Name: 实时成像检测方法的评估钙的作用 2 +和鞘磷脂酶在成孔毒素伤口的修复 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 25 s
Description: 学习使用FM1-43脂溶性染料进行活细胞实时成像，精确测量成孔毒素从质膜移除的动力学过程。该方法可评估钙离子和鞘磷脂酶在细胞膜修复中的关键作用，为研究细胞应对毒素损伤的修复机制提供敏感且可重复的定量分析工具。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 R37 AI34867 和 R01 GM064625（授予 N.W.A.）。我们感谢俄克拉荷马大学的 R. Tweten 博士提供 SLO 表达质粒。

1. ASM 的转录沉默
<ol>
 <li>在35 mm玻璃底培养皿（MatTek）中加入2 ml DMEM完全培养基（高糖DMEM，含10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素），接种1.5 × 105个HeLa细胞，于37 °C、5% CO2培养箱中过夜培养。</li>
 <li>次日，吸除培养基，更换为2 ml DMEM低血清培养基（含4% FBS的DMEM），在转染siRNA复合物前至少孵育1小时。</li>
 <li>准备4个离心管用于siRNA寡核苷酸转染混合液。每转染一个35 mm培养皿，在A管和C管中各加入250 μl Opti-MEM低血清培养基和4 μl Lipofectamine RNAiMax；在B管中加入250 μl Opti-MEM低血清培养基和8 μl（160 pmol）对照用中等GC含量寡核苷酸（对照siRNA）；在D管中加入250 μl Opti-MEM低血清培养基和8 μl（160 pmol）SMPD1寡核苷酸（siASM）。室温孵育5分钟。</li>
 <li>将A管与B管混合，形成对照siRNA的转染复合物；将C管与D管混合，形成ASM siRNA的转染复合物。室温孵育20分钟。</li>
 <li>将对照siRNA和ASM siRNA的转染反应混合物缓慢地逐滴加入相应的35 mm玻璃底培养皿中，于37 °C、5% CO2条件下继续培养。转染后24小时，轻柔吸除培养基，更换为新鲜DMEM完全培养基。为实现高效的ASM基因敲低，应在活细胞成像前于37 °C、5% CO2条件下进一步孵育约31小时（总计55小时）。</li>
</ol>
2. 活细胞显微镜观察用试剂的制备
<ol>
 <li>在不含 Ca²⁺ 的冷 1x PBS 中配制浓度为 100 ng/μl 的重组孔形成毒素链球菌溶素 O（Streptolysin O, SLO）溶液2+ 和 Mg2+这些实验中使用的SLO是一种组成型活性的半胱氨酸突变体，其活性不需要还原剂，由俄克拉荷马大学Rod Tweten博士惠赠。该毒素在 E. coli BL21 DE3中表达并按前述方法在天然条件下纯化16. </li>
 <li>配制FM1-43储存液：将FM1-43冻干粉溶于DMSO中，配制成25 mM的溶液。 </li>
 <li>配制溶液A：将FM1-43储存液用含Ca²⁺的冷DMEM稀释2+ 至终浓度为 4 μM（每皿 MatTek 需要 1.5 ml），置于冰上保存，直至使用。</li>
 <li>制备溶液B：将FM1-43储存液用不含Ca的冷DMEM稀释2+ 和 10 mM EGTA（Ca2+-free DMEM) 至终浓度为 4 μM（每皿 MatTek 需 1.5 ml），置于冰上保存，直至使用。</li>
 <li>将溶液A和溶液B各1 ml分装至Eppendorf管中，预热至37 °C。 </li>
 <li>将含钙的 DMEM 溶液保持在冰上2+和 Ca2+无血清DMEM </li>
</ol>
3. SLO 处理与未处理细胞中 FM1-43 摄入的活细胞成像
<ol>
 <li>将一个中等大小的浅金属容器装满碎冰，将其倒扣放入一个装有冰的大玻璃容器中，并额外添加冰块，仅使金属容器的底面暴露在外。在暴露的金属底部放置一块湿润的纸巾，以实现均匀的热传导。</li>
 <li>取一个经对照siRNA处理的MatTek培养皿（样本1），将其放置在冰冷的湿纸巾上。轻轻吸除所有培养基，并用冰冷的无Ca2+ DMEM洗涤3次。最后一次洗涤后，吸除培养皿中的全部培养基。</li>
 <li>为了在Ca2+存在条件下对未进行SLO损伤的细胞中与细胞结合的FM1-43进行成像（样本1），向35 mm玻璃底培养皿的中心玻璃盖玻片上加入180 μl冰冷的溶液B，并在冰上孵育5分钟（表1）。</li>
 <li>将MatTek培养皿置于配备环境控制舱（可维持温度、湿度和CO2水平）的共聚焦显微镜载物台上，显微镜预热至37 °C。通过40X NA 1.3物镜（Nikon）找到待成像的细胞视野。如有条件，开启PerfectFocus或类似功能以校正热漂移。</li>
 <li>将1 ml预热的溶液A轻轻沿35 mm培养皿侧壁加入，并重新盖上环境控制舱的盖子（表1）。</li>
 <li>使用适当的成像软件（UltraView Vox Perkin Elmer转盘共聚焦显微镜系统中的Volocity），以每3秒1帧的速度连续采集图像4分钟。FM1-43的激发采用488 nm激光线，配合488 nm带通二向色镜，发射光通过527(W55)发射滤光片进行分辨。激光功率和相机灵敏度设定为获得100 msec的图像曝光时间。</li>
 <li>重复步骤3.2至3.6，以检测在无Ca2+条件下未经SLO损伤的对照siRNA处理细胞中的FM1-43（样本2），但在步骤3.5中应加入溶液B（表1）。</li>
 <li>为了测量在有（样本3）或无Ca2+（样本4）条件下经SLO损伤的对照siRNA处理细胞中FM1-43的内流情况，向35 mm玻璃底培养皿的中心玻璃盖玻片上加入含SLO的180 μl冰冷溶液B，并如步骤3.3所述在冰上孵育5分钟。重复步骤3.2至3.6；在步骤3.5中根据需要加入溶液A或溶液B（表1）。</li>
 <li>为确定ASM在细胞质膜修复中的作用，对ASM siRNA处理的细胞在所有条件下重复步骤3.2–3.6（样本5–8）（表1）。</li>
 <li>为研究外源性重组鞘磷脂酶（SM）对细胞质膜修复动力学（通过FM1-43内流的抑制反映）的影响（样本9–10），在步骤3.5中将SM（0–50 μU）加入溶液A或溶液B中，随后在活细胞成像过程中以总体积1 ml加入细胞（表1）。</li>
</ol>
4. 细胞中FM1-43内流的定量分析
<ol>
 <li>获取录像后，使用图像分析软件（Volocity Suite, PerkinElmer）测量细胞内 FM1-43 的荧光强度。在视野中每个细胞的胞质区域绘制感兴趣区域，并应用软件工具确定整个视频所有帧中 FM1-43 荧光强度的平均值。</li>
 <li>为校正初始 FM1-43 染色强度的差异，将每段视频的数据表示为随时间变化的荧光强度倍数增加，并针对不同实验条件分别作图。每个细胞在各个时间点的荧光强度倍数增加通过 FT/F0 计算，其中 FT 为特定时间点的平均荧光强度，F0 为 t = 0 时的平均荧光强度（图 1-2）。</li>
</ol>

