Name: 方法中进行杂交狗尾草，新模型体系的草 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-01T09:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 了解狗尾草杂交方法，通过热水处理杀死花粉实现去雄，简化禾本科模式植物的遗传研究流程。该技术操作简便、侵入性低，每穗可成功获得1至7粒杂交种子。

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感谢 Sankalpi Warnasooriya 和 Amy Humboldt 对本文手稿的审阅与编辑。本研究得到了美国能源部（DE-SC0008769）和美国国家科学基金会（IOS-1127017）资助项目的资助。

1. S. viridis 的培养
<ol>
	<li>将生长室条件设置为31 °C/22 °C（昼/夜），光照周期为12小时光照/12小时黑暗，相对湿度50%，并在清晨8:30至9:00期间进行15 °C的预处理。（图1）。在此条件下，S. viridis A10.1从播种到开花期大约需要21–22天。</li>
	<li>用Metro Mix 360填满育苗盘（4 × 9孔），并移除一个孔用于浇水。</li>
	<li>在土壤表面轻轻喷雾加水。</li>
	<li>将种子播于土壤表面，每孔一粒种子。</li>
	<li>用一层土壤覆盖种子（约0.5 cm厚）。</li>
	<li>再次喷雾湿润土壤表面，并从底部给育苗盘加水。播种后应持续从底部浇水。</li>
	<li>每进行一次杂交，至少使用三株植物作为母本，九株植物作为父本。由于植株不会在同一日开花，播种时间应错开。建议在连续三天内每天进行一次播种。</li>
	<li>每天浇水1–2次，具体频率取决于植株大小和土壤状况。土壤中过多水分不利于植株最佳生长，可能导致真菌滋生及叶片组织损伤。</li>
	<li>每周施肥两次，使用浓度为100 ppm的Jack's 15-16-17肥料。</li>
</ol>
2. 去雄前穗状花序的修剪与标记——第1天
<ol>
	<li>在授粉前的下午或傍晚，将植株从生长室转移至实验室（温度（T）：24.06 °C ± 0.13 °C，相对湿度（RH）21.79% ± 1.15%）。</li>
	<li>选择主穗上已有1朵花至1/3的花开放的穗子。</li>
	<li>本研究中，穗子的四个区域定义如下（图2A：顶端、远端中部、近端中部和基部）。</li>
	<li>理想情况下，选择已有1–5朵花开放的穗子，剪去穗子顶端（远端），并使用弹簧剪刀或精细镊子去除近端中部和基部区域的所有花朵。</li>
	<li>若穗子约有1/10至1/5的花已开放，剪去顶端，并修剪掉穗子基部的花朵，仅保留远端中部的下部区域和近端中部的上部区域，用于进一步修剪。</li>
	<li>若穗子约有1/4至1/2的花已开放，剪去远端中部区域，仅保留近端中部区域用于进一步修剪。</li>
	<li>使用手术剪轻微修剪芒刺。</li>
	<li>去除所有已开放的花和未成熟的花，保留约20–30朵花/穗，均匀分布在目标区域内（图3）。注意保留即将授粉区域的芒刺，以保护小花免受可能的热损伤。对于每个小穗，保留最上方发育最成熟的小花。最上方的小花在授粉时开花的概率更高（图2B）。</li>
	<li>用红色永久性记号笔标记每朵花的一侧，并记录穗子上的小花数量（图2B）。</li>
	<li>用标签标记该穗子，注明去雄日期、去雄持续时间及去雄时的温度。</li>
	<li>完成穗子修剪后，去除每株植物的所有分蘖，以确保更多资源重新分配至主穗的发育。</li>
</ol>
3. 温水浸渍去雄法 - 第1天
<ol>
	<li>将水浴锅温度设置为 48 °C ± 0.1 °C，用于热处理。</li>
	<li>轻轻弯曲修剪后的穗状花序，将其浸入 48 °C 的温水中 3–6 分钟。注意不要折断花序的茎秆。</li>
	<li>每次可同时浸入约 3–4 个花序，但需在花序之间保留足够空间，以确保热量均匀分布。热处理期间必须将整个花序完全浸入温水中。旗叶（支撑花序并为其提供养分的叶片）不得接触温水，以防叶片组织受热损伤。</li>
	<li>完成所需去雄时间后，将花序从水浴中取出，并轻轻抖落花序上的水分。</li>
	<li>使用定制的微孔面包袋完全覆盖去雄后的花序，并用扭结扎带固定。微孔面包袋可根据花序大小进行定制（在视频中展示）。</li>
	<li>将植株放回生长室，直至次日。</li>
</ol>
4. 去雄后的杂交/授粉 - 第2天和第3天
<ol>
	<li>在第2天和第3天上午9:00，将雌性（去雄）和雄性亲本从生长室移至实验室（温度：24.06 °C ± 0.13 °C，相对湿度：21.79% ± 1.15%），进行杂交操作。</li>
	<li>使用红色永久性标记笔观察并为已开放或正在开放的花朵添加另一个红点。记录每个圆锥花序上开放花朵的总数。</li>
	<li>在标签上记录授粉日期和雄性亲本名称，以便追踪所进行的杂交组合。</li>
	<li>观察雄性亲本开花的高峰期。在本实验室的培养室条件下（图1），雄性亲本圆锥花序上的花朵约在上午10:10开始同步开放。自花朵开放起，约20分钟后花药完全伸出并释放花粉。</li>
	<li>授粉的最佳时期是雄性亲本花粉刚刚释放时。花粉释放后约20分钟花朵闭合，因此开花持续时间约为花朵开放后40分钟。花朵闭合后约30分钟内，花粉颜色由淡黄色变为褐色。</li>
	<li>一旦在雄性亲本花朵上观察到淡黄色花药，立即开始授粉。第2天和第3天采用以下三种技术之一进行授粉：
	<ol>
		<li>花序对花序授粉：取一个已摘下的雄性花序，轻轻与去雄的雌性花序相互摩擦以促进授粉，随后丢弃该雄性花序以避免污染。重复此过程，直至每个去雄花序均被2-3个雄性花序授粉。</li>
		<li>花药对柱头授粉：使用镊子夹取一朵具有淡黄色花药的正在开放的雄性花朵，或将花药取下后直接接触雌性亲本花朵的柱头。用一朵雄性亲本花朵为去雄花序上的一朵花授粉。重复此过程，直至去雄花序上的每个柱头均被若干（约2-3个）花朵或花药授粉。佩戴放大头戴镜有助于更清晰地完成授粉操作。</li>
		<li>在对不同雄性亲本进行授粉操作之间，将镊子浸入95%乙醇中，随后用Kimwipes纸巾擦拭，以防止不同杂交组合间花粉交叉污染。</li>
		<li>花序绑缚授粉：去雄后，选择雄性亲本上预计次日开花的3-4个花序，用扭结线将其与雌性亲本的去雄花序绑在一起。将去雄花序置于雄性花序略下方。用玻璃纸袋覆盖所有花序，并用回形针在基部固定。此操作可在第2天雄性亲本花序开始开花时完成。</li>
		<li>在第2天和第3天早晨开花期间，轻弹或摇动玻璃纸袋以促进授粉。在整个早晨开花期（上午9:00至11:00）内，每隔15分钟重复轻弹或摇动一次。授粉完成后移除雄性亲本花序，并在去雄花序上已开花朵的对侧做好标记。记录每个雌性亲本花序上开花的花朵数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成授粉后，使用定制的微孔透气面包袋覆盖雌性亲本花序，并在基部用扭结线固定，直至收获种子。</li>
</ol>
5. 种子收获
<ol>
	<li>在授粉后两周（14–16天）收获种子。将标签与种子一同放入同一袋中。两侧均有红色标记的种子代表来自受控遗传杂交的种子，预期为异交后代。</li>
	<li>丢弃无红色标记的种子，因其来自去雄后新发育的花朵。仅一侧有红色标记的种子可能来自自花授粉，因为这些花朵在进行受控杂交时尚未开放。</li>
	<li>将种子置于种子干燥器中，在30 °C下干燥2天。将干燥后的种子保存在实验室（温度：24.06 °C ± 0.13 °C，相对湿度：21.79% ± 1.15%）或种子冷藏室（温度：4.0 °C ± 1.0 °C，相对湿度：20% ± 1%）中。</li>
</ol>

