Name: 量化衰老癌症细胞的敏感方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学习使用流式细胞术快速定量检测衰老癌细胞的方法。本研究利用阿霉素诱导细胞衰老，通过C12FDG底物标记和流式分析实现高灵敏度定量，为癌症治疗药物筛选提供可靠工具。

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我们感谢法国卡昂大学SF 4206 ICORE提供的流式细胞术实验平台。J.C.获得了法国电力公司辐射防护委员会和下诺曼底大区议会的博士后奖学金。这些数据属于法国国家抗癌联盟（Orne省和Calvados省委员会）资助项目的部分内容。

1. C12FDG、Bafilomycin A1 和细胞培养的制备
<ol>
	<li>将 C12FDG 粉末溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成终浓度为 20 mM 的溶液。分装后于 -20 °C 保存。使用 DMSO 时应采取适当的安全防护措施。</li>
	<li>将巴佛洛霉素 A1（bafilomycin A1）粉末溶于 DMSO 中，配制成终浓度为 0.1 mM 的溶液。分装后于 -20 °C 保存。使用巴佛洛霉素时应采取适当的安全防护措施。</li>
	<li>在含有 10% 胎牛血清和 1% 抗生素的培养基中，于 37 °C、5% CO2 条件下培养 RPMI 8226 细胞系或其他贴壁或非贴壁细胞系。估算实验所需的细胞数量。为在流式细胞术分析中记录到足够数量的细胞事件，至少需要 5 × 105 个细胞。为测定衰老细胞的比例，需准备三个细胞样本：未标记样本、未处理并用 C12FDG 染色的细胞样本、经处理并用 C12FDG 染色的细胞样本。</li>
	<li>实验前 24 小时接种细胞，使细胞处于细胞增殖曲线的对数生长期。</li>
</ol>
2. 诱导衰老
<ol>
	<li>通过添加化疗药物诱导癌细胞衰老。药物浓度和处理时间应根据所测试的细胞类型进行调整。建议以每毫升约106个细胞的密度，使用终浓度为50 nM的阿霉素处理48小时作为起始条件。注意设置未处理样本作为阴性对照。</li>
</ol>
3. 巴佛洛霉素 A1 处理
<ol>
	<li>通过将细胞与台盼蓝（体积比）混合，检测细胞活力，因为前一步骤中使用的化疗药物可能导致细胞凋亡。将混合液加入马氏计数板，计数蓝色细胞（死细胞）和白色细胞（活细胞）的数量。若细胞活力百分比低于70%，可使用适当的试剂盒去除死细胞，以确保死细胞不会对后续分析造成偏差。</li>
	<li>移除培养基，并更换为预热的新鲜培养基。向细胞中加入终浓度为100 nM的巴佛洛霉素A1（bafilomycin A1）。巴佛洛霉素A1用于中和溶酶体的酸性pH。在37 °C、5% CO2条件下孵育1小时。</li>
</ol>
4. C12FDG 染色
<ol>
	<li>将 C12FDG 溶解于预热的新鲜培养基中，终浓度为 2 mM。</li>
	<li>将该化合物以终浓度 33 μM 加入细胞中，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 2 小时。若使用悬浮细胞，于 4 °C 以 300 × g 离心 5 分钟（离心速度可能需根据所用细胞类型进行调整），用 PBS 洗涤 2 次，将细胞沉淀重悬于 500 μl 冷 PBS 中。若使用贴壁细胞，吸除培养基后用 PBS 洗涤 2 次，用胰蛋白酶溶液消化收集贴壁细胞，于 4 °C 以 300 × g 离心 5 分钟（离心速度可能需根据所用细胞类型进行调整），将细胞沉淀重悬于 500 μl 冷 PBS 中。无论何种情况，细胞浓度均应约为 106 个细胞/ml。</li>
	<li>进行共免疫标记，以进一步表征衰老细胞群体。</li>
</ol>
5. 流式细胞术分析
<ol>
	<li>使用流式细胞仪制造商推荐的控制微球校准流式细胞仪。所有步骤中，至少采集 104 必须记录事件。</li>
	<li>运行第一个含有未标记细胞的样本。绘制一个双参数图，显示前向散射光通道（FSC）相对于侧向散射光通道（SSC）。调节光电倍增管（PMT），并设定一个感兴趣区域，排除在样本制备过程中可能出现的死细胞和细胞碎片。将该感兴趣区域设门于一个单参数直方图中，该图在x轴的对数尺度上显示FL1，y轴显示事件数。总事件数代表被分析的细胞数量。调节PMT，使未标记细胞出现在x轴对数尺度的第一 decade 内。如有必要，测定细胞的自发荧光。</li>
	<li>运行第二个含有未经处理细胞的样本。在显示FL1（C的荧光）的单参数直方图上12FDG），将光标置于标记较弱的细胞群之后。该阈值可用于区分非衰老细胞（标记较弱的细胞）与衰老细胞（标记较强的细胞）。</li>
	<li>运行第三个含有经处理细胞的样本。荧光标记明显的细胞， 即 衰老细胞的数量超过前一步骤中确定的阈值。通过将明亮事件数除以总事件数来计算衰老细胞所占的百分比。如有需要，也可利用平均荧光强度来估算β-半乳糖苷酶的活性。</li>
</ol>

