Name: 该在OVO CAM作为一个肉瘤Xenograftmodel的检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-17T21:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: 学习使用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）检测技术研究肉瘤细胞行为与肿瘤宿主相互作用。该方法操作简便、成本低廉，无需伦理审批，可用于评估肿瘤微环境重建和基质细胞募集，为肉瘤个性化治疗提供新见解。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SW1353 软骨肉瘤细胞系的细胞由荷兰莱顿大学的 P.C.W. Hogendoorn 教授博士和 J. Bovée 教授博士惠赠。我们感谢 J. Mestach 和 G. Wagemans 提供出色的技术协助，感谢 G. De Bruyne 为本实验方案的示意图绘制提供了专业支持。

概述请参见图1。
肿瘤组织
1. 肿瘤样本的获取与制备
使用患者材料需获得伦理委员会的批准，并且必须从患者处获取知情同意。
<ol>
 <li>在干预时采集具有代表性的组织样本（至少 1 cm3），可以是肉瘤的活检或切除组织。活检的合适部位应通过动态增强 MRI 确定。</li>
 <li>立即将组织样本放入含有 DMEM 的无菌小瓶中，DMEM 中需添加 1,000 U 青霉素和 1 mg/ml 链霉素。</li>
 <li>立即（30–90 分钟内）将小瓶运送至实验室。</li>
</ol>
所有后续操作均在层流条件下进行。
<ol start="4">
 <li>将小瓶中的内容物倒入无菌培养皿中。</li>
 <li>使用无菌手术刀将肿瘤样本切成最大体积为 1 mm3 的小块。去除所有钙化组织，因其会影响后续组织处理。</li>
 <li>随机选取 10 个肿瘤移植物用于 CAM 接种。</li>
</ol>
2. 肿瘤来源单细胞悬液的制备
预计耗时：3 小时。
<ol>
 <li>称量样品的剩余组织。</li>
 <li>将 2 - 4 g 组织放入解离管中，若需消化全部剩余肿瘤组织，可能需要使用多个解离管。</li>
 <li>对于 2 - 4 g 组织的消化，加入 2.5 ml 胶原酶 2 溶液（500 U/ml RPMI 1640）和 2.5 ml DNase 溶液（22 KU/ml RPMI 1640）。</li>
 <li>按照解离仪 h_tumor 方案处理组织。该过程包括在 CO2 培养箱中于 37 °C 孵育 2 个循环，同时轻轻振荡解离管 30 分钟。</li>
 <li>通过 150 μm 细胞滤筛过滤剩余悬液。</li>
 <li>以 1,000 rpm 离心裂解物 5 分钟。</li>
 <li>弃去上清液。</li>
 <li>将沉淀重悬于 10 ml 红细胞裂解缓冲液（ELB）中，孵育 10 分钟，期间定期混悬。</li>
</ol>
注意：红细胞裂解缓冲液的配制方法如下：将 0.037 g EDTA、0.99 g K2HPO4、8.29 g NH4Cl 加入 1,000 ml 水中，用 10 N NaOH 将 pH 值调节至 7.3，通过 0.22 μm 滤器加压过滤。4 °C 保存。
<ol start="9">
 <li>加入 25 ml 培养基（DMEM，添加 10% 胎牛血清、100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素）以终止反应。</li>
 <li>将悬液在 1,000 rpm 下离心 5 分钟。此时沉淀应呈白色。</li>
 <li>弃去上清液。</li>
 <li>向沉淀中加入 5 ml 培养基。通过 70 μm 细胞筛过滤悬液。</li>
 <li>使用自动细胞计数仪测定每毫升活细胞数量。</li>
</ol>
3. 癌细胞系