<ol><li>Bennetzen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+genome+sequence+of+the+model+plant+Setaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reference genome sequence of the model plant Setaria.</a> Nat Biotechnol. 30, 555-561 (2012).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+foxtail+millet+%28Setaria+italica%29+provides+insights+into+grass+evolution+and+biofuel+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of foxtail millet (Setaria italica) provides insights into grass evolution and biofuel potential.</a> Nat Biotechnol. 30, 549-554 (2012).</li>
<li>Li, P., Brutnell, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setaria+viridis+and+Setaria+italica%2C+model+genetic+systems+for+the+Panicoid+grasses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Setaria viridis and Setaria italica, model genetic systems for the Panicoid grasses.</a> J Exp Bot. 62, 3031-3037 (2011).</li>
<li>Brutnell, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setaria+viridis%3A+a+model+for+C4+photosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Setaria viridis: a model for C4 photosynthesis.</a> Plant Cell. 22, 2537-2544 (2010).</li>
<li>Doust, A. N., Kellogg, E. A., Devos, K. M., Bennetzen, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxtail+millet%3A+a+sequence-driven+grass+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Foxtail millet: a sequence-driven grass model system.</a> Plant Physiol. 149, 137-141 (2009).</li>
<li>Siles, M. M., Baltensperger, D. D., Nelson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+for+artificial+hybridization+of+foxtail+millet+%5BSetaria+italica+%28L.%29+Beauv.%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Sci%22%5BJournal%5D)">Technique for artificial hybridization of foxtail millet [Setaria italica (L.) Beauv.].</a> Crop Sci. 41, 1408-1412 (2001).</li>
<li>Li, H. W., Meng, C. J., Liu, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Problems+in+the+Breeding+of+Millet+%28Setaria+Italica+%28L.%29+Beauv.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Agron.+J%22%5BJournal%5D)">Problems in the Breeding of Millet (Setaria Italica (L.) Beauv.).</a> Agron. J. 27, 963-970 (1935).</li>
<li>Willweber-Kishimoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecific+relationships+in+the+genus+setaria%5BTitle%5D)+AND+%22Contributions+from+the+Biological+Laboratory%2C+Kyoto+University%22%5BJournal%5D)">Interspecific relationships in the genus setaria.</a> Contributions from the Biological Laboratory, Kyoto University. 14, 1-41 (1962).</li>
<li>Chang, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+flowering+and+hybridization+technique+in+Setaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nungyeh-hsueh+Pao+%28Jour.+Agric.%29+Act.+Agric.+Sin%22%5BJournal%5D)">Studies on flowering and hybridization technique in Setaria.</a> Nungyeh-hsueh Pao (Jour. Agric.) Act. Agric. Sin. 9, 68-76 (1958).</li>
<li>Darmency, H., Pernes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+wild+Setaria+viridis+%28L.%29+Beauv.+to+improve+triazine+resistance+in+cultivated+S.+italica+%28L.%29+by+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Research%22%5BJournal%5D)">Use of wild Setaria viridis (L.) Beauv. to improve triazine resistance in cultivated S. italica (L.) by hybridization.</a> Weed Research. 25, 175-179 (1985).</li>
<li>Sakai, S., Shin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+hybridization+of+Setaria+italica+by+hot+water+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Fac.+Agric.+Kagoshima+Univ%22%5BJournal%5D)">Artificial hybridization of Setaria italica by hot water treatment.</a> Bull. Fac. Agric. Kagoshima Univ. , 28-37 (1955).</li>
<li>Malm, N. R., Rachie, K. O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMalm%2C+NR+%22Setaria+millets%3A+A+review+of+the+world+literature+S.B%22">Setaria millets: A review of the world literature S.B</a>. , University of Nebraska, Lincoln. 513-529 (1971).</li>
<li>Miyaji, Y., Samura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+atmospheric+humidity+on+flowering+and+pollination+in+Setaria+italica%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Fac.+Agric.+Kagoshima+Univ%22%5BJournal%5D)">The influence of atmospheric humidity on flowering and pollination in Setaria italica.</a> Bull. Fac. Agric. Kagoshima Univ. , 1-6 (1954).</li>
<li>Wang, Z. M., Devos, K. M., Liu, C. J., Wang, R. Q., Gale, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+RFLP-based+maps+of+foxtail+millet%2C+Setaria+italica+%28L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Beauv.+Theoret.+Appl.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Construction of RFLP-based maps of foxtail millet, Setaria italica (L.).</a> P. Beauv. Theoret. Appl. Genetics. 96, 31-36 (1998).</li>
<li>RangaswamiAyyangar, G. N., Narayanan, T. R., Seshadri Sarma, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+in+Setaria+italica+%28Beauv.%29%2C+the+Italian+millet.+Part+I%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J.+Agr.+Sci%22%5BJournal%5D)">Studies in Setaria italica (Beauv.), the Italian millet. Part I.</a> Indian J. Agr. Sci. , 561-571 (1933).</li>
<li>Heh, C. M., Mei, T. F., Yang, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthesis+of+Millet%2C+Setaria+Italica+%28L.%29+Beauv%5BTitle%5D)+AND+%22Agron.+J%22%5BJournal%5D)">Anthesis of Millet, Setaria Italica (L.) Beauv.</a> Agron. J. 29, 845-853 (1937).</li>
<li>Doust, A. N., Devos, K. M., Gadberry, M. D., Gale, M. D., Kellogg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+basis+for+inflorescence+variation+between+foxtail+and+green+millet+%28poaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetic basis for inflorescence variation between foxtail and green millet (poaceae).</a> Genetics. 169, 1659-1672 (2005).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

