量化衰老癌症细胞的敏感方法
2013年8月2日
无论是衰老阻止或促进肿瘤的发生仍存在争议。由于化学治疗药物可以诱导癌细胞衰老，衰老研究提出的新疗法是必不可少的。然而，标准的和广泛使用的β-半乳糖苷酶测定的主要缺点。在这里我们提出一种快速，灵敏的基于流式细胞仪检测，以量化衰老。
该程序的总体目标是以快速和灵敏的方式量化细胞衰老。在这里，我们展示了这种方法在筛选潜在化疗药物中的效用。首先诱导细胞衰老。
化疗药物阿霉素被添加到癌细胞中。接下来，使用 Bain A one 来中和细胞溶酶体的酸性 pH 值。然后在细胞摄取时加入细胞渗透性 β 半乳糖底物 C 12 FDG。
C 12 FDG 被水解并发出荧光。由于 β GCSE 在衰老细胞的溶酶体中富集，因此它们比非衰老细胞更具荧光。为了量化荧光的差异，在流式细胞仪上运行细胞，对所得数据进行分析，从而可以量化不同治疗条件下衰老癌细胞的百分比。
例如，与现有方法（如 β 半乳糖）相比，该技术的主要优点是它有助于快速、灵敏地定量衰老细胞。事实上，当我们在使用常用的 β 半乳糖 asay 量化衰老细胞时遇到困难时，我们首先添加了这种方法的想法。虽然我们使用这种技术来检测癌细胞的衰老，但它也可以用于正常细胞。
这种方法可以帮助回答癌症领域的快速问题，例如化疗药物是否会诱导癌细胞 sse，这可能会促进恶性肿瘤。因此，这项技术最终可以帮助通知癌症的新治疗方法。在化学通风橱中工作，将 C 12 FDG 粉末溶解在 DMSO 中，最终浓度为 20 毫摩尔等分试样，溶于 0.5 毫升浓度的 einor 管中，并在零下 80 摄氏度下储存。
DMSO 应在适当的安全条件下使用，也应溶解。CIN A 一种粉末的 DMSO 溶液，终浓度为 0.1。毫摩尔 Eloqua 将溶液放入 0.5 毫升微量离心管中，并储存在零下 20 摄氏度。
请注意，CIN 应在采取适当的安全预防措施的情况下使用。该程序可以使用贴壁或非贴壁细胞进行。这里使用人骨髓瘤细胞系 RPMI 8 2 2 6 演示了该程序。
这些细胞在悬浮液中生长，在37摄氏度下在含有 10% FBS 和 1% 抗生素的培养基中培养 RPMI 8 2 2 6 细胞，在进行实验前 24 小时将细胞接种在六个孔板中，以便它们处于细胞增殖曲线的对数期。在实验时要确定衰老细胞的百分比，需要三个细胞样品。未处理和未 ST 染色的细胞、C 12 FDG 染色的未处理细胞以及 C 12 FTG 染色的处理细胞。
对于每种情况，流式细胞术诱导的癌细胞衰老至少需要 5 乘以 10 到第 5 个细胞。通过添加化疗药物阿霉素，药物浓度和治疗持续时间应适应细胞类型。经过 rpmi 8 2 2 6 细胞测试。
用 15 纳摩尔阿霉素处理每毫升 6 个细胞中的第 10 个细胞 48 小时，可诱导衰老。不要忘记加入未经处理的样品作为阴性对照，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育。化疗药物治疗可能导致细胞凋亡。
因此，两天后，使用血液、细胞仪和显微镜通过 trian 蓝排除检查细胞活力。如果活力百分比低于 70%，则使用合适的试剂盒（例如 Milton E 的死细胞去除试剂盒）去除死细胞，以确保死细胞不会使后续分析产生偏差。否则，将细胞在 300 GS 下旋转 5 分钟以去除培养基。
然后，在含有 100 个 anom 或 cin 的 Prewarm 新鲜培养基中取出上清液后，为了中和溶酶体的酸性 pH 值，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 1 小时，溶解战前新鲜培养物中的 β 半乳糖 a 底物 C 12 FDG。中等至终浓度为 2 毫摩尔。与 beil mycin 孵育后。
将 C 12 FDG 直接加入细胞和培养基中，最终浓度为 33。微摩尔在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 2 小时。孵育后，将细胞在 4 摄氏度下以 300 G 离心 5 分钟。
离心后，用 PBS 洗涤细胞两次，每次像以前一样旋转，第二次洗涤后去除上清液。Resus 将细胞沉淀悬浮在 500 μL 冷 PBS 中，然后进行免疫共标记，以进一步表征衰老细胞群。如果您没有流式细胞术的经验，该程序最困难的方面将是进行流式细胞术分析。
为确保成功，请务必包括适当的控制措施，并根据需要寻求无经验人员的帮助。在运行第一个样品之前，准备一个双参数图形，显示前向散射通道或 FSC 与侧向散射通道 SSC。然后运行包含未标记细胞的第一个样品。
设置光电倍增管或 PMT 并定义感兴趣区域，不包括样品制备门期间可能出现的死细胞和细胞碎片。单参数直方图中的这个感兴趣区域在 x 轴的对数刻度上显示为 FL 1，在 Y 轴的对数刻度上显示事件数。事件总数表示分析的单元格数。
设置 PMT，使未标记的细胞出现在 x 轴的对数刻度上的前十年。如有必要，通过在流式细胞中运行未标记的细胞来确定细胞的自发荧光。细胞仪在显示 FL 的单参数直方图上运行包含未处理细胞的第二个样品，将光标放在标记模糊的群体之后。
该阈值将允许区分非衰老细胞（标记较暗）和衰老细胞（标记较亮）。运行包含处理细胞的第三个样品。亮标记的衰老细胞出现在上一步确定的阈值以上。
如果需要，通过将明亮事件的数量除以事件总数来评估衰老细胞的百分比。也可以使用平均荧光强度来估计 β 半乳糖 tase 的活性，以评估化疗程序诱导的衰老。市售的多发性骨髓瘤细胞系 R RRP I 8 2 2 6 用阿霉素处理两天，阿霉素是一种化疗药物和衰老测定法，如本视频所述，这些直方图显示左侧未处理细胞和右侧处理细胞的荧光。
代表衰老细胞的亮标记细胞群出现在平行区域 V.In，使用 β 半乳糖 sase 测定对相同的细胞样品进行染色。在这张具有代表性的图片中，显示了完全蓝色的细胞和部分蓝色的细胞，以说明区分真正蓝色衰老细胞的困难。为了说明 C 12 FDG 在测定衰老细胞百分比中的特异性，还用不同浓度的阿霉素处理细胞。
衰老细胞的百分比是通过除以明亮事件的数量来确定的。根据事件总数，剂量为 5、25 和 50 纳摩尔多柔比星的衰老细胞百分比分别为 0.8%、15.78% 和 26.31%。这表明 C 12 FTG 标记对衰老细胞具有特异性。
观看此视频后，您应该对如何通过流式细胞术定量衰老细胞有一个很好的了解，然后执行免疫标记等方法以表征衰老细胞。不要忘记，使用 DMSO 或癌细胞可能非常危险。执行此过程时应始终采取预防措施。
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概述
本研究提出了一种基于流式细胞术的快速、敏感的细胞衰老量化分析方法，解决了标准β-半乳糖苷酶分析方法的局限性。该方法使用化疗药物多柔比星诱导癌细胞衰老进行演示。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 癌症研究
- 药理学
背景
- 衰老在肿瘤发生中的作用存在争议。
- 化疗药物可以诱导癌细胞衰老。
- 当前用于测量衰老的分析方法存在显著缺陷。
- 流式细胞术为更准确的量化提供了潜在解决方案。
研究目的
- 开发新的细胞衰老量化分析方法。
- 评估化疗药物在诱导衰老中的有效性。
- 提供比现有方法更敏感、更快速的替代方案。
使用的方法
- 使用多柔比星诱导细胞衰老。
- 用Bain A中和细胞溶酶体中的酸性pH。
- 使用β-半乳糖基底物C 12 FDG进行细胞摄取测量。
- 流式细胞术用于衰老的量化。
主要结果
- 新的分析方法有效量化癌细胞中的衰老。
- 多柔比星成功诱导衰老，如研究中所示。
- 与传统方法相比，流式细胞术提供了快速和敏感的结果。
- 该方法可以应用于筛选其他潜在的化疗药物。
结论
- 基于流式细胞术的分析方法是研究衰老的有前景的工具。
- 该方法可能会增强新型癌症治疗的开发。