表达增强型绿色荧光蛋白的SAOS2骨肉瘤细胞（ATCC编号：HTB-85）使用Cell Line Nucleofector试剂盒V，按照制造商提供的方案通过电穿孔法转染peGFP-C1载体。为建立稳定细胞系，转染后的细胞根据既往 established 方案在G418（1 mg/ml）中筛选4周20。此外，根据制造商说明书，通过荧光激活细胞分选（FACS）进行细胞分选。
使用红色荧光脂溶性膜染料对标记SW1353软骨肉瘤细胞系（ATCC编号：HTB-94）或 freshly prepared肿瘤单细胞悬液进行标记。
<ol>
 <li>使用胰蛋白酶（0.5% 质量/体积）-乙二胺四乙酸（EDTA；0.2% 质量/体积）溶液，以常规方法从培养瓶中消化并收集细胞。</li>
 <li>将细胞悬液在 1,000 rpm 条件下离心 5 分钟。</li>
 <li>弃去上清液。</li>
 <li>每 106 个细胞加入 1 ml 无血清培养基和 5 μl DiI（Vybrant Red）。</li>
 <li>用铝箔纸包裹离心管，置于 37 °C 的 CO2 培养箱中孵育 10 分钟。</li>
 <li>再次在 1,000 rpm 条件下离心 5 分钟，并弃去上清液。</li>
</ol>
绒毛尿囊膜实验
1. 卵的孵化
<ol>
 <li>需要来自本地商业孵化场的受精卵，该孵化场需保证卵子受精率达到95%。</li>
 <li>受精卵可在室温下储存最多10天。</li>
</ol>
注意：在开始孵育前，需通过用纸巾进行干擦的方式，机械性地仔细去除蛋壳上的污垢、羽毛和粪便，应选用表面粗糙而非柔软的纸巾。使用70%变性乙醇或其他任何清洁试剂擦拭鸡蛋会显著降低雏鸡胚胎的存活率。
<ol start="3">
 <li>将鸡蛋放置于孵化箱中，使其侧放，并标记上表面。将鸡蛋放入孵化箱的当天记为胚胎发育的第0天。</li>
 <li>设定孵化温度为37.8 °C，湿度为47%。确保关闭自动旋转功能。</li>
</ol>
2. 卵的开启
持续时间： &plusmn; 25枚卵，60分钟。
在发育第3天，在层流条件下打开鸡蛋。若在更晚的发育阶段开壳，会导致绒毛尿囊膜（CAM）受损，因为此时膜容易粘附在蛋壳上。操作过程中使用红外灯以保持鸡蛋温度。为提高无菌性，建议佩戴手套操作。
<ol>
 <li>将鸡蛋放入蛋杯中，有标记的一面朝上。</li>
 <li>通过在鸡蛋尖端插入一根18 G针头，抽出2 ml蛋清，以降低绒毛尿囊膜（CAM）的液面。若针头在穿刺多个蛋壳后变钝，需更换针头；否则需施加过大的力，可能导致蛋黄受损或蛋壳破裂。有时针头会被系带（chalazae）堵塞，系带是悬浮蛋黄于蛋清中的两条螺旋状结构之一。可通过轻轻下推注射器活塞，直至堵塞解除。若蛋黄被吸入注射器，应同时更换针头和注射器。此情况发生后，有时胚胎会死亡。若抽出的蛋清量不足，在移除蛋壳时会损伤绒毛尿囊膜（CAM）。</li>
 <li>在蛋壳标记的上表面贴附一层半透性粘性膜，以防止切割窗口时蛋壳碎片落入绒毛尿囊膜（CAM）上。</li>
 <li>用小锥子在蛋壳表面打一个导入孔。</li>
 <li>使用无菌的尖头手术剪，在蛋壳上剪出一个1 cm2的窗口。</li>
 <li>可在蛋黄表面观察到胚胎搏动的心脏及其相连的血管。移除未受精的鸡蛋或已死亡的胚胎。血管呈现中断状态是胚胎死亡的特征。</li>
 <li>用半透性粘性膜封闭窗口。除非针头插入时导致蛋壳开裂，否则无需覆盖穿刺部位。</li>
</ol>
3. 接种操作步骤
持续时间： &plusmn; 每细胞系1小时。
在鸡胚发育第9天，于层流罩中对鸡蛋进行接种。
评估癌细胞在绒毛尿囊膜（CAM）上的扩散情况时，需要在接种过程中将细胞限制在有限的表面区域。Matrigel 是一种来源于 Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤的细胞外基质（ECM）凝胶，常用于实验性细胞培养条件。它在低温下呈液态，但当温度升至 20 - 40 °C 时会发生热诱导的聚合反应，从而形成稳定的凝胶。实验过程中，Matrigel 保存在装有融冰的容器中。