黎明前处理的重要性
为了获得较高频率的异花授粉后代，必须使父本和母本的开花期高度同步。最初，我们采用了温度和光照周期（31 °C/22 °C，白天/夜间），并使用S. viridis品系A10.1进行所有授粉操作。在这些条件下，大多数花朵在清晨温度升至31 °C之前开放，但仍有少量花朵在上午8:00至晚上8:00之间随机开放。S. italica的前期研究表明，一天中的时间、地理位置和季节均会影响开花期的变化7,15,16。Siles 等6指出，开花与温度和湿度的快速变化有关，而并非单纯由低温和高湿度引起，这与先前研究的结论不同7,15。因此，我们采用黎明前30分钟的低温处理（15 °C，从上午8:30至9:00），以模拟自然的黎明前环境。该黎明前低温处理有助于亲本开花期的同步化。我们观察到，尽管设定培养箱内的相对湿度为50%，但当温度从22 °C下降至15 °C时，箱内相对湿度上升至70%以上，并持续保持在70%以上，直至上午9:30后温度逐渐回升至31 °C。在上午9:00，将去雄的母本植株和父本植株移入实验室（温度：24.06 °C ± 0.13 °C，相对湿度：21.79% ± 1.15%）。父本花朵约在上午10:10开始开放，授粉操作可在上午10:30至11:00之间进行。所有试剂和设备的详细清单见表2。
穗准备在去雄中的重要性
在本研究的培养室条件下（图1），主穗开花持续时间为2至3天。通常，位于花序远端中部的花朵（图2A）最先开放，随后向近端和远端依次开放。每穗宜保留20至30朵花。去雄时需小心去除未成熟花朵，仅保留发育良好的花朵（即小穗中最顶端或最大的花朵17）。在花朵两侧用红色标记笔做标记，有助于高效区分去雄后新开放花朵产生的种子与可能的异交后代。此外，去雄前应保留穗部的小刚毛，以保护小花免受严重热损伤；但作为可选步骤，也可在去雄后使用弹簧剪刀去除刚毛，以便于授粉操作，尤其是在采用穗部固定技术时（图2C和图2D）。
温水处理的优化温度和处理时间
通过温水浸泡去雄的原理在于，花粉对热的敏感性高于柱头表面。然而，不同狗尾草属（Setaria）物种及品系所需的热处理持续时间和温度可能有所不同。通常情况下，较高温度下短时间处理或较低温度下较长时间处理，对去雄的效果相当。已有报道指出，42 °C 处理 20 分钟10 或 47 °C 处理 10 分钟14 可使粟（S. italica）花粉失去活力，但这些处理方法的效率尚未明确。我们制定本实验方案的依据是：在优化的温度和处理时间条件下，母本植株上所有花朵的花粉均可失活，而柱头仍保持可授性。然而，在比较和分析多个温度及处理时长的影响后（表1），我们发现同一花序上不同花朵对热处理的敏感性存在差异，因此难以完全消除自花授粉所产生的种子。我们得出结论：在绿色狗尾草（S. viridis）品系 A10.1 中，于 48 °C 处理 3–6 分钟时，获得异交后代的效率最高。
开花盛期与异花授粉的时间
当花发育成熟并即将开放时，花药呈黄白色，花药从花中伸出后即迅速散粉8。散粉后，随着花朵开始闭合，花药逐渐变为褐色。花粉一旦释放，其活力尚不明确。因此，关键是要尽快使用雄性亲本中正在开放或刚刚开放花朵的花粉。在我们的培养室条件下（图1），雄性亲本的大部分花朵于上午10:10开始开放，花药在上午10:30散粉。因此，适宜进行授粉操作的时间窗口为上午10:30至11:00之间。花朵闭合后，柱头仍暴露于颖片之外，可能仍具有接受花粉的能力。此前已有研究观察并证实，在S. italica中，Siles等6发现柱头在开花后约48小时内仍具有接受性，因此在热处理后以及完成人工控制杂交后，对圆锥花序进行套袋非常重要。如上所述，我们建议在去雄后的第2天和第3天均进行授粉操作。
授粉方法
我们比较了三种授粉技术的效率。如果开花的花序数量充足，花序对花序授粉是最高效的方法，能够获得更多的异交后代。如果开花的花序数量有限，则采用花药对柱头法可产生更高频率的异交后代。我们已成功利用上述两种方法获得了异交后代。“捆绑花序”法曾被用于S. italica 6的杂交，但我们发现该方法效率最低，原因是父本散粉的时间窗口较短。此外，授粉过程难以控制，且S. viridis花序上的刚毛可能阻碍花粉向柱头表面的转移。
种子的收获、干燥与储存
收获后，种子应在30-33 °C下干燥2天。如有必要，进行GUS染色前应去除外稃。种子短期储存（少于两年）应置于干燥、阴凉处（温度：24.06 °C ± 0.13 °C，相对湿度：21.79% ± 1.15%），长期储存则应置于种子冷藏室（温度：4.0-10 °C ± 1.0 °C，相对湿度：20% ± 1%）。储存条件不佳可能导致种子活力下降8。我们观察到，S. viridis A10.1在收获后第4天播种时发芽率约为5%，但若在实验室条件下（温度：24.06 °C ± 0.13 °C，相对湿度：21.79% ± 1.15%）储存110天，随后进行-80 °C、为期三天的层积处理以打破种子休眠，发芽率可提高至90-96%。对于-80 °C的层积处理，可将干燥种子放入密闭容器（例如 微量离心管或硬币信封装入密封塑料袋）中，在-80 °C下保存3天后再进行播种。在实验室（温度：24.06 °C ± 0.13 °C，相对湿度：21.79% ± 1.15%）储存16个月后，发芽率仍可达到90-95%。此外，为打破休眠，收获后可将种子在30-33 °C下干燥2天，随后进行-80 °C、为期三天的层积处理，并在播种前去除外稃。经过上述处理后，种子发芽率最高可达33%。
优点、局限性及可能的改进方案
本文提供了利用热处理去雄法在S. viridis A10.1中进行杂交的第一个标准操作流程。与物理去雄方法相比，该方法侵入性更小，且在实验室中相对容易建立。通常修剪一个圆锥花序约需15分钟，每人每天可完成约15个花序的修剪与杂交操作。在优化条件下，每个花序平均可获得3-5株异交后代，因此单人单日最多可获得45-75株异交后代。此外，该技术也可应用于其他Setaria物种的杂交，但可能需要进一步优化。若人工气候室空间有限，植株可在温室或未进行黎明前处理的人工气候室内培养，直至圆锥花序抽出，再转移至优化条件的人工气候室中继续培养。

