胰蛋白酶精华协议分析视网膜血管小鼠模型
2013年6月13日
胰蛋白酶的消化是一个最常用的方法来分析视网膜血管。这份手稿中详细介绍的方法，包括关键的改动，优化技术，并删除无血管组织，同时保持整体架构的船只。
该程序的总体目标是隔离视网膜血管网络。这是通过首先对分离的视网膜进行一系列水洗来实现的。在第二步中，视网膜在 37 摄氏度的胰蛋白酶中消化约一到一个半小时，具体取决于视网膜的大小。
接下来，通过在显微镜下通过额外的水洗和解剖来分离脉管系统。最终，可以可视化病理性血管变化，例如微动脉瘤、毛细血管变性和异常的内皮细胞与寄生虫比率。因此，与制备视网膜平面支架等现有方法相比，尝试和消化的主要优点是可以非常清晰地突出显示整个血管网络。
一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为它在技术上具有挑战性并且难以始终如一地执行。这种方法的视觉演示至关重要，因为仅靠文字很难学习血管隔离步骤。对于任何进行视网膜血管生物学研究（例如糖尿病视网膜病变等某些疾病）的实验室来说，这都是一个非常有价值的工具，我实验室的一位才华横溢的医学生 Jonathan Chow 将演示这项技术。
将去核小鼠眼睛和 10% 中性缓冲福尔辛固定 24 小时后，将眼睛放入培养皿中，并用少量水覆盖。首先，使用一把解剖剪刀小心地在角膜上做一个初步的切口。然后，在用直镊子固定切割区域的同时，用一把剪刀沿着角膜和巩膜的边界切割，去除角膜。
接下来，使用细镊子、弯曲镊子和直镊子。缓慢而小心地将巩膜和脉络膜从视网膜向视神经剥离。然后从视网膜上取下晶状体和任何多余的虹膜和碎屑，以帮助将神经视网膜层与血管分离。
将大约 500 微升 45 微米的过滤水放入 24 孔板中，将视网膜放入孔中，然后在室温下轻轻摇晃 4 至 5 小时，每 30 至 60 分钟更换一次水。继续在水中洗涤视网膜过夜，轻轻摇晃第二天在室温下，除去水，并在 3% 胰蛋白酶下检查，以确保孔中没有发现碎屑。为避免脉管系统粘附在其上，然后将组织在 37 摄氏度下孵育，轻轻摇晃或不摇晃一到一个半小时。
当组织开始出现崩解迹象时，将板放在显微镜载物台上，然后避开视网膜。小心去除胰蛋白酶以分离脉管系统。首先，使用镊子将过滤水添加到视网膜中。
撕下内部限制膜，它看起来像一层薄的透明层。轻轻搅动摇晃板。五分钟后，再次将板放在显微镜载物台上，小心地更换水，避免损伤视网膜，以帮助从粘附的视网膜组织中释放血管网络。
如刚才所示清洗视网膜，直到最后一次清洗后水中几乎没有碎屑。因此，通常切除所有非血管组织是手术中最棘手的部分。以下技术可以按顺序使用，也可以单独使用为了促进血管网络的分离，一个重要的提示是在作视网膜之前浸入所有工具和胰蛋白酶。
这有助于避免组织粘附在设备上。在 200 微升微量移液器吸头上涂上预留的胰蛋白酶，然后小心地上下移液，靠近视网膜血管并吹向视网膜血管，引起轻微的搅动。如果非血管组织仍然抵抗中心，则用胰蛋白酶包被的微量移液器吸头对准视神经，并小心地上下移液整个血管网络，以帮助分解非血管组织。
终于，很好。镊子可用于轻轻地将脉管系统从水中提起，以去除任何粘附的非血管成分。最终结果应为完整无碎片的视网膜脉管系统网络。
要观察脉管系统，首先将一滴水滴在干净的载玻片上。然后在范围检查下将消化的容器转移到水中。如果 VA 翻盖支架折叠或展开，折叠的容器会导致能见度差。
染色后，如果组织折叠，请添加额外的水并轻轻摇晃载玻片以促进展开。然后使用微量移液器慢慢去除多余的水。成功手术的最终产品是小鼠视网膜脉管系统整个网络的平面安装，其结构保持并用 hemat、toin 和 eoin 染色。
如图所示，在视网膜中可以观察到内皮细胞和周细胞之间的明显分化。如白色箭头所示，内皮细胞的细胞核呈椭圆形或细长状，完全位于血管壁内。寄生虫核由黑色箭头表示，是小的球形染色，密集，通常沿毛细血管壁有突起位置。
胰蛋白酶和消化物是用于分析糖尿病动物模型中血管病理学的常用程序。该图像显示了在 DB DB 小鼠（一种 2 型糖尿病模型）中观察到的白色箭头所示的毛细血管变性示例。尽管该程序已针对小鼠视网膜进行了优化，但在大鼠视网膜中也可以获得类似的结果。
重要的是要注意，这些图像中显示的大鼠视网膜比小鼠视网膜大，需要 12 个而不是 24 个，而板。大鼠视网膜的脉管系统网络也比小鼠视网膜更不脆弱。尽可能多地去除非血管组织非常重要。
任何残留物都会导致非特异性染色，并导致脉管系统的可视化效果不佳。例如，在这张图片中，可以观察到整个非血管组织的未成功切除。同样，安装时展开视网膜也很重要，以改善脉管系统的可视化。
该图像显示了血管平面支架的未成功展开。在掌握了这个技术上困难的程序之后。行程和消化是一种非常有价值的方法，可以详细地可视化整个血管网络。
通过在小鼠眼中改进这项技术，研究人员可以利用基因作的小鼠来研究可以控制视网膜脉管系统的各种途径，并使我们能够了解各种视网膜疾病的病理生理学。因此，我们可以提高对糖尿病视网膜病变等疾病病理的理解。通过研究像 DVDB 小鼠这样的小鼠模型，这最终可以让我们有机会找到针对视网膜脉管系统的新的潜在治疗干预措施。
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概览
本手稿详细介绍了用于分析视网膜血管的胰蛋白酶消化法，强调了增强该技术的关键优化。该过程有效地分离了血管网络，同时保留了血管结构。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 视网膜生物学
- 血管分析
背景
- 视网膜血管分析对于理解各种病理至关重要。
- 传统方法可能无法清晰地显示整个血管网络。
- 胰蛋白酶消化法提供了一种分离和显示视网膜血管的精细方法。
- 该方法允许检查血管中的病理变化。
研究目的
- 详细描述胰蛋白酶消化法。
- 优化技术以提高血管可视化的清晰度。
- 展示该方法相对于现有技术的优势。
使用的方法
- 分离的视网膜经过一系列水洗。
- 在37摄氏度下用胰蛋白酶消化1-1.5小时。
- 通过额外的洗涤和解剖分离血管。
- 在显微镜下观察病理变化。
主要结果
- 整个视网膜血管网络可以清晰地突出显示。
- 可以观察到微小动脉瘤和毛细血管退化等病理变化。
- 该方法比视网膜平面镶嵌提供了显著的优势。
- 增强的清晰度允许更好地分析血管条件。
结论
- 胰蛋白酶消化是一种有效的视网膜血管分析方法。
- 优化改善了血管可视化的清晰度和细节。
- 该技术可以帮助研究各种视网膜病理。
常见问题
Executive Industry Relevance