注意：我们坚持不使用带孔的盖玻片。我们观察到移植的癌细胞会附着并生长在塑料圆盘上，从而影响细胞在膜本身上的生长潜能。
<ol>
 <li>将细胞沉淀重悬于预冷的ECM凝胶中，细胞浓度为106 细胞/100 &mu;l ECM凝胶。将此溶液置于融化的冰上保存。</li>
 <li>在超净工作台内，使用无菌手术剪切除部分半透膜。若完全移除粘性膜，将因污染导致更高比例的胚胎死亡。</li>
 <li>用无菌玻璃棒轻轻触碰气室下方的绒毛尿囊膜（CAM），以去除上皮细胞层。使用无菌玻璃棒触碰CAM比使用手术刀更为温和，创伤更小。&deg; 11，这需要更高的灵巧性和经验。可能会出现少量出血。</li>
 <li>添加肿瘤组织。</li>
 <li>对于肿瘤移植物：用无菌镊子轻轻将一块组织放置于绒毛尿囊膜上，不要挤压。</li>
 <li>对于ECM凝胶操作步骤：加入4x 25 &mu;将细胞-ECM凝胶悬液逐层添加到CAM上，每层之间允许ECM凝胶聚合，从而形成含有癌细胞的黏附斑块。</li>
 <li>用半透性粘性膜再次密封外壳窗口。</li>
</ol>
4. CAM 的成像与采集
耗时：25 个卵需 2 小时。
在鸡胚发育第16天，收获CAM。此操作无需在层流工作台中进行。
<ol>
 <li>使用手术剪扩大窗口。注意不要剪得过低，否则会损伤绒毛尿囊膜（CAM），导致受损血管出血。</li>
 <li>用移液器向含有接种材料的CAM区域加入300–500 μl PBSD。若未使用荧光探针，可使用缓冲甲醛溶液，因其可使膜变硬，便于切割。</li>
 <li>通过配备数字彩色相机的体视荧光显微镜，使用GFP或DSR滤光片以及无滤光片模式，对蛋内的CAM进行拍照。对于肿瘤移植样本，所有照片均在无滤光片条件下拍摄。拍摄时强烈建议使用LED光源从上方照明（图2）。</li>
 <li>记录标记细胞的肿瘤细胞迁移情况。肿瘤边界可能不规则且呈锯齿状，肿瘤边缘附近可见散在的细胞。在某些样本中，可观察到成行排列的肿瘤细胞（图3）。</li>
 <li>用无菌剪刀沿紧贴蛋壳的边缘剪下膜组织。</li>
 <li>将收获的CAM置于盛有PBSD或缓冲甲醛溶液的无菌培养皿中。</li>
 <li>对CAM的上表面和下表面分别在有滤光片和无滤光片条件下拍照。</li>
 <li>将膜组织放入标记好的容器中，用缓冲甲醛溶液固定至少72小时。</li>
 <li>将CAM包埋于石蜡中，并准备进行组织学检查。切取肿瘤移植物时应确保在结节中心处切开，并使切面与包埋盒底部平行，否则无法清晰观察CAM与肿瘤移植物之间的相互作用。ECM凝胶斑块的处理策略相同：面向切片刀的表面应与凝胶斑块垂直。</li>
</ol>
5. 组织学评估
必要时进行苏木精-伊红染色和Ki-67免疫组织化学染色以进一步明确诊断。免疫组织化学染色采用自动载玻片染色仪，按照制造商说明书对3.5 μm厚的福尔马林固定石蜡包埋组织切片进行操作。使用小鼠抗Ki-67的单克隆一抗（克隆号MIB-1，稀释度1/100）。采用Cell Conditioning 1进行热诱导表位修复，并使用通用DAB检测试剂盒按照制造商说明书进行显色。组织切片的脱水步骤通过自动盖玻片机完成。
对于 SAOS2 和 SW1353 细胞系，在三个区域中分别计数每 100 μm2 内 Ki67 阳性和 Ki67 阴性细胞核的数量：一个区域靠近 CAM 边界，一个靠近表面，另一个位于 ECM 凝胶斑块的中心。每张 Ki-67 染色切片重复该操作 6 次。通过将 Ki67 阳性细胞数除以计数的细胞总数，计算每张切片的增殖指数。
细胞核内染色质精细分布的丧失，伴随细胞边界清晰度的减弱，被定义为坏死。对于异种移植瘤，坏死程度被评分分为完全坏死、部分坏死（常出现在表面）或无坏死。肿瘤细胞浸润至尿囊绒毛膜（CAM）的定义是在CAM中胚层内观察到肿瘤细胞，其评分分为存在或不存在。
宿主行为的评估包含三个指标。成纤维细胞浸润定义为长梭形细胞从绒毛尿囊膜（CAM）移出并侵入肿瘤移植物/斑块，其评分标准为存在或不存在。血管长入可通过增殖的鸡源性血管长入情况进行观察，其特征为可见含有细胞核的鸡红细胞。