<ol><li>Heilbrunn, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeilbrunn%2C+L+%22The+dynamics+of+living+protoplasm%22">The dynamics of living protoplasm</a>. , Academic Press. (1956).</li>
<li>Chambers, R., Chambers, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChambers%2C+R+%22Explorations+into+the+nature+of+the+living+cell%22">Explorations into the nature of the living cell</a>. , Harvard University Press. (1961).</li>
<li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> J. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li>
<li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> J. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li>
<li>Steinhardt, R. A., Guoqiang, B., Alderton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+membrane+resealing+by+a+vesicular+mechanism+similar+to+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release.</a> Science. 263, 390-393 (1994).</li>
<li>McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patching+plasma+membrane+disruptions+with+cytoplasmic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane.</a> J. Cell Sci. 113, 1891-1902 (2000).</li>
<li>Togo, T., Alderton, J. M., Bi, G. Q., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+facilitated+cell+membrane+resealing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The mechanism of facilitated cell membrane resealing.</a> J. Cell Sci. 112, 719-731 (1999).</li>
<li>Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomes+behave+as+Ca2%2B-regulated+exocytic+vesicles+in+fibroblasts+and+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells.</a> J. Cell Biol. 137, 93-104 (1997).</li>
<li>Reddy, A., Caler, E., Andrews, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca2%2B-regulated+exocytosis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proximal+lysosomes+are+the+major+vesicles+responsible+for+calcium-dependent+exocytosis+in+nonsecretory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells.</a> J. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).</li>
<li>Chakrabarti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+membrane+resealing+and+autoimmune+myositis+in+synaptotagmin+VII-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Impaired membrane resealing and autoimmune myositis in synaptotagmin VII-deficient mice.</a> J. Cell Biol. 162, 543-549 (2003).</li>
<li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).</li>
<li>Iacovache, I., van der Goot, F. G., Pernot, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pore+formation%3A+an+ancient+yet+complex+form+of+attack%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Pore formation: an ancient yet complex form of attack.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1611-1623 (2008).</li>
<li>Morgan, B. P., Campbell, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recovery+of+human+polymorphonuclear+leucocytes+from+sublytic+complement+attack+is+mediated+by+changes+in+intracellular+free+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">The recovery of human polymorphonuclear leucocytes from sublytic complement attack is mediated by changes in intracellular free calcium.</a> Biochem. J. 231, 205-208 (1985).</li>
<li>Keefe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin+triggers+a+plasma+membrane-repair+response+that+facilitates+CTL+induction+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Perforin triggers a plasma membrane-repair response that facilitates CTL induction of apoptosis.</a> Immunity. 23, 249-262 (2005).</li>
<li>Idone, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+injured+plasma+membrane+by+rapid+Ca2%2B-dependent+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis.</a> J. Cell Biol. 180, 905-914 (2008).</li>
<li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li>
<li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).</li>
<li>Tam, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytosis+of+acid+sphingomyelinase+by+wounded+cells+promotes+endocytosis+and+plasma+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair.</a> J. Cell Biol. 189, 1027-1038 (2010).</li>
<li>Weisleder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+MG53-mediated+cell+membrane+repair+using+in+vivo+and+in+vitro+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems.</a> J. Vis. Exp. (52), e2717(2011).</li>
<li>Tweten, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol-dependent+cytolysins%2C+a+family+of+versatile+pore-forming+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins.</a> Infect. Immun. 73, 6199-6209 (2005).</li>
<li>Zha, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingomyelinase+treatment+induces+ATP-independent+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sphingomyelinase treatment induces ATP-independent endocytosis.</a> J. Cell Biol. 140, 39-47 (1998).</li>
<li>Buckley, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+three+membranes.+Channel+formation+by+aerolysin%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Crossing three membranes. Channel formation by aerolysin.</a> FEBS Lett. 307, 30-33 (1992).</li>
<li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Aeromonas+toxin+proaerolysin+in+its+water-soluble+and+membrane-channel+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin in its water-soluble and membrane-channel states.</a> Nature. 367, 292-295 Forthcoming.</li>
<li>Yamaji-Hasegawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+and+pore+formation+of+a+sphingomyelin-specific+toxin%2C+lysenin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligomerization and pore formation of a sphingomyelin-specific toxin, lysenin.</a> J. Biol. Chem. 278, 22762-22770 (2003).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