S. viridis 是一种NADP-ME亚型C4 与能源作物柳枝稷（NAD-ME亚型）、粮食作物谷子以及农业杂草画眉草亲缘关系较近的禾草 5. 栽培型的510 Mb基因组 Setaria, S. italica 最近已完成测序 1,2 以及其杂草近缘种的25倍覆盖度基因组序列， S. viridis正在进行中（未发表）。 S. viridis 具有多个特征，使其成为一种潜在的优良遗传学模式系统，包括世代周期短、植株矮小、生长需求简单以及种子产量丰富 3重要的是，近年来已开发出用于瞬时和稳定转化的方法 S. viridis 可为创造转基因植物提供机会 4然而，遗传工具开发中的一个主要瓶颈在于 S. viridis 其难以进行异花授粉。迄今为止，尚未发表任何可实现通过人工控制杂交快速获得种子的标准实验方案。
在S. italica中，遗传杂交通常通过去除花药进行去雄6,7,8，或对母本植株的花进行热处理9–11来实现。经过上述处理后，将未经处理的花或父本的花药或圆锥花序轻轻摩擦于柱头上，以释放花粉。在去雄操作中，需在小花开放、花药刚开始伸出但尚未散粉时，立即用精细镊子去除花药6–8。该方法面临的主要挑战之一是，花朵开放与散粉之间的时间窗口非常短暂，难以准确把握去雄时机。S. italica中单朵花的开放和闭合持续时间因材料品系和环境条件而异，可从7分钟6到2.5小时12不等。由于花粉散出发生在花药从小花中伸出的过程中，因此必须快速而小心地去除花药，难以完全避免自花授粉造成的污染。此外，授粉操作需在去雄后立即进行，因此每人每天可完成的杂交数量有限。
作为一种替代方法，可将成熟的圆锥花序浸入温水中以通过加热杀死正在发育的花粉粒9,10,13,14，该方法的优势在于可对大量花序进行杂交操作。然而，热处理的温度和持续时间在不同实验中差异较大（例如，47 °C处理10分钟14，或42 °C处理20分钟10）。此外，目前尚未发表关于热诱导去雄效果的系统性分析研究。因此，建立一种标准化且简便的遗传杂交方法将极大加快S. viridis遗传资源的开发，并推动S. viridis在科研领域内作为模式体系的建立。
我们报道了在S. viridis中进行遗传杂交的标准实验方案的建立与优化。植物在受控环境中生长，以同步花器官发育并提高实验的可重复性。杂交过程中使用一个转基因S. viridis品系作为父本，该品系含有GUS报告基因4，便于鉴定成功的人工遗传杂交事件。该GUS转基因由水稻泛素启动子驱动，可在收获后立即对F1代种子进行检测，从而提供一种简便的定性分析方法，用于评估去雄和授粉的效率。我们采用温水简单热处理进行去雄，并对已去雄的花朵进行标记，以避免去雄后新发育花朵产生的种子造成污染。在测试了一系列允许温度下的热处理条件并改变温水浸泡时间后，我们确定最佳处理条件为48 °C下处理3–6分钟。研究发现，黎明前的低温处理可促进双亲花药开裂的同步化，从而有利于异花授粉。我们还讨论了该实验方案中的关键步骤，以及该方法未来在其他Setaria材料中的应用前景。

