肺炎链球菌在鼻内殖民期间炎症反应的特征

该程序包括用肺炎链球菌定植 murn 鼻咽部，然后提取定植细菌以及贴壁或募集的细胞。这是通过首先制备 S 肺炎的细菌接种物来实现的。感兴趣的菌株。

然后将活细菌鼻内施用到麻醉小鼠体内，当它们在限制装置中时，在所需的定植时间后，对小鼠实施安乐死，并通过插管其暴露的气管并通过 nas 冲洗内容物来进行鼻腔灌洗。鼻腔灌洗中存在的细菌数量可以使用微生物学技术进行量化。或者，可以使用流式细胞术技术对募集的细胞进行表型分析或定量 PCR 技术来检测免疫反应。

为了在开始之前测量感兴趣的表达 mRNA 的水平，您需要为手术的鼻内定植部分准备小鼠限制器，并为鼻腔灌洗准备空心针头。只需切掉 50 毫升 falcon 管的锥形尖端即可制备小鼠限制器。创建光圈后，请务必使用剪刀擦亮任何锋利的末端。

为了制备空心针，您需要以下内径为 20 毫米的 PE 0.38 聚乙烯管。一个密耳注射器的盖子上有 26 个和三个 8 号斜面针头、一对锋利的细虹膜、剪刀和一把镊子。用细剪刀将 PE 20 管剪成大约 2.5 厘米或 1 英寸长的小块，确保每端都有斜面尖端。

使用镊子小心地将其中一个片滑到针尖上。为避免刺穿管路侧，空心针头可保存在 70% 乙醇中直至需要，并在使用前直接用 PBS 冲洗。对于具有 S pmo 的小鼠的鼻内定植，我们建议使用 10 到 9 个集落形成单位/密耳的浓度，以 10 μL 为单位。

对于 7 个 CFU 的 10 个最终剂量，将接种物放在冰上直到使用前，并确保在每次定植之间搅拌。除了接种物外，您还需要一个 P 10 或 P 20 移液器灭菌移液器吸头和您的鼠标限制器。通过尾巴隔离一只老鼠，并将其放入您之前准备好的老鼠限制装置中以限制它。

如果您在将鼠标引导到限制器中时遇到问题，将其放置在鼠标的前面和上方可能会有所帮助，让动物向上爬行。一旦鼠标进入限制器内，用它的身体底部轻轻地向上推它，使其鼻子从限制器的锥形端伸出。使用 P 10 或 P 20 移液器，通过沉积 10 微升制备的培养物来接种每只小鼠，将其均匀分布在两只小鼠之间。纳雷斯。

通过逐渐脉冲接种，让接种物滴入鼻子，花费鼠标吸入接种物所需的时间。老鼠可能会从鼻子里打出一些接种物，这是意料之中的。请注意，对于此过程，应麻醉小鼠，以确保细菌保持定位于鼻咽部，不会扩散到下呼吸道。

出于此演示的目的，我们接种了 PBS，但无论何时使用活细菌，请确保根据研究所批准的指南进行程序。例如，大多数机构将要求在生物安全 2 级罩中进行定植。如果使用体重指标作为终点监测方式的一部分，则在定植后立即监测 MA，每 12 至 24 小时监测一次小鼠的临床症状，包括嗜睡、皮毛褶皱和体重减轻。

一旦小鼠定植，请将它们保留所需的时间长度。在此期间结束时，将对小鼠实施安乐死并进行洗鼻，因为宫颈脱位可能会损害气管。必须避免这种安乐死的方法。

在进行洗鼻之前，请确保您手头有以下物品。预先制备的空心针、70% 乙醇水、一对镊子、一对锋利的细虹膜剪刀、磷酸盐、缓冲盐水、RNA 裂解缓冲液和一根 mil einor 管。准备好开始后，将动物平放在它的背上，并使用 70% 的乙醇水溶液对其皮毛的前部进行消毒，尤其是颈部区域。