早期关于机械损伤和细胞质膜修复的研究依赖于多种细胞损伤方式，包括滴加玻璃珠、微量移液、剪切、划伤或刮擦。这些检测方法的结果均为定性而非定量，无法提供修复机制动力学的精确信息。细胞在经历上述损伤后重新封闭其质膜的能力，通常通过检测胞质中是否存在添加到细胞外液的示踪剂、膜不通透性染料的进入、胞质酶的流失、ATP水平变化或细胞的长期存活情况来评估。尽管其中一些检测方法可以实现定量分析，但这些研究中的一个主要障碍在于难以同步损伤事件，同时在单细胞水平上快速评估膜重新封闭的动力学过程。
采用紫外激光损伤肌纤维，随后检测亲脂性染料FM1-43的内流，这一方法的建立与应用是此类研究中的重大进展17,20。与通过刮擦或其他机械方式对整个细胞群体造成广泛损伤的方法相比，这些检测手段引入了一种更为明确的细胞损伤方式，从而实现了单细胞水平的分析。然而，此类检测仍存在若干问题。激光诱导的损伤区域较大，且其大小随激光强度变化而显著波动，其性质也与生理条件下发生的膜损伤形式存在显著差异。另一个问题是，使用显微镜耦联的激光只能逐个对细胞或肌纤维进行损伤，限制了可追踪的膜修复事件数量，从而降...