<table><tbody><tr><td>弹簧剪刀</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>14126</td><td></td></tr><tr><td>杜氏抛光生物镊</td><td>SPI Supplies</td><td>TD5BP-XD</td><td></td></tr><tr><td>外科剪刀</td><td>F.S.T (Fine Science Tools)</td><td>14005-12</td><td></td></tr><tr><td>Europack 透明聚丙烯微孔硬面包袋 6&quot;x28&quot;</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.pjpmarketplace.com&quot; target=&quot;_blank">http://www.pjpmarketplace.com&lt;/a&gt;</td><td>361001</td><td></td></tr><tr><td>育苗平盘</td><td>T.O. Plastics</td><td>715401C</td><td></td></tr><tr><td>基质混合土 360</td><td>Hommert International</td><td>10-0356-1</td><td></td></tr><tr><td>杰克牌 15-16-17 肥料</td><td>Hommert International</td><td>07-5925-1</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes 擦拭纸</td><td>VWR International</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Sharpie 超细尖永久性记号笔，红色</td><td>Staples</td><td>37002</td><td></td></tr><tr><td>Donegan DA-10 OptiVisor 头戴式放大镜，3.5 倍放大倍率，4&quot; 焦距</td><td>Amazon</td><td>DA-10, B0015IP380</td><td></td></tr><tr><td>12&quot; 24/7 包装手动脉冲封口机，热封机，聚封，无加热元件握把</td><td>Amazon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>VWR scientific</td><td>型号：1166</td><td></td></tr><tr><td>BDW 步入式植物生长箱</td><td>Conviron</td><td>BDW 40</td><td></td></tr></tbody></table>