<ol><li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li>
<li>Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+when+bad+things+happen+to+good+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: when bad things happen to good cells.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).</li>
<li>Shay, J. W., Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+senescence+in+carcinogenesis+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy.</a> Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).</li>
<li>Bartkova, J., Rezaei, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene-induced+senescence+is+part+of+the+tumorigenesis+barrier+imposed+by+DNA+damage+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints.</a> Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).</li>
<li>Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response+and+inflammatory+signaling+limit+the+MLL-ENL-induced+leukemogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo.</a> Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).</li>
<li>Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+fibroblasts+promote+epithelial+cell+growth+and+tumorigenesis%3A+a+link+between+cancer+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).</li>
<li>Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).</li>
<li>Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+senescence+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor cell senescence in cancer treatment.</a> Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).</li>
<li>Dimri, G. P., Lee, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).</li>
<li>Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+%28beta%29-galactosidase+reflects+an+increase+in+lysosomal+mass+during+replicative+ageing+of+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells.</a> Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li>
<li>Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotype+favors+the+emergence+of+cancer+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells.</a> Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446(2012).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文介绍了一种基于流式细胞术的方法，用于定量活体癌细胞中的细胞衰老。该方法基于使用膜通透性化合物 C12FDG，因此只要细胞能够摄取该化合物，便可应用于任何细胞类型以及各种处理后的细胞。细胞摄取后，C12FDG 被衰老细胞溶酶体中富集的 β-半乳糖苷酶水解。经激光激发后，该化合物发出绿色荧光，从而实现对衰老细胞的定量。这种绿色荧光的定量既可通过流式细胞术完成，也可通过荧光显微镜进行。然而，在后一种情况下，需由观察者手动计数荧光阳性细胞，较为耗时。由于 C12FDG 可被 β-半乳糖苷酶水解，该方法除了可用于定量衰老细胞外，还可用于测定 β-半乳糖苷酶的活性及其主要存在于溶酶体囊泡中的定位情况。尽管该方法操作简便，但需特别注意第 3 步。成功检测衰老细胞在很大程度上依赖于溶酶体的合适 pH 值。为此，我们使用巴佛洛霉素 A1（bafilomycin A1）来中和溶酶体的酸性 pH。根据所用细胞类型的差异，此步骤可能并非必需。如果预期存在细胞衰老但未检测到染色信号，建议设置巴佛洛霉素 A1 的阴性对照（即不加巴佛洛霉素），并提高巴佛洛霉素 A1 的浓度。若采取此措施，需确保浓...