几十年来人们已经知道，细胞质膜在机械损伤后的修复是一个依赖于Ca2+的过程1,2。后续研究表明，伤口处的Ca2+内流会触发细胞内囊泡在损伤部位剧烈地发生胞吐，这一过程对膜的重新封闭至关重要3,4。通过检测加载到细胞胞质中的荧光染料的流失速率，可评估修复速度，结果表明膜的重新封闭在损伤后&lt;30秒内完成5。最初提出了两种模型来解释胞吐作用在质膜修复中的必要性：1）“补丁”模型，该模型认为损伤处的Ca2+内流首先触发细胞内囊泡的同型融合，形成一个大的“补丁”，随后被应用于质膜以封闭伤口6；2）张力降低模型，该模型提出，在伤口周围通过Ca2+依赖性胞吐作用增加的膜成分可降低质膜张力，从而促进双分子层的重新封闭7。Ca2+触发的胞吐在质膜修复中的作用进一步得到了研究的支持，这些研究表明溶酶体含有Ca2+感受分子——突触结合蛋白VII型（synaptotagmin VII），它可促进溶酶体的胞吐以及受损细胞的质膜修复8,9,10,11。
然而，更多证据表明，仅靠胞吐作用不足以促进质膜修复。除了质膜的机械性撕裂外，另一种常见的细胞损伤形式是由细菌12,13 或免疫细胞14,15产生的孔道形成毒素引起的通透化。与机械性撕裂不同，孔道形成蛋白会插入质膜中，形成稳定的、由蛋白质衬里的孔道，无法通过简单的膜“修补”或降低膜张力来重新封闭。有趣的是，研究发现哺乳动物细胞在孔道形成蛋白导致的通透化后，具有高效的质膜修复机制，且该过程同样需要细胞外Ca2+ 12的存在。这一发现引发了一个问题：与机械性损伤类似，跨膜孔道从细胞表面的清除是否也是一个快速过程5？令人惊讶的是，我们最近的研究揭示，由孔道形成毒素导致通透化的细胞重新封闭过程与机械性损伤修复具有非常相似的特性：该过程依赖细胞外Ca2+，并在约30秒内完成。在对这一过程进行更深入研究时，我们最近发现，除了Ca2+调控的溶酶体胞吐作用外，质膜修复还涉及一种快速的内吞作用，该过程由溶酶体酶酸性鞘磷脂酶（ASM）的释放所触发，不仅对跨膜孔道的清除至关重要，而且对机械性损伤的修复也必不可少16。
为确定细胞在孔道形成蛋白作用导致通透性增加后的重新封闭动力学，本实验室改进了一种活体成像方法，该方法此前曾用于评估激光损伤的分离肌纤维的膜修复情况。17该检测方法依赖于亲脂性染料FM1-43的特性，该染料可稳定地嵌入脂质双分子层的外层，并伴随荧光强度的增强。当质膜双分子层发生破裂时，细胞外的染料得以进入并与细胞内膜结合，从而提供一种灵敏的检测方法，用于评估质膜损伤及修复情况18,16,19,20. 为了将该检测方法用于评估细胞经成孔蛋白透化后重新封闭的能力，我们先将细胞在 4 °C 下与细菌毒素链球菌溶素 O（streptolysin O, SLO）预孵育，SLO 可结合膜胆固醇21随后可通过将细胞从冰上转移至加热显微镜载物台中的温热培养基中，实现细胞通透化的同步化，此过程可激活成孔蛋白的寡聚化及构象改变，从而形成跨膜孔道。与先前报道的激光损伤方法相比，该方法的优势在于可在显微镜视野中同时分析更多数量的细胞，从而更有效地取样细胞群体。鉴于机械损伤后细胞膜再封闭过程与孔道形成毒素诱导的细胞通透化在机制上的相似性，本文所述的实验方法为解析质膜修复这一基本生物学过程中所涉及的因素提供了极为通用且强大的工具。例如，我们展示了利用该方法可鉴定参与该过程的关键因子钙离子（Ca²⁺）2+ 修复过程中的依赖性与非依赖性步骤。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>HeLa 229 细胞系</td><td>ATCC</td><td>CCL2-1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 高糖培养基</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>无钙 DMEM 高糖培养基</td><td>Invitrogen</td><td>20168</td><td></td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>Invitrogen</td><td>T3163</td><td></td></tr><tr><td>OptiMem 低血清培养基</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMax</td><td>Invitrogen</td><td>13778</td><td></td></tr><tr><td>对照 GC 含量 RNAi 寡核苷酸</td><td>Invitrogen</td><td>12935300</td><td></td></tr><tr><td>SMPD1 RNAi 寡核苷酸</td><td>Invitrogen</td><td>HSS143988</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（热灭活）</td><td>Gemini-Bioproducts</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>来自&lt;em&gt;Bacillus cereus&lt;/em&gt;的鞘磷脂酶</td><td>Sigma</td><td>S7651</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>相机</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C9100-50</td><td></td></tr><tr><td>转盘共聚焦显微镜</td><td>PerkinElmer</td><td>UltraViewVoX</td><td></td></tr><tr><td>图像分析软件</td><td>PerkinElmer</td><td>Volocity Suite</td><td></td></tr><tr><td>环境培养箱</td><td>Pathology Devices</td><td>LiveCell System Chamber</td><td></td></tr></tbody></table>