<ol><li>Mankin, H. J., Hornicek, F. I., Rosenberg, A. E., Harmon, D. C., Gebhardt, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+data+for+648+patients+with+osteosarcoma+treated+at+one+institution%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Orthopaedics+and+Related+Research%22%5BJournal%5D)">Survival data for 648 patients with osteosarcoma treated at one institution.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 429, 286-291 (2004).</li>
<li>Hoffmann, J., Schmidt-Peter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+drug+sensitivity+and+expression+of+multidrug+resistance+markers+in+early+passage+human+sarcomas%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Anticancer drug sensitivity and expression of multidrug resistance markers in early passage human sarcomas.</a> Clinical Cancer Research. 5, 2198-2204 (1999).</li>
<li>Greenlee, R. T., Hill-Harmon, M. B., Murray, T., Thun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2001%5BTitle%5D)+AND+%22CA+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2001.</a> CA A Cancer Journal for Clinicians. 51, 15-36 (2001).</li>
<li>Gil-Benso, R., Lopez-Gines, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterisation+of+a+continuous+human+chondrosarcoma+cell+line%2C+ch-2879%3A+Comparative+histologic+and+genetic+studies+with+its+tumor+of+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigations%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterisation of a continuous human chondrosarcoma cell line, ch-2879: Comparative histologic and genetic studies with its tumor of origin.</a> Laboratory Investigations. 83, 877-887 (2003).</li>
<li>Taylor, B. S., Barretina, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+sarcoma+genomics+and+new+therpeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Advances in sarcoma genomics and new therpeutic targets.</a> Nature Reviews Cancer. 11, 541-557 (2011).</li>
<li>Skubitz, K. M., D'Adamo, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clinic+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Sarcoma.</a> Mayo Clinic Proceedings. 82, 1409-1432 (2007).</li>
<li>Nielsen, T. O., West, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+gene+expression+into+clinical+cara%3A+sarcomas+as+a+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Translating gene expression into clinical cara: sarcomas as a paradigm.</a> Journal of Clinical Oncology. 28, 1796-1805 (2010).</li>
<li>Vaira, V., Fedele, G., Pyne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 107, 8352-8356 (2010).</li>
<li>DeRose, Y. S., Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology%2C+growth%2C+metastasis+and+disease+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).</li>
<li>Tentler, J. J., Tan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+tumour+xenografts+as+models+for+oncology+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).</li>
<li>Bertotti, A., Migliardi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecularly+annotated+platform+of+patient-derived+xenografts+%28%22xenopatients%22%29+identifies+HER2+as+an+effective+therapeutic+target+in+cetuximab-resistant+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer.</a> Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).</li>
<li>Decaudin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+human+tumor+xenografted+models+%28%27tumorgrafts%27%29+for+good+management+of+patients+with+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Drugs%22%5BJournal%5D)">Primary human tumor xenografted models ('tumorgrafts') for good management of patients with cancer.</a> Anticancer Drugs. 22, 827-841 (2011).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+The+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: The next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li>
<li>Sys, G., Van Bockstal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+sarcoma+patients+tumor+morphology%2C+viability%2C+and+invasion+potential+and+indicate+disease+outcomes+in+the+chick+chorioallantoic+membrane+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from sarcoma patients tumor morphology, viability, and invasion potential and indicate disease outcomes in the chick chorioallantoic membrane model.</a> Cancer Letters. 326, 69-78 (2012).</li>
<li>Armstrong, P. B., Quigley, J. P., Sidebottom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+invasion+and+intramesenchymal+infiltration+of+the+chick+embryo+chorioallantois+by+tumor+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Transepithelial invasion and intramesenchymal infiltration of the chick embryo chorioallantois by tumor cell lines.</a> Cancer Research. 42, 1826-1837 (1982).</li>
<li>Deryugina, E., Quigly, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+model+systems+to+study+and+visualize+human+tumor+cell+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130, 1119-1130 (2008).</li>
<li>Knighton, D., Ausprunk, D., Tapper, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avascular+and+vascular+phases+of+tumor+growth+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo.</a> British Journal of Cancer. 35, 347-356 (1977).</li>
<li>Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+ex+ovo+culture+and+ex+ovo+CAM+assay%3A+how+it+really+works%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works.</a> J. Vis. Exp. (33), e1620(2009).</li>
<li>Balke, M., Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+characterization+of+osteosarcoma+growth+on+the+chick+chorioallantoic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane.</a> BMC Research Notes. 3, 58(2010).</li>
<li>Hendrix, A., Maynard, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+secretory+small+GTPase+Rab27B+on+breast+cancer+growth%2C+invasion%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Effect of the secretory small GTPase Rab27B on breast cancer growth, invasion, and metastasis.</a> Journal of the National Cancer Institute. 102, 866-880 (2010).</li>
<li>Ausprunk, D., Knighton, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+of+normal+and+neoplastic+tissues+grafted+to+the+chick+chorioallantois%3A+role+of+host+and+preexisting+graft+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Vascularization of normal and neoplastic tissues grafted to the chick chorioallantois: role of host and preexisting graft vessels.</a> American Journal of Pathology. 79, 597-618 (1975).</li>
<li>Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Riciardelli, C., Oehler, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+Chorioallantoic+membrane+%28CAM%29+Assay+as+an+in+vivo+model+to+study+the+effect+of+newly+identified+molecules+on+ovarian+cancer+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Chick Chorioallantoic membrane (CAM) Assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 13, 9959-9970 (2012).</li>
<li>Vargas, A., Zeisser-Labouèbe, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick+embryo+and+its+chorioallantoic+membrane+%28CAM%29+for+the+in+vivo+evaluation+of+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 59, 1162-1176 (2007).</li>
<li>Hagedorn, M., Javerzat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessing+key+steps+of+human+tumor+progression+in+vivo+by+using+an+avian+embryo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102, 1643-1648 (2005).</li>
<li>De Wever, O., Hendrix, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+and+quantification+of+cancer+cell+invasion+through+collagen+type+I+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling and quantification of cancer cell invasion through collagen type I matrices.</a> International Journal of Developmental Biology. 54, 887-896 (2010).</li>
<li>Albini, A., Benelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemoinvasion+assay%3A+A+method+to+assess+tumor+and+endothelial+cell+invasion+and+its+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The chemoinvasion assay: A method to assess tumor and endothelial cell invasion and its modulation.</a> Nature Protocols. 2, 504-511 (2007).</li>
<li>Hanahan, D., Coussens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessories+to+the+crime%3A+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