用于禾本科植物新模式系统——setaria viridis 的杂交实验方法

Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

Setaria viridis 是一种新兴的 C4 禾本科植物模式体系。它与生物能源作物柳枝稷以及粮食作物谷子密切相关。最近，谷子（S. italica）的 510 Mb 基因组已被测序1,2，其野生近缘种 S. viridis 的 25 倍覆盖度基因组测序也正在进行中。S. viridis 具有多个使其成为理想遗传学模式体系的特征，包括较短的世代周期、植株矮小、生长条件简单、种子产量高3，以及已建立的瞬时和稳定遗传转化体系4。然而，由于缺乏详细的杂交操作方法，S. viridis 的遗传学研究在很大程度上尚未被深入探索。迄今为止，尚未建立一种标准操作流程，以实现通过人工控制杂交快速获得种子。
本文所展示的方案经过优化，适用于S. viridis（编号A10.1）的遗传杂交实验。我们采用剪除花序保留20-30个小花后，用温水进行简单的热处理去雄，并对花朵进行标记，以去除去雄后新发育花朵所产生的种子。在测试了一系列允许温度下的热处理并改变浸水时间后，我们确定了最佳处理条件为48 °C下处理3-6分钟。采用此方法，单个操作人员每天至少可完成15个杂交组合，每个花序平均可获得3-5株异交后代。因此，单人单日平均可获得45-75株异交后代。该技术的广泛应用将有助于构建S. viridis × S. viridis 或 S. viridis × S. italica 的重组自交系群体，通过混合分离群体分析进行突变定位，并创制用于遗传分析的高阶突变体。