- 需要进一步研究以探索其在各种情况下的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantifying senescent cancer cells is critical for evaluating chemotherapeutic efficacy and understanding treatment-induced phenotypic shifts that may influence tumor progression or therapeutic resistance. This flow cytometry-based method provides a rapid, sensitive readout to support target validation and mechanistic de-risking in oncology drug discovery. By enabling high-throughput assessment of senescence induction, it informs go/no-go decisions and portfolio prioritization in preclinical development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying senescence as a functional readout of chemotherapeutic mechanism of action.
- Operational Value: Enables rapid screening of compound libraries to identify senescence-inducing agents with improved predictive confidence.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by distinguishing senescence from apoptosis or proliferation in treated cancer cell populations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence data to establish dose-response relationships for senescence-inducing compounds.
- Operational Value: Delivers reproducible, high-sensitivity measurements compatible with flow cytometry platforms for scalable assay implementation.
- Scientific Value: Permits multiplexing with immunolabeling to correlate senescence with specific cellular markers or pathways.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links in vitro senescence induction to potential in vivo treatment outcomes, supporting translational biomarker alignment.
- Operational Value: Facilitates longitudinal monitoring of senescence dynamics across treatment durations and dosing regimens.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by quantifying the proportion of senescent cells under varying therapeutic conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the oncology discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy assessment, providing a quantitative senescence readout that informs mechanistic understanding and compound selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring senescence induction as a downstream effect of chemotherapeutic exposure.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs for evaluating compound libraries in a standardized, sensitive format.
- Analytics: Provides fluorescence-based readouts and percentage calculations enabling statistical comparison of treatment conditions.
- Translational Research: Connects cellular senescence data to potential therapeutic outcomes, supporting biomarker-driven decision making.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable flow cytometry workflow applicable across cancer models and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in phenotypic responses to treatment.
- Operational Value: Enhances reproducibility and throughput compared to traditional β-galactosidase assays, accelerating screening timelines.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early identification of senescence-inducing compounds, reducing late-stage attrition risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of drug candidates based on quantifiable senescence induction profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry setup, compensation, and gating strategies for accurate fluorescence quantification.
- Dependent on access to flow cytometers with appropriate fluorescence detection channels and software for histogram analysis.
- Necessitates standardized cell preparation and staining protocols to ensure assay consistency across experiments and users.
- Involves optimization of drug concentration and exposure time for senescence induction across different cancer cell lines.
- Requires inclusion of viability controls to exclude apoptotic or necrotic cells that may confound senescence measurements.