接种与收获时间
接种时间的确定采用SAOS2细胞在ECM凝胶中进行（共36个CAM），接种时间在胚胎发育的第5天至第10天之间变化。
在孵育第9天之前，绒毛尿囊膜（CAM）的尺寸尚不足以稳定支撑我们所施加的细胞外基质（ECM）凝胶。在收获时，肿瘤细胞有时需从较深的CAM层中回收，部分ECM凝胶样本则松散地漂浮在蛋清中或位于CAM表面。在第5和第6天接种时，难以避免将肿瘤细胞直接接触鸡胚，从而导致鸡胚畸形或死亡。自第9天起，大多数鸡蛋中的CAM已完全覆盖窗口下方的区域，且ECM凝胶斑块在收获时能牢固黏附于CAM表面。因此，我们确定鸡胚发育第9天为最佳接种时间。
为了确定最佳收获时间，SAOS2 和 SW1353 分别在接种后第 1、2（仅 SAOS2-GFP）、4、5、6、7 和 8 天，或在胚胎发育第 10 至 17 天期间收获。根据这些变化，观察到在 CAM 上的应用时间长度差异为 1 至 12 天。
Knigh...

肉瘤是一种罕见的结缔组织肿瘤，由于对治疗产生耐药性，其死亡率较高1,2。患者生存率的提高受到以下因素的限制：年发病率低、肿瘤类型高度异质，以及据报道肉瘤细胞在体外培养中难以生长in vitro3,4。
利用培养细胞进行临床前治疗评估已表明，一些新的、看似具有活性的分子 体外 并不总能反映临床环境中的结果。此外，基因表达芯片揭示的基因组异常并不总是与个体患者的肿瘤行为特征相关。5-7为了解决这些问题，个性化医学的重要性日益凸显，这体现在对异种移植模型的需求不断增加8-12.
一个 体内 该检测方法能够反映实体瘤中癌细胞与宿主组织微环境之间复杂的相互作用，而这种相互作用对于癌细胞的增殖和侵袭至关重要13目前我们正在研究使用绒毛尿囊膜实验（CAM实验）作为肉瘤可重复的异种移植模型14,15该检测方法被广泛用于肿瘤血管生成的研究。16,17然而，在文献中，我们发现该实验存在不同的实验方案，而其他研究则观察到，根据不同的实验方案，其生长或血管生成表现出显著差异。18,19.
本文中，我们利用肿瘤移植物、肿瘤来源的单细胞悬液以及已建立的肉瘤细胞培养物，研究了CAM实验中不同条件对细胞行为的影响。

<table><tbody><tr><td>细胞系核转染试剂盒 V</td><td>Amaxa</td><td>VCA-1003</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 2 溶液（500 U/ml RPMI 1640）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DNase 溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Invitrogen</td><td>11811031</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1270</td><td></td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗体 Ki67</td><td>Dako Denmark</td><td>MIB-1</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Fluka</td><td>D76240</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>20012019</td><td></td></tr><tr><td>PBS&lt;sup&gt;D&lt;/sup&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>14040083</td><td></td></tr><tr><td>peGFP-C1 载体</td><td>Clontech</td><td>632470</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>22409-015</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>Invitrogen</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant 细胞标记 DiI</td><td>Lifetechnologies</td><td>22885</td><td></td></tr><tr><td>Countess 自动细胞计数仪</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>数码彩色相机</td><td>Leica</td><td>DFC 340 FX</td><td></td></tr><tr><td>数字式蛋孵箱</td><td>Auto Elex Co</td><td>R-COM 50</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSAriaIII</td><td></td></tr><tr><td>Gentlemacs C 型管</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>Gentlemacs 组织解离仪</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>含 h_tumor 方案的 Gentlemacs 解离仪用户手册</td><td>Miltenyi Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>半透性粘性薄膜（Suprasorb F）</td><td>Lohmann&amp;amp;Rauscher</td><td>20468</td><td></td></tr><tr><td>体视荧光显微镜</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Film 自动盖片机</td><td>Sakura</td><td>6400</td><td></td></tr><tr><td>ultraView 通用 DAB 检测试剂盒</td><td>Ventana Medical Systems Inc</td><td>760-500</td><td></td></tr><tr><td>Ventana 自动玻片染色机</td><td>Ventana Medical Systems</td><td>Benchmark XT</td><td></td></tr></tbody></table>