在本研究中，我们使用了测序的 S. viridis 以登录号 A10.1 作为母本，以及一个转基因植株 S. viridis 含有GUS报告基因的品系（也称为A10.1） 4 作为所有授粉的父本。采用优化的生长条件以同步开花，如图所示。 图1我们测试了多种去雄热处理的温度与时间组合，观察到去雄后的圆锥花序上约有40-80%的花朵在第2天开花nd 天，而其余的在第3天开花rd 天 (图2）。然而，如果热处理过于剧烈，例如 49 °C 4分钟内，第二株上开花极少或没有开花nd 天。在第2天进行异花授粉nd 或 3rd 去雄后第2天，该时间取决于父本开花高峰期。
观察发现，去雄后的幼嫩花朵继续发育，成熟并在人工授粉后3-6天内自花授粉。授粉后7-10天，穗上可见白色花朵，这些白色花朵由于高温伤害或授粉不良而未能受精。与此同时，成功授粉的花朵开始结出带有红色斑纹的深色种子，并在14天后开始散落。于第14天收获带有红色斑纹的深色种子th 授粉后第几天的种子可根据是否有红色标记清晰区分，无红色标记的种子仍呈绿色且不开裂。若延迟收获，无论有无红色标记的种子，其蒴果均会变暗，导致在收获的种子群体中难以快速区分出带有红色标记的种子。
为了优化杂交方案，进行了多项热处理实验，结果总结于表1中。在不同热处理实验中，每穗平均收获种子0–10粒。收获后，种子在30 °C下用种子干燥器干燥2天，随后使用颖壳去除器去除颖壳。去除颖壳后，将假定的F1种子用GUS染色液染色，异交后代在1–2小时内呈现蓝色染色结果（图2F）。根据这些结果，我们推荐采用48 °C处理3–6分钟的热处理条件。此外，建议在去雄后的第2天和第3天均进行杂交操作。
为了检验该技术在与其他 Setaria 品系或物种杂交中的有效性，我们进行了 S. viridis A10.1 与八个不同 S. viridis 品系以及一个 S. pumila 品系之间的杂交实验。尽管不同品系的开花时间存在差异，但我们发现，经过黎明前低温处理后，这八个 S. viridis 品系和一个 S. pumila 品系的花朵均在上午10:00至11:00之间开始开放，开放高峰时间为上午10:20至11:00。这表明黎明前低温处理可适用于多种 Setaria 品系。所有杂交实验均以 S. viridis A10.1 作为母本，并采用48 °C热处理5–6分钟对其进行去雄。在A10.1与三个不同 S. viridis 品系的杂交中，每个杂交组合获得了1至12粒种子；在 S. viridis A10.1 与单个 S. pumila 品系的一次杂交中获得了6粒种子。然而，目前尚不能确定这些种子是成功测交的产物，还是自花污染所致。尽管如此，这些初步结果表明，用于 S. viridis A10.1 的生长条件也可用于实现不同 S. viridis 品系之间的杂交，甚至可能适用于 Setaria 属的其他物种。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>热处理温度 (°C)</td>
			<td>热处理时间 (分钟)</td>
			<td>杂交次数</td>
			<td>修剪后平均花朵数</td>
			<td>授粉日期（去雄后第几天）</td>
			<td>平均每穗种子数（红色）（均值）</td>
			<td>平均 Gus (+) 种子比例（红色）</td>
			<td>平均杂交种子数（Gus+）</td>
			<td>最少杂交种子数</td>
			<td>最多杂交种子数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>47</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
			<td>27</td>
			<td>第2天</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>36</td>
			<td>第2天</td>
			<td>5</td>
			<td>60</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>4</td>
			<td>3</td>
			<td>25</td>
			<td>第3天</td>
			<td>10</td>
			<td>50</td>
			<td>5</td>
			<td>3</td>
			<td>7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>5</td>
			<td>8</td>
			<td>25</td>
			<td>第2天</td>
			<td>5</td>
			<td>60</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>6</td>
			<td>3</td>
			<td>25</td>
			<td>第2天</td>
			<td>4</td>
			<td>75</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>7</td>
			<td>4</td>
			<td>24</td>
			<td>第2天</td>
			<td>3</td>
			<td>33</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>7</td>
			<td>1</td>
			<td>25</td>
			<td>第3天</td>
			<td>4</td>
			<td>75</td>
			<td>3</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>49</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
			<td>23</td>
			<td>第2天</td>
			<td>5</td>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>2</td>
			<td>7</td>
			<td>26</td>
			<td>第2天</td>
			<td>8</td>
			<td>25</td>
			<td>2</td>
			<td>0</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>22</td>
			<td>第2天</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>25</td>
			<td>第2天</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 去雄热处理条件的优化。 改变热处理温度和时间的结果。授粉在热处理后一天进行（2nd 天）或两天（3rd 去雄后第d，通过GUS染色鉴定成功异花授粉
<img alt="开花与去雄的温度和光照时间表；相对湿度：70-80%。" fo:content-src="/files/ftp_upload/50527/50527fig1highres.jpg" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50527/50527fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
 图1. 带有黎明前低温处理的优化生长室条件。 显示了实现最佳生长和花朵同步产生的温度与时间段。绿色和红色箭头分别表示进行杂交和去雄操作的最佳时间窗口。
<img alt="开花进程示意图；展示带有标注区域的植株小穗；实验对照。" src="/files/ftp_upload/50527/50527fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
 图2. 杂交用圆锥花序的准备及异交后代的GUS染色。 (A) 未修剪的Setaria viridis A10.1 圆锥花序，显示约有十分之一的花已开放。图中示出花序上开花进程的四个区域及其方向性。(B) 去雄前保留刚毛的修剪后花序。(C) 去除刚毛后的去雄花序。(D) 去雄后第2天的花序，显示正在开放的花朵（照片拍摄于上午10:30）。(E) 雄性亲本（携带β-葡萄糖醛酸酶（GUS）报告基因的转基因Setaria viridis A10.1株系）的花序，在黎明前处理后开花（照片拍摄于上午10:30）。A 至 E，比例尺 = 1 mm。(F) 异交后代经GUS染色2小时后，在70%（v/v）乙醇中脱色处理的结果。右侧两粒种子分别为阴性对照和阳性对照。
<img alt="穗修剪过程、热介导去雄、授粉、种子收获示意图。" src="/files/ftp_upload/50527/50527fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 实验流程图 执行S. viridis杂交的主要步骤示意图。

我们建立了一种在Setaria viridis（S. viridis）中进行杂交的方法。该方法包括在进行热水处理以杀死可育花粉之前，对圆锥花序进行修剪。杂交在严格控制的生长条件下进行，通常每个花序可获得1至7粒杂交种子。

