Name: 在肌肉再生的老鼠模型中移植诱导多能干细胞衍生的中生代细胞样肌原体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 了解诱导多能干细胞衍生肌原祖细胞在急性和慢性肌肉再生小鼠模型中的移植方法。通过体外评估、肌肉内注射或股动脉显微外科注射技术，结合免疫荧光和组织学检测，评估细胞植入和功能改善效果，为肌营养不良症细胞治疗提供实验基础。

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作者感谢Giulio Cossu、Martina Ragazzi以及整个实验室提供的有益讨论与支持，并感谢Jeff Chamberlain慷慨提供MyoD-ER载体。所有涉及活体动物的实验均依照并遵守所有相关监管机构、所属机构的规定、法规和指导原则。作者实验室的工作得到了英国医学研究理事会、欧盟第七框架计划项目Optistem和Biodesign以及意大利杜氏肌营养不良家长项目的支持。

1. 成肌潜能与移植潜能的评估
<ol>
	<li>体外：MyoD诱导的分化
	<ol>
		<li>生成经他莫昔芬诱导型 MyoD-ER 慢病毒载体转导的 IDEMs 稳定细胞系，滴定感染复数（MOI； 例如&#160;1、5 和 50），以 1.1.9 节所述染色方法（MyHC）检测作为操作效率的结果。</li>
		<li>用 1 ml 1% Matrigel 包被 3.5 cm 培养皿，37°C 孵育 30 分钟 &#176;C.</li>
		<li>用培养基洗涤培养板两次，接种 1 x 105 3.5 cm 培养皿中接种 MyoD-ER 转导的 IDEMs，并在 37 ℃ 培养 &#176;在生长培养基中培养。</li>
		<li>预计细胞将在一至两天内达到汇合，随后加入1 &#956;将4-羟基他莫昔芬（4OH-tamoxifen）加入生长培养基中（1st 剂量</li>
		<li>24小时后，将生长培养基更换为添加了1的分化培养基 &#956;4-羟基他莫昔芬（4OH-雌二醇）（2nd 和最后一次给药）。</li>
		<li>每隔一天用新鲜的分化培养基更换一半的培养液。</li>
		<li>每天观察培养物中肌管的形成情况。</li>
		<li>一周后（在分化培养基中培养5天），用PBS轻轻洗涤培养板，并在室温下用4%多聚甲醛固定5分钟。</li>
		<li>使用抗肌球蛋白重链（MyHC）抗体进行免疫荧光染色，以确认肌管的存在。用核染料复染例如&#160;Hoechst</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
分化效率以MyHC阳性细胞内细胞核所占的百分比进行评估：若效率达到 &#62;50%.
<ol start="2">
	<li>体内：急性肌肉再生模型中的移植 
	为评估 MyoD-ER IDEMs 对肌肉再生的体内贡献，需先用编码绿色荧光蛋白（GFP）的载体对细胞进行标记，以便在组织内追踪其分布。随后将 MyoD-ER GFP IDEMs 注射至先前用肌毒素（例如 心脏毒素）损伤的成年小鼠肌肉中。为避免对异种来源（如 HIDEMs）或经基因修饰/校正的细胞产生免疫排斥，必须使用免疫缺陷型或免疫抑制小鼠。
	<ol>
		<li>移植前 24 小时，对动物进行腹腔注射 10 mg/ml 他莫昔芬（脂溶性形式）3.5 μl/g，并在移植前一天晚上于培养基中添加 1 μM 4OH-他莫昔芬（水溶性形式）对细胞进行预处理。</li>
		<li>根据动物实验设施规定的外科手术指南，对小鼠实施麻醉和镇痛处理。</li>
		<li>向胫前肌（TA）注射 25 μl 100 μM 心脏毒素（CTX；来源于Naja mossambica mossambica；注意：可能有害物质）。</li>
		<li>在给予他莫昔芬和 CTX 处理 24 小时后，通过胰酶消化法收集细胞并计数。</li>
		<li>以 232 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>用无 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS 洗涤细胞沉淀，离心后轻轻重悬于无 Ca2+ 和&#160;Mg2+ 的 PBS 中，调整终浓度为 106 个细胞/30 μl，此即每次注射的最终体积。</li>
		<li>使用 29 或 30 G 针头的注射器将 30 μl 细胞悬液注入先前已损伤的肌肉中。拔出针头时需特别小心，应缓慢操作，避免细胞悬液沿针道溢出。对侧胫前肌不进行移植，作为对照组，仅注射 30 μl 无 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS，以模拟移植组的处理条件。</li>
		<li>移植后继续给予他莫昔芬处理 6 天，并额外给予镇痛药物（例如&#160;卡洛芬）2 天。</li>
		<li>自移植后第 14 天起取出肌肉组织，按照方案 4 和方案 5 中所述步骤进行处理与分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 肌营养不良小鼠模型中的移植
