在肌肉再生的老鼠模型中移植诱导多能干细胞衍生的中生代细胞样肌原体

该程序的总体目标是在急性和慢性肌肉再生小鼠模型中评估诱导多能干细胞衍生的肌肉祖细胞的生肌潜力。这是通过首先评估细胞在体外的产肌潜力来实现的。第二步是通过肌肉注射移植细胞。

或者，通过显微外科手术将细胞注射到股动脉中。最后一步是评估治疗动物的营养不良表型的功能改善。最终，免疫荧光和组织学测定用于显示供体细胞对宿主肌肉的植入和功能贡献。

这种方法可以帮助回答骨骼肌再生领域的关键问题，例如细胞治疗方法的研究。这项技术的影响延伸到肌营养不良症的治疗，因为它可以为使用 IPS 细胞 DER 祖细胞的自体细胞治疗策略铺平道路。虽然这种方法可以提供对基于干细胞的疗法的见解，但它可以应用于其他系统，例如分子的输送、肌肉注射或关节内，以及随后对肌肉功能和形态影响的分析。

当我们意识到 IPSL 培养可以提供一种方法来克服成体干细胞的一些局限性时，例如组织活检的可用性及其扩增潜力，Well首先想到了这种方法。首先生成一个稳定的项目细胞系，这些细胞系用过表达肌生成调节剂 myo D 的他莫昔芬诱导载体转导，用 1% matri 凝胶包被并用培养基种子洗涤后，用转导的细胞在一个板中并在 37 摄氏度下在生长培养基中孵育。细胞应在一两天内达到汇合。

当它们准备好时，将一微摩尔的羟基他莫昔芬添加到生长培养基中。24 小时后，用分化物替换生长培养基。补充有 1 微摩尔羟基他莫昔芬的培养基。

每天检查培养物中是否有 myo 管形成，并用新鲜分化替换一半的培养基。当培养物准备好时，每隔一天中一次。它们用于移植检测。

在这里，营养不良和免疫缺陷小鼠用于确定肌内移植的植入程度。移植前 24 小时注射他莫昔芬对动物进行预处理。细胞也应在前一天晚上用添加到生长培养基中的他莫昔芬进行预处理。

在移植当天，通过胰蛋白酶分离、计数和离心，细胞在 Resus 之前在 PBS 中洗涤细胞一次，悬浮在不含钙和镁的 PBS 中，浓度为每 30 微升 6 个细胞。麻醉动物并消毒皮肤后，找到胫骨前肌。确定近端肌腱的插入点并插入针头。

尖端比此点低 2 毫米。以相对于胫骨 15 度的倾斜度插入 5 毫米的针头，并在缩回针头的同时缓慢注入细胞悬液。清空注射器，将针头保持在肌肉内两毫米处。

从肌肉中取出针头时要小心，以免细胞悬液通过针头的轨迹溢出。按照这些相同的程序，在跟腱和股四头肌的肌腱交界处上方 2 毫米处进行胃贫血注射。女性注射在远端肌腱上方 2 毫米处进行动脉内移植。

如前所述，用他莫昔芬预处理动物和细胞。当准备好移植时，如前所述制备细胞，只是它们在离心前进行了过滤。将沉淀重新悬浮在不含钙和镁的 PBS 中，并添加 10% 专利蓝色染料，以实现细胞悬液分布的可视化。

注射前小心地重悬注射器中的细胞并去除所有气泡，麻醉后，如图所示剃除和消毒该区域，切开 5 到 7 毫米并定位股骨束。轻轻去除用镊子覆盖束的结缔筋膜。接下来，小心地将股静脉和神经与动脉分开，轻轻地将镊子的尖端引入它们之间并逐渐扩大孔。

股静脉很脆弱。注意不要在它从股动脉分离时夹住它。分离后，用镊子的一个尖端提起动脉，然后用另一个尖端夹住动脉。

用 30 G 针头穿刺动脉，以大约每秒 5 微升的输注速度在夹持区域下游注射 50 微升细胞悬液。慢慢地从动脉中取出针头和镊子，以恢复流向肢体的血流。用无菌纱布加压以避免出血和/或根据需要烧灼。

专利蓝色染料可以立即识别正确放置的注射剂，如果注射正确，整个肢体会迅速变成浅蓝色，缝合伤口并监测动物直到它们恢复。镇痛三天并检查伤口通过跑步机测试评估治疗小鼠运动能力的每日变化。基线测量在治疗前大约一个月开始，用于评估每只测试动物的改善情况。

第一步是在测试前让动物适应运动。为此，请将跑步机设置为每分钟 6 米的速度 10 分钟。每隔一天重复此过程，持续一周。

一旦他们熟悉了该设备，就将坡度设置为 10 度，然后将动物放入跑步机车道。以每分钟 6 米的起始速度打开跑步机。轻轻轻推任何不愿意开始运动的动物。

接下来，启动计时器，一旦动物在休息区躺着超过 5 秒，就每两分钟将速度提高 2 米/分钟。在不尝试重新接合跑步机的情况下，用棍子轻轻触摸它以刺激重新开始锻炼。当鼠标在休息区躺下超过 5 秒而没有尝试重新接合跑步机时，则认为它疲劳。

在一系列连续的三次机械刺激之后，每 5 秒一次，记录每只动物的表现，并每周或每 10 天重复测量至少 3 次。细胞移植后两周开始。测试后，在治疗过的小鼠中重复相同的程序。

使用与基线的比较来评估性能的变化。四次羟基他莫昔芬给药后 48 小时，在培养物的 myo DER 转导项目中可识别 myo de 阳性核。如图所示。

一周后，细胞融合并分化为多核肌管。当肌肉注射移植到急性肌肉损伤的镜像模型中时，项目有助于跑步机的组织再生结果。运动耐量试验显示移植后治疗小鼠的运动能力改善。

移植肌肉的离体分析显示 GFP 阳性区域代表 IMS 在宿主组织中的定植程度，从而证明供体细胞移植到营养不良的肌肉中。重要的是，移植的细胞能够在体内分化形成新的骨骼肌纤维。本例显示了从基因校正的 ims 到 alphas Sarco 糖空滑米色小鼠中的 αs Sarco 糖表达。

Massen 三铬染色显示治疗肌肉中纤维化组织的数量减少。按照该程序，在 FreeWheel 测试、Evan Blue Diop 测定和单纤维或全肌肉力学等方法中进行，以回答有关自主运动能力、纤维脆性和比力改善的其他问题。看完这个视频，你应该对如何使用体外、体内和离体测定来评估 IPS 细胞来源的肌源性祖细胞的肌肉分化能力、移植物电位和功能功效有一个很好的了解。