自20世纪60年代初海弗利克（Hayflick）和莫尔黑德（Moorhead）发现以来，细胞衰老至今仍是一种引人关注的细胞现象 1人类细胞不会无限增殖，Hayflick 和 Moorhead 将这种细胞老化过程称为“衰老”。衰老是一种稳定的细胞周期阻滞状态，细胞在此状态下仍保持代谢活性，不同于细胞死亡。迄今为止，已有四种细胞机制被证实可诱导衰老：端粒缩短、DNA 损伤、染色质紊乱以及有丝分裂原癌基因的异常表达 2这表明不仅正常细胞，癌细胞也能够发生衰老 3事实上，经历衰老的癌细胞被证明会构成阻碍肿瘤进一步进展的屏障 4-5然而，已有若干报告指出，在特定情况下，细胞衰老也可能促进恶性肿瘤的发生 6-7研究癌细胞的衰老现象正逐渐成为癌症研究中的迫切需求，因为目前使用的化疗药物不仅可导致癌细胞衰老 体外 而且 体内 8.
检测衰老细胞是否存在的主要实验方法是酸性pH条件下的β-半乳糖苷酶实验。该组织化学实验反映了大多数衰老细胞中溶酶体生物合成的增加。简言之，外源性X-gal作用于细胞后，被衰老细胞溶酶体中富集的β-半乳糖苷酶切割，产生蓝色产物 9。随后可在明场显微镜下对呈蓝色的衰老细胞进行定量分析。尽管该方法应用广泛，但存在若干主要缺陷：第一，该实验需在固定细胞上进行；第二，实验耗时较长，因为需要在显微镜下计数大量衰老细胞以评估衰老程度；第三，该实验敏感性较低，因衰老细胞与非衰老细胞的区分完全依赖于观察者的主观判断。
本文介绍一种尚未被充分利用的、快速且灵敏的基于细胞术的检测方法，用于评估活体衰老细胞的存在。该方法基于衰老细胞中富含的β-半乳糖苷酶对一种可穿透细胞膜的分子——5-十二酰氨基荧光素二-β-D-半乳糖吡喃糖苷（C12FDG）——进行水解。水解后经激光激发，C12FDG 发出绿色荧光，因而可通过流式细胞术进行检测10, 11。通过流式细胞术检测衰老细胞具有快速且灵敏的显著优势。此外，流式细胞术对衰老细胞的检测可同时与其他细胞标志物的检测相结合。该方法可用于检测经化疗处理的癌细胞群体中的衰老细胞，并可在临床中常规应用于组织切片或细胞解离后的样本。

<table><tbody><tr><td>5-十二烷酰氨基荧光素二-&amp;#946;-D-半乳吡喃糖苷</td><td>Invitrogen</td><td>D-2893</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>巴佛洛霉素 A1</td><td>Sigma</td><td>B1793</td><td></td></tr><tr><td>多柔比星</td><td>Sandoz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 细胞培养基</td><td>Lonza</td><td>BE12-702</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>PAA Laboratories GmBH</td><td>A15 101</td><td></td></tr><tr><td>抗生素</td><td>Gibco</td><td>5290-018</td><td></td></tr><tr><td>Galios 流式细胞仪</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94291</td><td></td></tr></tbody></table>

一种定量衰老癌细胞的灵敏方法

A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells

人类细胞不会无限增殖。在外界和/或内在信号的刺激下，细胞可能会死亡，或进入一种稳定的细胞周期停滞状态，称为衰老。已有研究表明，端粒缩短和促分裂原癌基因的异常表达等多种细胞机制均可导致细胞衰老。衰老不仅局限于正常细胞，癌细胞也被报道可发生衰老。
	化疗药物已被证明可诱导癌细胞发生衰老。然而，细胞衰老是抑制还是促进肿瘤发生仍存在争议。由于这一效应可能最终具有患者特异性，因此迫切需要一种快速且灵敏的方法来评估癌细胞中的衰老状态。
	目前使用的标准β-半乳糖苷酶检测方法存在主要缺陷：耗时且灵敏度低。本文提出一种基于流式细胞术的活细胞衰老检测方法。该方法具有快速、灵敏的优点，并可与多种细胞标志物的免疫标记相结合。