鸡胚尿囊膜上的 in ovo cam-实验作为肉瘤的异种移植模型

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

肉瘤是一种极为罕见且具有异质性的疾病，这些特点均阻碍了新疗法的开发。肉瘤患者在经过分层后是实施个体化治疗的理想候选者，这也解释了目前人们为何致力于开发一种可重复且低成本的该疾病异种移植模型。鸡胚尿囊绒毛膜是一种天然的免疫缺陷宿主，能够支持移植物组织和细胞的生长，且不受物种特异性的限制。此外，该膜易于接触、操作，并可通过光学和荧光体视显微镜进行成像观察。组织学分析还可进一步实现对异源性细胞相互作用的详细研究。
本方案详细描述了将新鲜的肉瘤来源肿瘤组织、单细胞悬液以及稳定转染和瞬时荧光标记的已建立肉瘤细胞系（Saos-2 和 SW1353）在鸡胚内接种至尿囊绒毛膜（in ovo）的技术。鸡胚存活率可达 75%。该模型可用于研究移植物相关指标（活性、Ki67 增殖指数、坏死、浸润）以及宿主反应（成纤维细胞浸润、血管长入）。对于单细胞悬液的局部接种，ECM 凝胶相较于惰性包埋材料具有显著优势。Ki67 增殖指数与细胞距离尿囊绒毛膜（CAM）表面的深度以及细胞在 CAM 上作用的时间有关，后者决定了添加治疗药物的时间窗口。

CAM 的评估
肿瘤移植物会黏附于尿囊绒毛膜（图 2A）。来自患者组织的单细胞悬液常呈现干燥、略微隆起的斑块状结构（图 2D）。切除尿囊绒毛膜后，膜会出现明显的皱缩现象（图 2E 和 图 2F）。
对于商业细胞系，随着时间推移，病灶会变得更加不透明，表明细胞增殖。不同细胞系在ECM凝胶中于鸡胚尿囊膜（CAM）上表现出独特的生长模式。SAOS2形成扩散性病灶，自接种后第7天起表面显著增大，同时GFP信号保持较强，提示细胞具有活性。SAOS2细胞的迁移可沿CAM的血管平行可视化（图3）。通过体视显微镜观察时，若不使用滤光片，可见到血管结构，但肿瘤细胞无法分辨；而插入GFP滤光片后则无法观察到血管。通过交替切换滤光片的开启与关闭，可清晰看到迁移细胞与血管之间的紧密接触。病灶内部可观察到点状出血（图4， 第...

将新鲜的肉瘤来源肿瘤组织、单细胞悬液以及稳定和瞬时荧光标记的永生化肉瘤细胞系移植到鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）上。in ovo 模型用于研究移植物（存活率、Ki67 增殖指数、坏死、浸润）和宿主（成纤维细胞浸润、血管长入）的行为特征。