用于禾本科植物新模式系统——Setaria viridis 的杂交实验方法

Setaria viridis 是一种新兴的C4禾本科植物模式体系。它与生物能源原料草芦以及粮食作物谷子亲缘关系密切……

本实验的总体目标是演示如何对禾本科植物这一新型模式系统进行有性杂交。该过程首先选择、修剪并标记穗状花序；第二步是将修剪后的花序浸入48°C的水浴中，以完成去雄操作。接下来，将修剪后的雄蕊用作母本，与正在散粉的雄蕊进行授粉。最后一步是在异花授粉两周后收获种子。最终，通过Gus染色检测假定的杂交种子，以验证该技术的有效性。与现有的物理去雄等方法相比，该技术的主要优势在于其侵入性更小，且在实验室中相对容易建立。该方法将通过简化杂交操作，促进玉米螟（cter verus）作为遗传模型的广泛应用。首先，移除一个用于浇水的穴孔，然后用 Metro Mix 360 填充一个含有四乘九个穴孔的育苗盘。接下来轻轻喷雾润湿基质表面，在每个穴孔中播入一粒种子。然后覆盖一层厚度为0.5厘米的土壤，再喷雾润湿表面，随后从底部浇水。播种后每天从底部浇水一至两次，注意避免过度浇水。将培养室的生长条件设置为白天31°C，夜间22°C，并在上午8:30至9:00期间进行15°C的预处理。同时保持12小时光照/12小时黑暗的光照周期，并将相对湿度维持在50%。在这些条件下，Satter verus a 10.1从播种起21至22天开花。理想情况下，去雄操作应在下午或傍晚进行。选择每株植物上具有 1 至 5 朵开放花朵的主要花序。然后剪去花序顶端，并用精细镊子去除近中段和基部区域的所有花朵。若仅有一成至五分之一的花朵开放。为了保留远端、中段以及近端中段的下部以供进一步修剪，需剪去花序顶端，并从圆锥花序基部去除花朵。若一个花序有四分之一至一半的花朵已开放，则保留近端中段用于进一步修剪，并剪去远端中段。花序剪好后，使用手术剪轻轻修剪刚毛。注意保留将要授粉区域的芒，以保护小花免受可能的热损伤。每个小穗保留最上方的成熟小花。最上方的小花在授粉时开花的概率更高。然后去除所有已开放的花朵和未成熟的花蕾，每株顶端保留约20至30朵发育均匀的花朵。接着，用红色永久性记号笔标记每朵花的一侧。记录每株顶端的小花数量，并用标签标记该顶端，标签上注明去雄日期、持续时间以及进行去雄时的温度。穗状花序修剪后，去除每株植物的所有分蘖，以确保更多资源重新分配至主穗的发育。去雄前一小时，将水浴设定在48摄氏度，用于热处理。水浴预热完成后，轻轻弯曲修剪后的穗状花序，每次将三到四个穗浸入温水中，持续三到六分钟。操作时需小心，避免折断五角星形叶片的叶柄。支撑五角星形叶片的旗叶不应与温水接触，以防止叶片组织受热损伤。完成所需去雄时间后，将穗子从水浴中取出，并轻轻抖去穗子上的水分。然后用定制的微孔面包袋完全覆盖去雄后的穗子，并用扭结带固定。微孔面包袋可根据穗子的大小进行定制。最后，将植株放回培养室，直至次日。在第二天和第三天上午9:00，将去雄的雌性亲本和未去雄的雄性亲本从培养室移至实验室进行杂交操作，并观察已开放或正在开放的花朵，再次向其中添加红色标记。使用红色永久性记号笔记录每个圆锥花序上开放花朵的总数。然后在标签上记录授粉日期和父本名称，以便追踪已完成的杂交组合。在本实验室条件下观察父本开花的高峰期，父本圆锥花序上的花朵大约在上午10:10开始同步开放。花朵开放后约20分钟，花药将完全伸出并释放花粉。当花药呈淡黄色、雄性亲本花朵上可见白色花药时，立即开始授粉。授粉在第二天和第三天进行，采用穗对穗授粉或花药对柱头授粉方式。取一个已去雄的穗状花序作为母本，轻轻将父本花序与去雄后的花序相互摩擦，以促进授粉，随后丢弃父本花序，防止污染；重复授粉过程，直至每个去雄的花序均已被2至3个父本花序授粉。最有效的方法是使用镊子进行花药至柱头的授粉。选取一朵正在开放、具有黄白色花药的花朵，或直接取下花药，将其与母本植株花朵的柱头进行物理接触。在不同父本之间的授粉过程中，取一个父本的一朵花对去雄的穗状花序上的单朵花进行授粉。用镊子蘸取95%乙醇，随后用Kim擦拭纸擦拭，以避免不同杂交间花粉残留造成的污染。完成授粉后，用定制的微孔透气面包袋覆盖母本穗状花序，并用扭结扎带在基部固定密封。授粉后至收获种子期间，在授粉后第14至16天收获种子，并将标签与种子一同放入同一信封中。两侧均有红色标记的种子代表来自受控遗传杂交的种子。丢弃任何无红色标记的种子，因其来自新发育的花朵。 去雄带有红色标记的种子后，仅一侧的种子很可能代表自花授粉产生的种子。最后，在 30 摄氏度下将种子干燥两天。将干燥后的种子储存在实验室中，或最好储存在种子保存室中。当准备进行后续分析时，如有必要，可去除子叶。本视频中所述方法是通过多次试验，采用不同温度和处理时间，以优化去雄过程而得到的结果。该过程的成功率通过获得的杂交种子数量来衡量。来自其中一个测试杂交组合的六粒种子，其中父本携带一个报告基因。此处显示的是编码β-葡萄糖醛酸酶的基因。当染色后，该报告基因会使种子变为蓝色，从而便于计数杂交种子的数量。一旦掌握该技术，若操作得当，每天最多可完成15个杂交授粉。观看本视频后，您应能充分理解如何在 Aria verus 中进行杂交操作。

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