多发性骨髓瘤是一种血液系统恶性肿瘤，被用于评估化疗程序诱导的细胞衰老。为此，采用一种 commercially available 的多发性骨髓瘤细胞系（RPMI 8226），用化疗药物阿霉素处理2天。随后对细胞进行巴佛洛霉素 A1 处理，并进一步与 C12FDG 共孵育。通过流式细胞术分析细胞。图1 展示了实验的各个步骤，并表明使用 C12FDG 可在一天内测定衰老细胞的比例。首先将未标记的细胞上机进行流式细胞术检测。如图2A所示，在前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）的散点图中设定一个感兴趣区域，以排除死亡细胞和细胞碎片。将该感兴趣区域内的细胞投射到直方图上，横轴显示 C12FDG 的荧光信号（FL1），纵轴显示事件数。首先分析未经处理的细胞。如图2B所示，在微弱荧光标记的细胞群之后设置一个红色光标：非衰老细胞位于区域 U，而衰老细胞则位于区域 V。随后将经处理的细胞上机检测。如图2C（左图）所示，出现一群强荧光标记的细胞，位于...

细胞衰老是抑制还是促进肿瘤发生目前仍存在争议。由于化疗药物可诱导癌细胞发生衰老，因此研究细胞衰老对于提出新的治疗策略至关重要。然而，目前广泛使用的标准β-半乳糖苷酶检测方法存在诸多局限性。本文提出一种基于流式细胞术的快速、灵敏的检测方法，用于定量细胞衰老。