活体成像实验用于评估ca2+和鞘磷脂酶在孔形成毒素损伤修复中的作用

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

质膜损伤是一种常见事件，必须迅速修复伤口以确保细胞存活。Ca2+内流是一个关键的信号事件，可在约30秒内触发质膜机械性损伤的修复。最近的研究表明，哺乳动物细胞在被成孔毒素穿孔后，也能以依赖Ca2+的方式重新封闭其质膜，该过程涉及溶酶体酶酸性鞘磷脂酶的胞吐作用，随后发生孔道的内吞作用。本文描述了用于证明由毒素链球溶血素O（streptolysin O）导致通透化的细胞其重封过程同样迅速且依赖于Ca2+内流的实验方法。该实验设计可实现损伤事件的同步化，并通过成像和定量亲脂性染料FM1-43到达细胞内膜的程度，精确测定细胞恢复质膜完整性的能力。这一活细胞检测方法还可灵敏地评估外源添加的可溶性因子（如鞘磷脂酶）抑制FM1-43内流的能力，从而反映细胞修复其质膜的能力。本实验使我们首次证明，鞘磷脂酶的作用位于Ca2+依赖性胞吐作用的下游，因为在外源无Ca2+的条件下，向胞外添加该酶仍可促进已通透化细胞的重封。

