使用人肠道上皮细胞和BALB/c小鼠巨噬细胞测定可耐受脂肪酸和霍乱毒素浓度

本实验的总体目标是确定对细胞存活无负面影响的可耐受脂肪酸和霍乱毒素浓度。首先培养相应类型的细胞，然后将细胞与三种待测脂肪酸或霍乱毒素的不同浓度共同孵育，以实现该目标。

24小时后，使用MTT法评估细胞存活率。最终，MTT法的分光光度数据表明，脂肪酸和霍乱毒素的最佳浓度可在不显著降低细胞存活率的情况下用于处理细胞。该技术的应用意义在于预防霍乱感染，因为疫苗接种并不总是有效。

从小鼠肠道C株小鼠的巨噬细胞将用于所有共毒素测定以及更大规模的脂肪酸浓度测定。细胞可在以下两种培养基之一中培养：DMEM培养基含L-谷氨酰胺，添加10%胎牛血清和1%抗生素-抗真菌剂，或RPMI 1640基础培养基添加10%胎牛血清、5% L-谷氨酰胺和1%抗生素-抗真菌剂。本实验方案中，将肠道C株细胞培养于75 cm²康宁细胞培养瓶（带透气盖），在37°C、95%空气和5%二氧化碳条件下培养。小规模脂肪酸浓度测定使用人肠道上皮细胞，细胞在75 cm²康宁细胞培养瓶（带透气盖）中，采用HyperCare培养基添加10% FPS和30 ng/mL培养。

根据制造商说明，人EGF不使用抗生素和抗真菌试剂，在37摄氏度、95%空气和5%二氧化碳条件下培养。所有细胞以1:3比例传代，当细胞汇合度约为70%时进行传代，具体比例取决于细胞类型，通常每2至5天传代一次，在脂肪酸处理前完成。首先准备脂肪酸：将油酸、亚油酸和亚油酸从厂家提供的玻璃安瓿转移至灭菌玻璃小瓶中。接着，将每种脂肪酸分别转移至单独的灭菌离心管中。

将每种脂肪酸溶于100%乙醇中，稀释比例为1:6，随后加入RPMI 1640不完全培养基，使其终浓度为每微升10微克。涡旋混匀每种溶液，然后转移至玻璃小瓶中，于-20摄氏度冰箱中保存。

将人肠道上皮细胞以每孔2,500个细胞接种于96孔组织培养板中，加入适量的完全培养基，使每孔总体积达到200微升。于37摄氏度、95%空气和5%二氧化碳条件下培养24小时。

经过24小时的增殖期后，移除培养基。将待测的每种脂肪酸以适当的浓度加入孔板中作为阳性对照。以完全培养基培养细胞作为阴性对照，并以70%乙醇处理细胞进行培养。

随后，加入完全培养基，使每孔的总体积达到 200 µL。将处理后的培养板孵育 24 小时，然后开始 MTT 实验，以使霍乱毒素适应细胞处理。将霍乱毒素溶于 PBS 中，浓度为 1 mg/mL。

将溶液分装至冻存管中，在用于细胞处理前置于2至8摄氏度保存。用无菌PBS或不完全DMEM将毒素稀释一百倍，得到每微升含一纳克的终工作浓度。在96孔板中每孔接种2,500个巨噬细胞。

将细胞培养板置于37摄氏度、95%空气和5%二氧化碳条件下孵育24小时。24小时增殖期后，移除培养基，并向各孔中加入适当浓度的霍乱毒素。与脂肪酸处理类似，所有样品和处理组均以完全培养基作为阳性对照，70%乙醇作为阴性对照进行细胞孵育。

使用至少三个重复，阳性对照需增加重复次数。加入完全培养基，使每孔总体积达到 200 µL。在开始 MTT 实验前，将霍乱毒素处理的培养板孵育 24 小时。

在用脂肪酸或染料处理细胞24小时后，通过MTT法测定细胞活力。移除待测96孔板中每孔的溶液，并替换为200 µL新鲜完全培养基溶液。

向每个孔中加入10 µL新配制的2.5 mg/mL MTT溶液。将培养板在37 °C下孵育3至4小时。孵育3至4小时后，弃去培养基溶液，然后向每个孔中加入100 µL含0.04 M盐酸的异丙醇溶液。

将培养板在室温下孵育5分钟。随后，将每个孔中的溶液转移至离心管中，在20,000 ×g条件下离心1分钟，或直至形成沉淀。取每份样品20至40 µL转移至微孔板读数仪中，使用分光光度计在570 nm处测定吸光度。

该图显示了大多数巨噬细胞的存活率，以使用不同浓度油酸、亚油酸和亚油酸处理的阳性对照为函数。显然，对于任何一种脂肪酸，细胞均无法耐受高于100纳克/微升的浓度。随后使用人上皮细胞重复该实验，浓度范围低于100纳克/微升，以10纳克/微升为增量，最高至70纳克/微升。

该图显示了油酸各浓度下的细胞存活率。单因素方差分析表明，一个或多个均值之间存在统计学差异。然而，只有较高浓度的处理组与阳性对照组之间的均值差异具有统计学意义。

有趣的是，观察到的差异是由于细胞活力增加且变异性更大所致。亚油酸和亚油酸也获得了类似的结果。一种方法。

Inova 指出，各处理组的平均值与阳性对照组的平均值之间均无统计学上的显著差异，但从这些结果来看，某些较高浓度（例如每微升60纳克的亚油酸或来自亚油酸的处理）似乎增加了变异程度。使用人肠道上皮细胞时，最佳脂肪酸浓度范围似乎为每微升1至5纳克。还测试了不同浓度的胶原毒素对大多数巨噬细胞存活率的影响，毒素浓度的处理梯度相对较大。

如预期所示，随着处理方式的不同，细胞存活率呈现出下降趋势，且每种处理条件下的细胞活力差异显著。由于活力存在较大变异性，导致阳性对照组的平均值与任何处理组之间均无显著性差异，因此进一步测试了100纳克或更低浓度的毒素水平。本图显示了较低毒素浓度处理下的细胞存活率。

几乎所有毒素浓度下的细胞活力均表现出高度变异性，尽管治疗后细胞活力略有上升。然而，与阳性对照的均值相比，任何治疗组的活力提升均无统计学显著性。基于这些结果。

使用结肠C型小鼠巨噬细胞进行实验时，推荐的色素毒素浓度在每次处理中应低于30纳克。该技术的建立为结肠相关研究领域的科研人员探索脂肪酸是否可增强对霍乱弧菌感染的免疫力铺平了道路。