能损伤血管床；（3）非血管组织与血管系统分离不充分，导致非特异性染色。多篇文献已强调了这些技术难点，但尚未提供一种详细且可重复的解决方案14,15。本文将介绍一种逐步操作的方法，详细阐述在小鼠和大鼠视网膜上进行胰蛋白酶消化的技术流程，并针对其中特别困难的步骤提供具体操作建议。技术流程的示意图见图1。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林</td><td>Fischer Scientific</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶（1:250）</td><td>Amresco</td><td>0458-50G</td><td>在 0.1 M Tris 中配制 3% 胰蛋白酶</td></tr><tr><td>TRIZMA 碱</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td>配制 0.1 M Tris 缓冲液（37 ℃ 时 pH 7.8） &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>TRIZMA</td><td>Sigma</td><td>T3253-500G</td><td></td></tr><tr><td>Steritop 无菌真空瓶</td><td>Millipore</td><td>SCGPS05RE</td><td>制备过滤水</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td></td><td></td><td>任何能够清晰观察视网膜的显微镜均可使用。（10x 物镜，工作距离 24 mm 即可满足要求）</td></tr><tr><td>直剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td>尖端尺寸：8 mm；尖端直径：0.2 mm；10 cm</td></tr><tr><td>直型持针钳（不锈钢）</td><td>Dumont #5</td><td>11252-20</td><td>生物学小贴士；0.05 × 0.02 毫米；11 厘米</td></tr><tr><td>弯头镊子（Dumostar）</td><td>Dumont #7</td><td>11297-10</td><td>生物学小贴士；0.07 x 0.04 毫米；11.5 厘米</td></tr><tr><td>杜布诺夫代谢摇床培养箱</td><td>精准科学</td><td>BDG59442</td><td>可选震荡器</td></tr><tr><td>24孔板</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>VWR</td><td>82027-132</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠模型视网膜血管分析的胰蛋白酶消化方案

Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

胰蛋白酶消化法是分析视网膜血管系统的金标准方法1-5。该方法通过消化视网膜中的非血管成分，将复杂的三维视网膜血管和毛细血管网络制备成二维的平铺标本，从而实现对整个血管网络的可视化观察。这使得研究者能够观察多种病理性血管改变，例如微动脉瘤、毛细血管退化以及内皮细胞与周细胞比例异常。然而，该技术操作难度较高，尤其是在小鼠中更为困难；由于小鼠基因操作简便，已成为研究视网膜最常用的动物模型6,7。在小鼠眼球中，如何在完全去除非血管成分的同时保持视网膜血管整体结构的完整性，是一项特别具有挑战性的任务。迄今为止，关于小鼠视网膜胰蛋白酶消化技术的详细文献报道仍十分缺乏。本文提供了一套针对小鼠视网膜的胰蛋白酶消化法的详细分步操作流程，并就其中难点步骤的常见问题提供了实用的解决方案和操作建议。

成功操作的最终产物是小鼠视网膜血管系统完整网络的平铺标本，结构保持完整，可用PAS/苏木精或H&amp;E染色，如图2-4所示。图3中可见内皮细胞与周细胞的清晰区分。在视网膜中，内皮细胞的细胞核呈椭圆形或长形，完全位于血管壁内；周细胞的细胞核较小、呈球形、染色深，通常突出地位于毛细血管壁上。
胰蛋白酶消化是分析糖尿病动物模型中血管病理的常用方法。已描述的病理性血管病变包括微动脉瘤、周细胞残影（周细胞丢失的证据）、无细胞毛细血管以及毛细血管退化。图4展示了在db/db小鼠（II型糖尿病模型）中观察到的毛细血管退化的示例。尽管该操作步骤是针对小鼠视网膜优化的，但在大鼠视网膜中也获得了类似结果，如图5所示。需要注意的是，大鼠视网膜明显更大，因此使用了12孔板而非24孔板。此外，大鼠视网膜的血管网络也比小鼠的更不易受损。
尽可能去除所有非血管组织极为关键。任何残留都会导致非特异性染色，从而影响血管系统...