鸡胚尿囊膜上的 in ovo CAM-实验作为肉瘤的异种移植模型

肉瘤是一种极为罕见且具有异质性的疾病，这些特点均阻碍了新疗法的开发。肉瘤患者是……的理想候选人群。

本实验的总体目标是通过鸡胚尿囊绒毛膜（CAM） assay 研究肉瘤、细胞或移植物的行为。该过程首先在孵化第三天于鸡蛋壳上开一个窗口；第二步在孵化第九天，制备肿瘤材料。随后去除上皮层，将肿瘤接种至鸡胚尿囊膜（CAM）上。在孵育第16天的最后一步，对CAM进行拍照，随后收获并用福尔马林固定，以进行组织学评估。最终通过经典的苏木精-伊红（H&E）组织学染色和免疫组织化学方法，检测肉瘤的细胞增殖、侵袭性血管化及宿主反应。该技术相较于现有的异种移植模型等方法，主要优势在于操作简单、易于掌握，且相对经济。该方法还可在极短时间内研究大量与转移相关的活动，且无需经过伦理委员会审批。此技术有助于解答肉瘤研究领域中的一些关键问题，例如肿瘤与宿主相互作用对肿瘤存活的影响、肿瘤微环境的重建，以及间质细胞的募集等。该技术的应用前景可延伸至肉瘤的个体化治疗，因为可以利用患者自身的组织材料进行研究。这种新技术可以为我们提供关于SAR神经发生的全新见解，同时也可广泛应用于其他系统，例如肿瘤发生。首先使用无菌手术刀将肿瘤样本切成小于一立方毫米的小块，并剔除所有钙化区域。然后称量样品，并将两到四克组织转移至解离管中。在2.5毫升胶原酶Ⅱ和2.5毫升DNase溶液中消化组织。根据肿瘤组织解离方案处理完毕后，将所得悬液通过150微米细胞滤筛过滤。现在将悬液在适当的离心力下离心，例如在4°C条件下以100至500 × g离心5分钟。用移液器小心吸去上清液后，将沉淀物在室温下加入10毫升红细胞裂解缓冲液中孵育，并间歇混匀。10分钟后，加入25毫升培养基以终止反应，再次离心沉淀后，沉淀应呈白色，弃去上清液，向细胞中加入5毫升培养基，然后通过70 µm细胞筛网过滤悬液。使用自动细胞计数器测定发育过程中每毫升的活细胞数量。第3天，将18号针头插入蛋尖，移除2毫升蛋清，以降低卵尿囊膜（CAM）的水平。随后在蛋壳标记的上侧位置贴附一层半透性粘性薄膜，以防止切割窗口时蛋壳碎片掉落至CAM上。然后在卵的表面用小剪刀开一个引入孔。打开卵壳时避免损伤绒毛尿囊膜是该操作中最关键的步骤。我们使用锋利的剪刀，一手水平持剪刀，另一手固定卵。现在，使用一把无菌的尖头手术剪在蛋壳上剪出一个一厘米见方的窗口。此时，胚胎搏动的心脏及其相连的血管应已暴露在蛋黄表面。移除所有未受精的蛋或已死亡的胚胎。然后用更多的半透性粘性膜密封窗口。再次离心收集肿瘤悬液后，将沉淀物重悬于冷却的细胞外基质凝胶中，浓度为每100 µL凝胶含1×10⁶个细胞。将此溶液置于融化的冰上保存。接下来，在层流条件下，使用无菌手术剪切除部分半透性粘性薄膜。用无菌玻璃棒轻轻接触载物片，去除上皮细胞层。然后在载物片上加入4滴25微升的细胞外基质（ECM）凝胶悬液，每次加入后等待ECM凝胶在下一次加入前完成聚合。通过这种方式，形成含有癌细胞的黏附斑块。然后再次用半透性粘附膜密封壳窗。经过适当的实验孵育时间后，使用一把手术剪刀扩大壳窗，注意不要剪得过低。接下来，使用移液器向含有接种材料的 CAM 区域加入 300 至 500 微升 PBS。然后通过体视荧光显微镜拍摄 CAM 图像。之后，使用无菌剪刀沿紧贴蛋壳的边界剪下膜，并将收获的 CAM 放入盛有 PBS 或缓冲甲醛溶液的无菌培养皿中。然后拍摄Cam膜上下两面的照片，分别在有滤膜和无滤膜的情况下进行观察。在第一张图中，肿瘤移植物已黏附于Cam膜上。此处，从患者材料获得的单细胞悬液显示出干燥、略微隆起的斑块，可在以下两张图像中观察到。图中显示了切除绒毛尿囊膜（CAM）后膜表面出现明显皱褶的现象。SAO 两株在 CAM 上形成扩散性斑块，自第七天起表面面积显著增加。接种后，GFP 信号保持较强，表明细胞具有活性。这些含有 SW 1 3 53 细胞的菌落表面减少，并倾向于出现收缩的凸轮状结构，导致细胞膜起皱。从第 7 天收获后，常可观察到出血现象。随着细胞多次分裂后荧光探针被稀释，以及出血的发生，DSR 信号会减弱。在大多数情况下，可观察到新的扭曲血管进入样本，从而显示出 CAM 的血管反应。例如，在此斑块中，还可观察到由箭头所示的点状出血，由箭头指示的分支结构以及由星号指示的吻合结构。请注意 SAO 迁移的两个细胞与 CAM 血管平行排列。这种血管反应可在切除鸡胚尿囊膜（CAM）后从下方观察到，表现为围绕移植物或斑块的扭曲血管。在肿瘤移植物组和单细胞悬液组中均观察到CAM的血管反应。组织学证据显示，SAOs的两个细胞在整个细胞外基质凝胶体积内保持单细胞形态，导致斑块的厚度和直径增加。肿瘤细胞侵入绒毛尿囊膜的中胚层，如箭头所示，导致内胚层与外胚层之间的距离增大，形似拉开的拉链。如双箭头所示，SW1353细胞及来自患者自体肉瘤的单细胞悬液的生长模式呈现出更为聚集的特征，在细胞外基质凝胶中形成细胞岛状结构。如箭头所示，尽管肿瘤在异位生长，我们发现原始肉瘤肿瘤的关键特征及其免疫组织化学特性在绒毛尿囊膜中仍得以保留。此外，肿瘤移植物出现再血管化，表现为血管中出现深粉蓝色有核的鸡红细胞，如箭头所示。对KI 67阳性与KI 67阴性细胞的计数显示，两种细胞系的细胞总数自第4天起持续增加。此后，细胞总数保持稳定；接种7天后，KI 67阳性细胞数量及细胞总数开始下降。在靠近CAM的区域观察到较高比例的KI 67阳性细胞，而在斑块表面则观察到较多比例的KI 67阴性细胞。一旦掌握，若操作得当，可在三天内用 cam SA 技术分析 50 个样本，耗时共计 14 小时。根据本方案，还可进行额外的 H 和 E 染色及评估，每 10 个条件需额外耗时 3 小时。还可采用其他方法，如活体成像，以研究其他问题，例如荧光标记的癌细胞的外渗或定位。因此，这一新技术的开发使临床前研究领域的研究人员能够探索肉瘤患者新的预后和治疗因素。观看本视频后，您应能充分理解如何在cmaa中应用肿瘤组织材料，以及如何将显微镜下的观察结果转化为对肿瘤与宿主相互作用的更深入认识。