Robust visualization of the retinal vasculature in genetically engineered mouse models is critical for early-stage target validation and mechanistic de-risking in ophthalmic drug discovery. The trypsin digest protocol enables high-resolution, quantitative assessment of vascular pathology, supporting predictive confidence in disease-relevant systems. This capability is essential for portfolio triage and advancing translational research in retinal vascular diseases.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of vascular pathology in genetically modified mouse models.
- Supports functional target validation by quantifying microaneurysms, capillary degeneration, and cell ratios.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating vascular-specific phenotypes from confounding retinal tissue.
- Improves predictive confidence for downstream therapeutic hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Provides a validated workflow for preparing intact vascular networks for quantitative analysis.
- Standardizes sample preparation, enhancing reproducibility and assay comparability across studies.
- Enables reliable detection of subtle vascular changes for compound screening in disease models.
- Supports scalability and platform reuse in preclinical vascular biology programs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant endpoints for diabetic retinopathy and other retinal vascular disorders.
- Ensures continuity from genetic manipulation to phenotypic readout in preclinical models.
- Reduces translational risk by providing quantitative, pathology-specific biomarkers.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust vascular phenotyping.
Pipeline & Workflow Integration
The trypsin digest protocol integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical model characterization, supporting both hypothesis-driven and phenotypic screening workflows.
- Discovery Biology: Facilitates null hypothesis testing by isolating vascular effects from non-vascular retinal components.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for cross-study comparison and compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of endothelial-to-pericyte ratios and identification of vascular lesions.
- Translational Research: Provides disease-relevant phenotypes for biomarker alignment in diabetic retinopathy models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable protocol for vascular analysis across genetically engineered mouse lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in retinal vascular studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of vascular phenotyping workflows.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and models based on robust vascular endpoints.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in microdissection and tissue handling for consistent results.
- Demands access to microscopy and histological staining infrastructure for endpoint analysis.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility across studies.
- May require adaptation for different species or retinal sizes, as noted for rat versus mouse models.
- Incomplete removal of non-vascular tissue can compromise data quality and visualization.