胰蛋白酶消化是分析视网膜血管系统最常用的方法之一。本文详细描述了该方法，包括关键的优化步骤，可在保留血管整体结构的同时有效去除非血管组织。

胰蛋白酶消化是分析视网膜血管结构的金标准方法1-5。该方法可实现对复杂血管网络整体的可视化观察……

本实验的总体目标是分离视网膜血管网络。首先对分离的视网膜进行一系列水洗，实现初步处理。第二步，将视网膜在37°C条件下用胰蛋白酶消化约1至1.5小时，具体时间取决于视网膜的大小。接下来，通过进一步的水洗和在显微镜下的解剖分离血管系统。最终，可以观察到诸如微动脉瘤、毛细血管退化以及内皮细胞与寄生虫比例异常等病理性血管改变。因此，与制备视网膜铺片等现有方法相比，该“尝试与消化”方法的主要优势在于能够以极高的清晰度完整显示整个血管网络。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为该技术操作难度较高，且难以稳定重复。对该方法进行可视化演示至关重要，因为仅通过文字描述很难掌握血管分离步骤。对于开展视网膜血管生物学研究（例如糖尿病视网膜病变等疾病）的实验室而言，这是一项非常有价值的工具。本次技术演示将由我实验室的优秀医学生 Jonathan Chow 进行。 将去核的小鼠眼球在10%中性缓冲甲醛中固定24小时后，将眼球置于培养皿中，并加入少量水覆盖。开始解剖时，使用一对解剖剪在角膜上小心地进行初步切割。然后，用直镊夹住已切开的部位，同时用剪刀沿角膜与巩膜的交界处剪开，以去除角膜。接下来，使用精细的弯头和直头镊子，缓慢而小心地将巩膜和脉络膜从视网膜表面向视神经方向剥离。然后移除晶状体以及残留的虹膜组织和碎片，以帮助将神经视网膜层与血管分离。向24孔板中加入约500微升45微米滤过的水，将视网膜放入孔中，室温下轻轻振荡4至5小时，每30至60分钟更换一次水。随后在水中继续于室温下轻轻振荡过夜。次日，移除水并加入3%胰蛋白酶，在显微镜下检查以确保孔内无残留碎片。为避免脉络膜黏附，随后将组织在37摄氏度孵育1至1.5小时，孵育过程中保持轻微振荡或不振荡。当组织开始出现解体迹象时，将培养皿置于显微镜载物台上，避开视网膜区域。小心地加入胰蛋白酶以分离血管系统。首先，使用镊子向视网膜中加入过滤水。剥离内界膜，该膜呈现为一层薄而透明的结构。轻轻振荡培养板。五分钟后，再次将培养板置于显微镜载物台上，并小心更换水分，避免损伤视网膜，以帮助血管网络从附着的视网膜组织中分离。按照上述方法清洗视网膜，直至最后一次清洗后水中几乎无残留碎片。通常，去除所有非血管组织是该操作中最困难的部分。以下技术可依次使用或单独使用，以帮助分离血管网络。一个重要的技巧是在操作视网膜前，将所有工具浸入胰蛋白酶中润湿。这有助于防止组织黏附到设备上。用预留的胰蛋白酶包被一支200微升微量移液器吸头，然后在靠近视网膜血管并朝向血管的方向反复吹打液体，产生轻柔的搅动。如果无血管组织仍然难以去除，可在视神经部位使用经胰蛋白酶包被的微量移液器吸头，并轻轻上下吹打整个血管网络，以帮助分解无血管组织。最后，可使用精细镊子轻轻将血管网络从水中提起，以去除任何附着的非血管成分。最终结果应为完整且无碎片的视网膜血管网络。为了观察血管系统，首先在干净的载玻片上滴加一滴水。然后在显微镜下将消化后的血管转移至水中进行检查。若血管的贴壁状态发生折叠或展开，折叠的血管会导致视野不清。染色后，如果组织发生折叠，需添加更多的水并轻轻晃动载玻片以促进其展开。然后使用微量移液器缓慢吸除多余的水分。成功操作的最终结果是获得一个完整的小鼠视网膜血管网络的平铺标本，其结构保持完整，并用伊红、曙红和伊红（hemat, toin, eoin）染色。如图所示，视网膜中内皮细胞与周细胞之间存在明显分化。由白色箭头指示的内皮细胞核呈椭圆形或长形，完全位于血管壁内。黑色箭头所指示的周细胞核较小、呈球形、染色深，通常沿毛细血管壁突出分布。胰蛋白酶消化是分析糖尿病动物模型中血管病理的常用方法。该图像显示了DB DB小鼠（2型糖尿病模型）视网膜中毛细血管退化的示例，白色箭头所指示处即为退化区域。尽管该方法已针对小鼠视网膜进行优化，但在大鼠视网膜中也可获得类似结果。需要注意的是，如图所示的大鼠视网膜比小鼠视网膜更大，因此使用12孔板而非24孔板。大鼠视网膜的血管网络也比小鼠的更不易受损。尽可能彻底地去除非血管组织极为关键。任何残留物都会导致非特异性染色，从而影响血管系统的清晰观察。例如，在此图像中，可见未能完全去除非血管组织。同样，在封片时保持视网膜展开也非常重要，以改善血管结构的可视化效果。此图像显示了一次不成功的血管平铺制备。在掌握这一技术难度较高的操作后，组织透明化与消化处理可成为一种极为有效的方法，实现对整个血管网络的详细可视化。通过改进小鼠眼部的这一技术，研究人员可以利用基因改造小鼠来研究多种能够调控视网膜血管系统的信号通路，从而帮助我们理解各种视网膜疾病的病理生理机制。由此，我们能够进一步加深对糖尿病性视网膜病变等疾病病理机制的认识。通过对DVDB小鼠等小鼠模型的研究，最终有望发现靶向视网膜血管系统的新潜在治疗干预手段。