人体细胞不会无限增殖。在外界和/或内在信号的刺激下，细胞可能死亡，或进入一种稳定的细胞周期停滞状态，称为衰老。

本实验的总体目标是以快速且灵敏的方法定量细胞衰老。本文以筛选潜在化疗药物为例，展示该方法的应用价值。首先诱导细胞衰老。将化疗药物阿霉素加入癌细胞中。接着加入Bain A以中和细胞溶酶体的酸性pH。然后在细胞摄取后加入可穿透细胞的β-半乳糖苷底物C12 FDG。C 12 FDG 被水解并发出荧光。由于衰老细胞的溶酶体中富含β-半乳糖苷酶（beta-GCSEs），这些细胞的荧光强度高于非衰老细胞。为了量化荧光差异，对细胞进行流式细胞仪分析，对所得数据进行分析，可定量不同处理条件下衰老癌细胞的百分比。与现有的β-半乳糖苷酶方法相比，该技术的主要优势在于能够快速且灵敏地定量衰老细胞。事实上，当我们使用常用的β-半乳糖苷酶检测方法对衰老细胞进行定量遇到困难时，首次提出了本方法的设计思路。尽管我们目前使用该技术检测癌细胞中的衰老状态，但它同样适用于正常细胞。该方法有助于回答癌症领域的快速问题，例如化疗药物是否诱导癌细胞发生外排小体释放（sse），这可能会促进恶性进展。因此，该技术最终可能有助于提示新的癌症治疗方法。在化学通风橱中操作，将C12FDG粉末溶于DMSO中，配制成终浓度为20毫摩尔的溶液，分装至0.5毫升离心管中，于-80摄氏度保存。DMSO 应在适当的安全部件下使用，同时将 CIN A 一粉末溶于 DMSO 中，配制成终浓度为 0.1 毫摩尔的溶液。将溶液分装至 0.5 毫升微量离心管中，并于 -20 摄氏度保存。注意，使用CIN时应采取适当的安全预防措施。该实验步骤可使用贴壁或非贴壁细胞进行。此处以人骨髓瘤细胞系RPMI 8 2 2 6为例进行演示。这些细胞在悬浮状态下生长，实验前24小时，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，使用含有10%胎牛血清和1%抗生素的RPMI 8226培养基培养细胞，并将细胞接种于6孔板中，使其处于细胞增殖曲线的对数生长期。实验时为测定衰老细胞百分比，需要三个细胞样本：未处理且未进行ST染色的细胞、未处理但用C12 FDG染色的细胞，以及经处理并用C12 FDG染色的细胞。每种条件下，进行流式细胞术检测癌细胞诱导衰老时，至少需要 5 × 10⁵ 个细胞。通过添加化疗药物阿霉素（doxorubicin），药物浓度和处理时间应根据细胞类型进行调整。本方案已用于 rpmi 8226 细胞的测试。可通过将每毫升六个细胞的十分之一以15纳摩尔的阿霉素处理48小时来诱导衰老。请勿忘记设置未经处理的样本作为阴性对照，并在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育。化疗药物处理可能导致细胞凋亡。因此，两天后，使用台盼蓝排斥法结合血细胞计数板、细胞计数仪和显微镜检测细胞活力。如果活力百分比低于70%，则使用适当的试剂盒（例如Miltenyi的死细胞去除试剂盒）去除死细胞，以确保死细胞不会对后续分析造成偏差。否则，以300 ×g离心5分钟，去除培养基。然后，去除上清液后，加入预热的新鲜培养基（含100 nmol/L安沙霉素或环己酰亚胺），以中和溶酶体的酸性pH，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时。将β-半乳糖苷底物C12FDG溶解于预热的新鲜培养基中，终浓度为2毫摩尔/升。在与雷帕霉素孵育后进行后续操作。将 C 12 FDG 直接加入细胞和培养基中，终浓度为 33 µM，在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育两小时。孵育结束后，在 4 °C 条件下以 300 × g 离心五分钟。离心后，用 PBS 重悬细胞，按前述方法每次离心并弃去上清液，共洗涤两次。将细胞沉淀重悬于 500 µL 冷 PBS 中，然后进行共免疫标记，以进一步表征衰老细胞群体。如果您没有流式细胞术相关经验，该实验中最困难的部分将是流式细胞术的分析操作。为确保实验成功，务必设置适当的对照，并根据需要向有经验的人员寻求帮助。在运行第一个样本之前，准备一个双参数图，显示前向散射通道（FSC）相对于侧向散射通道（SSC）。然后运行含有未标记细胞的第一个样本。设置光电倍增管（PMTs）并定义一个感兴趣区域，排除在样品制备过程中可能出现的死细胞和细胞碎片。该感兴趣区域在单参数直方图中显示，其中C12 FDG的荧光信号作为FL1显示在X轴的对数刻度上，Y轴表示事件数量。总事件数代表被分析的细胞数量。将PMT设置为使未标记的细胞在x轴对数刻度的第一级上显示。如有必要，可通过流式检测未标记细胞来确定细胞的自发荧光。在流式细胞仪上检测第二个样本（含未经处理的细胞），在显示FL1的一维直方图上，将光标置于微弱标记细胞群之后。该阈值可用于区分非衰老细胞（标记较暗）与衰老细胞（标记较亮）。运行含有经处理细胞的第三个样本，明亮标记的衰老细胞将出现在上一步确定的阈值之上。如有需要，可通过将明亮事件数除以总事件数来计算衰老细胞的百分比。也可通过平均荧光强度来评估β-半乳糖苷酶活性，以评价化疗处理所诱导的细胞衰老。本实验中，使用多发性骨髓瘤细胞系 RPMI 8226（商品化来源），经阿霉素（一种化疗药物）处理两天后，按照本视频所述方法检测细胞衰老。这些直方图显示了左侧为未处理细胞的荧光信号，右侧为处理后细胞的荧光信号。一群荧光标记明显的细胞（代表衰老细胞）出现在区域 V。同时，使用 β-半乳糖苷酶染色法对相同的细胞样本进行染色。在此代表性图像中，完全呈蓝色的细胞和部分呈蓝色的细胞被展示出来，以说明准确区分真正呈蓝色的衰老细胞的困难性。为了说明 C12FDG 在测定衰老细胞百分比中的特异性，细胞还接受了不同浓度的多柔比星处理。通过将明亮事件的数量除以总事件数量，计算出衰老细胞的百分比。在5、25和50纳摩尔阿霉素剂量下，衰老细胞的比例分别为0.8%、15.78%和26.31%。这表明C 12 FTG标记对衰老细胞具有特异性。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过流式细胞术定量衰老细胞，以及是否可以通过后续的免疫标记等方法对衰老细胞进行表征。请务必注意，操作DMSO或癌细胞时可能存在极高危险性，因此在进行该实验流程时应始终采取必要的安全防护措施。

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量化衰老癌症细胞的敏感方法

本视频展示了一种基于流式细胞术的检测方法，用于通过双衰老标志物定量治疗诱导的衰老癌细胞。衰老细胞的检测与定量涉及使用β-半乳糖苷酶底物。该底物被衰老细胞内活跃的溶酶体β-半乳糖苷酶切割，产生荧光产物，结合自发荧光的脂褐素颗粒，共同标记衰老的癌细胞。...