低浓度的细菌鞘磷脂酶（SM）可恢复溶酶体酸性鞘磷脂酶耗竭细胞的质膜修复功能。
我们先前利用FM1-43成像实验表明，在存在Ca2+的条件下，经SLO造成损伤后，溶酶体酶ASM缺陷的细胞表现出质膜修复缺陷，而该缺陷可通过在细胞外添加重组人源酶得到挽救19。由于人源溶酶体ASM的最适pH为酸性，我们进一步探究了是否可通过添加来自Bacillus cereus（Sigma）的鞘磷脂酶（SM），在中性pH下完全发挥活性，从而恢复膜的重封能力。如先前所示，在无Ca2+条件下（不支持修复的条件）经SLO处理后，对照siRNA或ASM siRNA寡核苷酸处理的细胞均表现出相似程度的通透化，表明ASM的缺失并不影响细胞对毒素的敏感性（图1A）。有趣的是，在ASM缺陷细胞中，添加低浓度的SM（5和7.5 μU/ml）即可完全恢复其在SLO处理后的膜重封能力（图1B）。随着培养基中酶浓度的增加，修复表型逐渐减弱——当SM浓度为10 μU/ml时，SLO处理后...

对暴露于亲脂性染料FM1-43的细胞进行活体成像，可精确测定孔形成毒素从质膜上被清除的动力学过程。该方法是一种灵敏的检测手段，可用于评估Ca2+、鞘磷脂酶及其他因素在质膜修复过程中的作用需求。

活体成像实验用于评估Ca2+和鞘磷脂酶在孔形成毒素损伤修复中的作用

细胞质膜损伤是一种常见现象，必须迅速修复伤口以确保细胞存活。Ca2+内流是一个关键的信号事件……

本实验的总体目标是利用亲脂性染料FM 1-43进行活细胞成像，以精确测量低效毒素从质膜上清除的动力学过程。该目标首先通过在4°C条件下预先结合毒素来实现；第二步是将培养皿转移至加热的显微镜载物台上，并找到能够清晰观察细胞的焦平面。接下来，加入适量预热的培养基，并立即开始成像。最后一步是分析和定量细胞内 FM 1-43 荧光。最终，这种灵敏的检测方法可用于评估钙、真菌、髓鞘及其他因素在细胞膜修复过程中的作用需求。与现有的激光损伤等方法相比，该技术的主要优势在于，SLL通透性检测能够在细胞化被触发后，实现细胞质膜损伤的同步形成，且损伤尺寸高度均一。通过活细胞延时成像观察脂溶性染料的流入，可灵敏且高度可重复地精确测定细胞质膜修复动力学。该检测方法非常适合研究各种因子（如钙离子和重组F酶）对细胞质膜修复的影响，避免了其他质膜损伤方法所伴随的实验变异性。在35毫米玻璃底培养皿中，将酸性鞘磷脂酶（ASM）的siRNA种子HeLa细胞接种于DMEM生长培养基中，于37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育过夜。次日，在添加siRNA转染混合物前至少一小时，吸除培养基，替换为2毫升含减血清的DMEM培养基。将细胞放回培养箱中继续孵育，并准备四个用于siRNA寡核苷酸转染混合物的离心管。每35毫米培养皿所需的试剂用量如下：在A管和C管中，各加入250微升Opti-MEM减血清培养基和4微升Lipofectamine RNAiMAX；在B管中，加入250微升Opti-MEM减血清培养基；在D管中，加入250微升Opti-MEM减血清培养基和8微升（或160皮摩尔）对照siRNA，在另一管中加入250微升Opti-MEM减血清培养基和8微升（或160皮摩尔）ASM siRNA。室温孵育5分钟。接下来，将试管 A 和 B 混合以形成对照 S、irna 以及试管 C 和 D 的转染复合物。对于 A SMS irna，将反应在室温下孵育 20 分钟。20 分钟后，将每种转染反应混合物缓慢地逐滴加入相应的 35 毫米玻璃底培养皿中，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳条件下孵育。转染后24小时，轻柔吸除培养基，并更换为新鲜的DMEM生长培养基，以实现高效的A SM基因敲低。培养皿需在37摄氏度、5%二氧化碳条件下继续孵育约31小时，总计孵育55小时后进行活细胞成像。活细胞显微镜观察所需的以下试剂：重组PO形成毒素链球菌溶血素O（streptolysin O，SLO），用不含钙和镁的冷PBS配制，浓度为100纳克/微升。将FM 1-43溶于DMSO中配制成25毫摩尔/升的母液，取此母液分别加入含钙的冷DMEM中，配制成终浓度为4微摩尔/升的溶液A，以及加入不含钙的冷DMEM和10毫摩尔/升EGTA中，配制成终浓度为4微摩尔/升的溶液B，用于活细胞成像前的准备。将溶液A和溶液B各1毫升分装至微量离心

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生物学

实时成像检测方法的评估钙的作用<sup&gt; 2 +</sup&gt;和鞘磷脂酶在成孔毒素伤口的修复

本文描述了用于在整体动物和细胞水平上可视化MG53介导的细胞膜修复动态过程的实验方案。这些方法可用于研究质膜再封闭的细胞生物学及再生医学。...