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大鼠模型中视网膜病理生理学评估

本文介绍了一种成熟且可重复的凝集素染色实验方法，适用于整体视网膜标本，以及用于定量测量在增殖性和非增殖性视网膜病变中常发生变化的血管参数所需的相关实验方案。...

非增殖性和增殖性视网膜病变小鼠全层视网膜血管参数的定量分析

本文介绍了一种详细的免疫组织化学实验方案，用于在复杂组织中识别、验证和靶向具有功能相关性的半胱天冬酶（caspases）。...

视网膜组织中免疫染色Caspase-9的定量分析

小鼠模型可用于研究视网膜色素上皮（RPE）的生物学特性。已有研究表明，小鼠可产生多种RPE病理改变。本文介绍一种表型分析方案，通过光学显微镜、透射电子显微镜和共聚焦显微镜对小鼠RPE的病理变化进行阐明和定量分析。...

评估和量化年龄相关性黄斑变性小鼠模型中视网膜色素上皮病变的实验方案

已建立一种保护性检测方法，用于监测视网膜血管对糖尿病或糖尿病视网膜病变相关损伤（如氧化应激和细胞因子）导致的细胞死亡的抵抗能力。...

一种检测小鼠视网膜血管免受糖尿病相关死亡的保护作用的实验方法

我们近期发现视网膜毛细血管硬化是糖尿病相关视网膜功能障碍的一种新范式。本实验方案详细阐述了从小鼠视网膜毛细血管及视网膜内皮细胞培养物中分离视网膜毛细血管及其内皮下基质的步骤，随后介绍了利用原子力显微镜测量其硬度的技术方法。...

使用原子力显微镜测量小鼠视网膜毛细血管及其内皮下基质硬度的分离方法

通过球后注射荧光番茄凝集素后，采用血小板源性生长因子受体β的免疫荧光染色检测视网膜血管中的周细胞。标记后的视网膜经组织透明化处理，并整体封片，以便在共聚焦显微镜下观察围绕视网膜血管的周细胞的三维结构。...

通过免疫染色法对小鼠视网膜血管周细胞进行三维可视化观察

学习胰蛋白酶消化法分离小鼠视网膜血管网络，用于清晰观察微动脉瘤和毛细血管退化等病理变化。该方法优化了血管可视化技术，有助于研究糖尿病视网膜病变等疾病的病理机制。

小鼠模型视网膜血管分析的胰蛋白酶消化方案

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