基于流式细胞术的治疗诱导癌细胞衰老定量分析

细胞衰老是一种不可逆的细胞周期停滞状态，可由多种细胞应激因素诱导。本文描述了诱导细胞衰老的实验方案以及检测衰老标志物的方法。...

诱导与定量细胞衰老的技术

本文讨论了一系列在培养细胞中诱导和验证细胞衰老的实验方案。我们重点关注不同的衰老诱导刺激，并描述了常见的衰老相关标志物的定量方法。我们以成纤维细胞为模型提供了技术细节，但这些方案可适用于多种细胞模型。...

原代人细胞中细胞衰老的诱导与验证

细胞内活性氧（ROS）已被证明在细胞衰老的诱导过程中发挥重要作用。本文介绍了一种用于定量细胞衰老过程中ROS水平的高灵敏度检测方法。同时，我们还提供了检测衰老相关分泌表型的实验方案，该表型据称与多种与年龄相关的功能障碍有关。...

正常人成纤维细胞在癌基因诱导衰老过程中活性氧与衰老相关分泌表型的定量检测

细胞衰老是慢性年龄相关性疾病发生的关键因素。靶向衰老细胞的治疗策略在延长健康寿命方面展现出广阔前景。本文介绍一种基于单细胞水平检测衰老相关β-半乳糖苷酶活性的新型筛选方法，用于鉴定senotherapeutics（抗衰老药物）。...

基于SA-β-半乳糖苷酶的筛选实验用于识别衰老细胞清除药物

本方案描述了使用脉冲式SILAC对衰老细胞和非分裂细胞进行代谢标记、非靶向质谱分析以及蛋白质半衰期的简化计算的工作流程。...

通过代谢标记与质谱法测定衰老及非分裂培养细胞中的蛋白质周转率

本文介绍了一种基于流式细胞术的单细胞水平多重衰老相关标志物的可视化与定量分析方法。...

同时成像与基于流式细胞术的多重荧光衰老标志物检测在治疗诱导的癌细胞衰老中的应用

本文介绍了一种通过荧光流式细胞术定量检测化疗药物在细胞培养或小鼠肿瘤模型中诱导的衰老癌细胞的实验方案。可选步骤包括共免疫染色、样本固定以方便大批量或多个时间点的分析，以及通过流式细胞分选富集存活的衰老细胞。...

远红光荧光衰老相关β-半乳糖苷酶探针用于通过流式细胞术鉴定和富集衰老肿瘤细胞

本研究利用三种方法评估了衰老相关分泌表型（SASP）因子对非衰老HeLa细胞的增殖效应，这些因子来源于衰老的HeLa细胞 体外...

利用三种不同方法的比较分析评估SASP因子对癌细胞增殖的影响

本方案介绍了利用反射光共聚焦显微镜对从人脂肪组织中分离的基质血管组分进行衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性的客观、单细胞水平检测。该方法可与免疫细胞化学染色兼容，包含pH对照以实现定量评估，并且相较于传统的SA-β-gal染色，具有更高的灵敏度和更低的主观性。...

使用反射光检测脂肪基质血管组分中的衰老现象

本文介绍了一种活细胞LysoTracker实验方案，用于检测IMR-90人成纤维细胞衰老过程中溶酶体的重塑变化。...

利用LysoTracker进行溶酶体示踪分析以定量评估人成纤维细胞的细胞衰老

学习使用流式细胞术快速定量检测衰老癌细胞的方法。本研究利用阿霉素诱导细胞衰老，通过C12FDG底物标记和流式分析实现高灵敏度定量，为癌症治疗药物筛选提供可靠工具。

一种定量衰老癌细胞的灵敏方法

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