注意防止乙醇进入鼻孔。沿着动物脖子的中线做一个纵向切口，让自己创造一个开口来想象气管。小心地向两侧剥开皮肤，露出下面的颈部组织。

此时，气管应该可见，两侧都有纵向肌肉包围。小心剪断这些，以便清楚地看到气管本身，注意不要切断周围的脉管系统。如果您确实不小心切断了脉管系统并且在继续之前该区域有血液。

让出血停止，然后通过分配无菌 PBS 并使用无菌纱布轻轻吸收多余的水分来清洁该区域几次。一旦气管正确暴露，在气管中做一个横向的半月形切口，大约在一半处。将无菌 PBS 滴入空心注射器中。

将套管插入气管中，朝向鼻子方向，保持斜边朝下，以便于插入。套管就位后，旋转 180 度并轻轻向上探查，直到您感到光阻力。将指定用于样品采集的 EEND DPH 管放在鼠标鼻子下方。

通过分配最少量的 PBS 灌洗液来测试套管的正确放置。在此之后，如果套管放置正确，小鼠的 NAS 周围应该会形成一滴液体。如果测试 PBS 直接从动物的嘴中流出，请将套管向后拉，然后轻轻向前探查以重新定位，直到感觉到非常轻微的阻力。

注意不要将套管推得太远超过这个阻力，因为您会将其移过鼻腭并进入口腔。确认套管位置正确后，继续快速分配 200 μL PBS，以帮助置换和收集最大量的细胞。内容物应通过鼠标的鼻孔流出并进入收集管。

立即将样品放在冰上。随后可以检测这些样品的细菌载量和细胞募集。要收集样品进行 RNA 分析，请使用含有 500 μL RNA 裂解缓冲液的单独空心针进行二次鼻腔灌洗。

请注意，RNA 裂解缓冲液会剥去上皮并破坏周围组织。因此，必须注意避免接触肺等器官。如果需要保留这些组织来定量鼻咽细菌负荷，您将需要以下内容。

Epicor 管，含有三联大豆蛋的微生物板，补充有 5% 的羊血。涡旋混合器、PBS 无菌移液器吸头以及 P 20 和 P 200 移液器。首先在 BSL 两个罩中工作，为每个味醂洗鼻液样品准备一个系列稀释系列。

一般来说，鼻咽部肺炎链球菌的浓度预计在 0 到 10 到 4 CFU 之间。因此，进行 3 次 10 倍连续稀释，将 10 微升纯洗鼻样品添加到第一管中，浓度为 10 至每密耳负 1 CFU，然后继续向下稀释，直到稀释三个样品在每次稀释之间彻底涡旋。请注意，此视频仅用于演示目的。

应始终遵守正确的实验室技术，包括在 dilu 之间更换移液器吸头 使用记号笔，将其分成多个象限回到您的逻辑板中，并在象限上标记要电镀的相应稀释度。在琼脂平板上滴出 3 滴 10 μL 的每种稀释液样品。让这些食物在没有盖子的情况下干燥 15 到 30 分钟，然后盖上板并倒置放入具有肺炎球菌生长最佳条件的细菌培养箱中，通常为 37 摄氏度和 5% CO2。

将这些板孵育 24 至 48 小时。这段时间后，取出板并通过平均板上形成的菌落来确定定植细菌的数量。对于每种稀释液，可以通过其独特的米色、它们的 α 溶血区来识别 animo 菌落，这些溶血区是每个菌落周围的小光晕，由细菌消化琼脂中的血液补充剂而产生。

最后，通过每个菌落中心的小凹陷，使其看起来像红细胞。看完这个视频，你应该对如何建立鼻咽 es pmo、在小鼠体内定植、如何在定植后从小鼠的鼻咽中分离细菌和细胞、使用鼻腔灌洗以及如何使用微生物技术量化相应的细菌负荷有深入的了解。我们希望本视频中描述的方法能鼓励您使用鼻内定植模型来研究在这个研究不足的区域背景下宿主对病原体的反应。