the-in-ovo-cam-assay-as-a-xenograft-model-for-sarcoma

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

该<em&gt;在OVO</em&gt; CAM作为一个肉瘤Xenograftmodel的检测

为了研究 体内 肿瘤生长与肿瘤微环境，我们采用免疫功能健全动物中的同源性、原位卵巢癌小鼠模型。我们将小鼠肿瘤细胞系（MOV1）转导表达Katushka荧光蛋白（MOV1）KAT）在此我们展示其在卵巢中的原位移植 体内 成像...

用于免疫健全小鼠的浆液性卵巢癌原位模型 体内 肿瘤成像与肿瘤免疫应答的监测

鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）缺乏免疫功能且高度血管化，使其成为肿瘤生长和血管生成的天然体内模型。在本方案中，我们描述了一种利用CAM实验培养三维、血管化肝细胞癌（HCC）肿瘤的可靠方法。...

In Ovo 鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）实验作为肝细胞癌高效异种移植模型

人类多发性骨髓瘤（MM）细胞的存活和增殖需要间充质细胞和细胞外基质成分所提供的支持性微环境。我们建立了一种将人类骨髓瘤细胞和间充质细胞移植入鸡胚的体内模型，用于研究抗癌药物对肿瘤生长、侵袭和血管生成的影响。...

建立人多发性骨髓瘤鸡异种移植模型以研究肿瘤生长、侵袭和血管生成

本文描述了一种动物模型的建立，该模型可用于直接检验肿瘤缺氧对转移的影响，并解析其作用机制。尽管本文所述实验主要针对尤文肉瘤，但类似方法也可应用于其他类型的肿瘤。...

体内 模型用于检测缺氧对肿瘤转移的影响

本文介绍了一种利用超声引导将神经母细胞瘤（NB）和尤文肉瘤（ES）细胞（包括已建立的细胞系和患者来源的肿瘤细胞）注射到具有生物学相关性部位的实验方案，以建立可靠的癌症研究临床前模型。...

利用超声引导组织定向细胞植入法建立具有生物学相关性的转移性肿瘤异种移植模型

我们提出鸡胚尿囊绒毛膜模型作为一种可移植的体内替代模型，用于移植妇科和泌尿系统癌细胞系及患者来源的肿瘤。...

利用鸡绒毛尿囊膜体内模型研究妇科和泌尿系统癌症

本实验方案描述了通过胫骨内注射骨肉瘤细胞，建立携带原位骨肉瘤及肺转移病灶的小鼠模型。...

胫骨内骨肉瘤细胞注射法建立原位骨肉瘤及肺转移小鼠模型

本文介绍了一种建立人卵巢组织鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）异种移植模型的实验方案，并验证了该技术的有效性、移植物血管重建的时间进程以及在6天移植期内组织的存活能力。...

利用鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）模型研究卵巢组织移植

本方案描述了利用人骨肉瘤组织建立患者来源的异种移植（PDX）小鼠模型的方法。...

建立人骨肉瘤组织来源的患者异种移植小鼠模型

本方案描述了患者来源的B细胞和T细胞急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞的在卵内 异种移植，该过程发生在注射后4天。...

体内 异种移植患者来源的急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞（PDX-ALL）

学习使用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）检测技术研究肉瘤细胞行为与肿瘤宿主相互作用。该方法操作简便、成本低廉，无需伦理审批，可用于评估肿瘤微环境重建和基质细胞募集，为肉瘤个性化治疗提供新见解。

鸡胚尿囊膜上的 in ovo CAM-实验作为肉瘤的异种移植模型

探索更多视频