利用MG53介导的细胞膜修复可视化 体内 和 体外 系统

本视频展示了一种用于研究哺乳动物细胞质膜修复效率的实验方法。将细胞暴露于一种细菌性成孔毒素中，该毒素可在细胞膜上形成孔道。在细胞外钙离子存在的情况下，孔道导致钙离子内流，从而诱导细胞膜修复事件的发生。通过使用DNA结合性染料碘化丙啶来评估膜修复效率，该染料仅能进入未完成膜修复的细胞。...

一种基于荧光的体外检测方法用于测量细胞质膜修复效率

修复受损细胞的过程涉及特定蛋白质和亚细胞区室向细胞膜损伤部位的转运。本方案描述了监测这些过程的实验方法。...

成像细胞膜损伤及参与修复的亚细胞过程

此处采用基于可渗透膜小室的感染系统，研究由A群链球菌分泌的毒素链球菌溶血素S对...

利用可渗透膜插件感染系统研究分泌型细菌毒素对哺乳动物宿主细胞影响的方法实现

通过双光子激光对细胞膜造成损伤是评估细胞膜修复能力的常用方法，可应用于多种细胞类型。本文介绍了一种实验方案 体外...

使用双光子激光显微镜的细胞膜修复检测方法

本文介绍一种基于荧光的高通量检测方法，通过活细胞的荧光定量和成像分析来测定质膜修复效率。该方法可用于筛选调控哺乳动物细胞质膜修复的药物或靶基因。...

哺乳动物细胞质膜修复效率的高通量测定

我们介绍一种非侵入性的体内成像方案，该方案流程简化且成本效益高，利用化学发光的鲁米诺类似物L-012，对小鼠全层皮肤缺损伤口模型中产生的活性氧（ROS）进行可视化和定量分析。...

体内成像小鼠伤口模型中的活性氧

本文介绍了一种利用原代成纤维细胞进行体外划痕实验的方法，以及一种在小鼠中进行的体内皮肤伤口愈合实验方案。这两种实验均为评估体外和体内伤口愈合的简便方法。...

体外与体内伤口愈合分析的划痕迁移实验与背侧皮肤折叠腔技术

AlPcS2a介导的染料辅助激光失活（CALI）是一种用于研究活细胞内细胞内囊泡（IVs）时空损伤的有力工具。...

一种研究细胞内囊泡破裂功能的光动力学方法

本文介绍了一种利用Leishmania major前鞭毛体来检测成孔毒素所诱导的结合、细胞毒性和信号转导的实验方案。文中以链球菌溶血素O作为概念验证示例，也可使用其他毒素，结合L.

利用Leishmania major解析孔形成毒素的分子机制与功能

热等离子体穿孔法结合了共聚焦显微镜、光镊技术和金纳米颗粒，用于研究细胞和巨大单层囊泡中细胞质膜修复过程中的蛋白质响应。该技术可实现快速且局部的膜穿孔，有助于鉴定关键蛋白质及其在复杂的细胞质膜修复机制中的功能作用。...

一种用于研究活细胞和模型膜中质膜修复的热等离子体方法

学习使用FM1-43脂溶性染料进行活细胞实时成像，精确测量成孔毒素从质膜移除的动力学过程。该方法可评估钙离子和鞘磷脂酶在细胞膜修复中的关键作用，为研究细胞应对毒素损伤的修复机制提供敏感且可重复的定量分析工具。

活体成像实验用于评估Ca²⁺和鞘磷脂酶在孔形成毒素损伤修复中的作用

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