用于禾本科植物新模式系统——Setaria viridis 的杂交实验方法

本实验的总体目标是演示如何在草类植物这一新型模式系统中进行杂交操作。该过程首先选择、修剪并标记穗状花序。第二步是将修剪后的花序浸入48摄氏度的水浴中，以完成去雄处理。

接下来，将修剪后的雄蕊用作母本，与正在散粉的雄蕊进行授粉。最后一步是在异花授粉两周后收获种子。最终，通过Gus染色法对获得的杂交种子进行检测，以验证该技术的有效性。

与现有的物理去雄等方法相比，该技术的主要优势在于侵入性更小，且在实验室中相对容易建立。该方法将通过简化杂交操作，促进烟草脆裂病毒（cter verus）作为遗传学模型的广泛应用。首先，移除一个用于浇水的穴孔，然后使用Metro Mix 360填充一个4×9穴孔的育苗盘。

接着轻轻喷雾润湿育苗块，将种子播在土壤表面，每穴一粒种子。然后覆盖一层厚约0.5厘米的土壤，再次喷雾润湿表面，再从底部浇水。播种后每天从底部浇水一至两次，注意避免过度浇水。

将生长室的培养条件设置为白天31°C，夜间22°C，并在上午8:30至9:00期间进行15°C的低温预处理。同时维持12小时光照/12小时黑暗的光照周期，并将相对湿度设定为50%。在这些条件下，Satter verus a 10.1从播种到开花需要21至22天。理想情况下，去雄操作应在下午或傍晚进行。

选择每株植物上具有1至5朵开放花朵的主要花序。然后剪去花序顶端，并用精细镊子去除近中段和基部区域的所有花朵。如果仅有一成至五分之一的花朵开放。

为了保留远端下部、中部以及近端中段以供进一步修剪，需切掉穗尖并从圆锥花序基部去除花朵。若一个圆锥花序有四分之一至一半的花朵已开放，则保留近端中段用于进一步修剪，并切除远端中段。穗体切割完成后，使用手术剪轻轻修剪芒刺。

注意保留将要授粉区域的芒，以保护小花免受可能的热损伤。每个小穗保留最上方的成熟小花。最上方的小花在授粉时开花的概率更高。

然后去除所有已开放的花和未成熟的花，每株顶端保留约20至30朵发育均匀的花。接着，用红色永久性记号笔标记每朵花的一侧。记录顶端小花的数量，并用标签标记该顶端，标签内容包括去雄日期、持续时间以及进行去雄时的温度。

穗状花序修剪后，去除每株植物的所有分蘖，以确保更多资源重新分配给主穗的发育。去雄前一小时，将水浴锅预热至48摄氏度，用于热处理。预热完成后，轻轻弯曲修剪后的穗状花序，每次将三到四个穗浸入温水中，持续三到六分钟。

操作时需小心，避免折断五角星形叶片的叶柄。支撑五角星形叶片的旗叶不得接触温水，以防止叶片组织受热损伤。

在完成所需时长的去雄操作后，将穗状花序从水浴中取出，并轻轻抖去花序上的水分。然后用定制的微孔面包袋完全覆盖去雄后的花序，并用扭结扎带固定。微孔面包袋可根据花序的大小进行定制。

最后，将植株放回培养室，直至次日。在第二天和第三天上午9:00，将去雄的雌性亲本和未去雄的雄性亲本从培养室移至实验室进行杂交操作，并观察已开放或正在开放的花朵，再次向其添加红色标记。

使用红色永久性记号笔记录每个圆锥花序上开放花朵的总数。然后在标签上记录授粉日期和父本名称，以追踪已完成的杂交组合。在本实验室条件下观察父本开花的高峰期，父本花序上的花朵大约在上午10:10开始同步开放。花朵开放后约20分钟，花药将完全伸出并释放花粉。

当花药呈黄白色、父本植株花朵上可见白色花药时，立即开始授粉。授粉操作在第二日和第三日进行，采用穗对穗授粉或花药对柱头授粉方法。

取一个已去雄的穗状花序作为母本，轻轻将父本花序与去雄后的花序相互摩擦，以促进授粉，随后丢弃父本花序，防止污染；重复授粉过程，直至每个去雄的花序均已被2至3个父本花序授粉。最有效的方法是使用镊子进行花药至柱头的授粉。选取一朵正在开放、具有黄白色花药的花朵，或直接取下花药，将其与母本植株花朵的柱头进行物理接触。

在不同父本之间进行授粉时，使用一个父本的一朵花对去雄后的花序上的一朵花进行授粉。用镊子蘸取95%乙醇，随后用Kim擦拭布擦拭，以避免不同杂交间花粉残留造成的污染。授粉完成后，用定制的微孔透气面包袋罩住母本的花序，并用扭结扎带在基部固定密封。

授粉后至种子收获期间，于授粉后第14至16天收获种子，并将标签与种子一同放入同一信封中。两面均有红色标记的种子代表来自受控遗传杂交的种子。丢弃所有无红色标记的种子，因其来自新发育的花朵。

去雄后，仅一侧带有红色标记的种子很可能代表自花授粉产生的种子。最后，在 30 摄氏度下将种子干燥两天。将干燥后的种子储存在实验室中，或最好储存在种子保存室中。

当准备进行进一步分析时，如有必要，移除骨骺。本视频中所述方法是通过多次试验，采用不同温度和处理时间，以优化去雄过程而得出的结果。该过程的成功程度通过获得的杂交种子数量来衡量。

来自其中一个测交组合的六粒种子，其中父本携带一个报告基因。此处显示的是编码β-葡萄糖醛酸酶的基因。当染色后，该报告基因会使种子变为蓝色，从而便于统计杂交种子的数量。一旦掌握该技术，若操作得当，每天最多可完成15个五角花序的杂交。

观看本视频后，您应能充分掌握如何在拟南芥（Aria verus）中进行杂交操作。