该移植实验可用于评估IDEMs在肌营养不良小鼠模型中的植入程度。按照以下方法处理的动物还可用于评估疾病表型的功能改善情况。功能测试可在移植后两周开始进行。为增强细胞植入效果，可考虑在移植前进行跑台训练（如方案3所述）和/或每隔三周进行一次连续细胞注射，共注射3次（i.e.&#160;总计每块肌肉注射3次）。
<ol>
	<li>肌内移植
	<ol>
		<li>用3.5 mL的腹腔注射预处理动物 &#956;移植前24小时按每克体重给予10 mg/ml他莫昔芬（脂溶性制剂）1 μl/g，并在细胞移植前加入1 μl/g的他莫昔芬预处理细胞 &#956;将4-羟基他莫昔芬（M 4OH-temoxifen，水相制剂）加入生长培养基中，移植前夜孵育过夜。</li>
		<li>用胰酶消化法解离细胞，计数后在232 × g下离心5分钟。</li>
		<li>用 Ca 洗涤细胞沉淀2+- 和 Mg2+无钙 PBS 中离心，然后将沉淀重悬于 Ca2+- 和 Mg2+-游离 PBS 至浓度为 106 细胞/30 &#956;l.</li>
		<li>给予动物镇痛剂，并使用含聚维酮碘或氯己定的消毒剂对皮肤进行消毒（可选）。这也有助于定位 胫骨前肌 （TA） 腓肠肌 （GC），以及 股四头肌 （质量控制； specifically the 股中间肌）肌肉。</li>
		<li>注射30 &#956;使用29或30 G针头的注射器将细胞悬液注入肌肉。对于胫骨前肌（TA），将针头插入近端肌腱止点下方2 mm处，进针深度5 mm（头尾方向），角度为15&#176; 相对于胫骨倾斜，边回撤针头边缓慢注射细胞悬液（当针头仍有2 mm留在肌肉内时需排空注射器）。对于腓肠肌（GC）和股四头肌（QC），重复与胫骨前肌（TA）所述相同的操作步骤，主要区别在于：GC的进针位置为跟腱肌腱结合处上方2 mm处，沿尾向头方向进针；QC的进针位置为其远端肌腱上方2 mm处，同样沿尾向头方向进针（15&#176; 相对于股骨的角度）。拔出针头时需小心，避免细胞悬液沿针道溢出。 
		故障排除：若嵌合率较低，可考虑注射幼年（1-2周龄）小鼠7 3 × 105 细胞/10 &#956;l（注意，此情况下他莫昔芬需皮下注射）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动脉内移植 
	该部分实验方案可用于评估MIDEMs和HIDEMs通过动脉循环递送、穿越血管壁并参与注射部位下游骨骼肌再生的能力。
	<ol>
		<li>按照上述步骤 2.1.1 中所述对动物和细胞进行预处理。</li>
		<li>通过胰酶消化法解离，并用40 μm细胞筛过滤 &#956;m细胞筛（用于去除细胞悬液中的细胞团块，以防万一夜间暴露于他莫昔芬会促使相邻细胞融合并形成肌管），计数后于232 × g离心5分钟</li>
		<li>用 Ca 洗涤细胞沉淀2+- 和 Mg2+无钙 PBS 中离心，然后将沉淀重悬于 Ca2+- 和 Mg2+-0.2 国际单位的无菌 PBS 
		肝素钠单位（可选），使细胞终浓度为106 细胞/50 &#956;l. 加入10%专利蓝染料（终浓度：1.25 mg/ml，溶于生理盐水或含Ca2+- 和 Mg2+-free PBS）加入溶液中，以观察细胞悬液的分布情况。</li>
		<li>根据特定机构动物实验设施规定的外科手术操作指南，对小鼠给予麻醉和镇痛处理。</li>
		<li>剃除腹股沟区域（也称为股部或Scarpa三角）的毛发，并使用聚维酮碘或氯己定类消毒剂对皮肤进行消毒。</li>
		<li>做一道5-7毫米的切口，定位股部血管神经束：包括股静脉、股动脉和股神经（股神经位于股动脉外侧，股静脉位于内侧）。</li>
		<li>用镊子轻轻去除覆盖在组织束上的结缔组织筋膜。</li>
		<li>用镊子尖端（或30 G针头）轻轻插入股静脉和神经与动脉之间，逐步扩大间隙，以分离股静脉和神经与动脉。 
		故障排除：股静脉较为脆弱，在将其从股动脉分离时需注意避免用镊子夹伤。若发生出血，应用无菌纱布吸除血液，并使用微型电凝器促进止血。</li>
		<li>用镊子的一侧尖端提起动脉，用另一侧尖端夹住动脉。</li>
		<li>用配备30 G针头的注射器穿刺动脉。注射50 &#956;夹闭区域下游的细胞悬液，以约5的输注速度注入 &#956;l/sec 
		故障排除：注射前需小心重悬注射器中的细胞，避免细胞沉淀和注射器内气泡形成至关重要。股动脉的直径略小于30 G针头，在插入针头时需小心避免切断动脉。专利蓝染料有助于判断注射是否成功：若注射正确，整个肢体将迅速变为淡蓝色。</li>
		<li>缓慢移除动脉中的针头和镊子，以恢复肢体的血流。</li>
		<li>使用无菌纱布加压以防止出血，必要时进行电灼止血。</li>
		<li>缝合伤口，并在动物从麻醉中恢复期间进行监测。</li>
		<li>术后给予3天镇痛处理，并每天检查伤口（若出现伤口感染，应与动物房工作人员商讨并根据需要给予抗生素治疗）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 移植营养不良动物后的结果评估：跑台实验
从细胞移植后两周开始，可通过跑步机实验评估经治疗小鼠运动能力的功能性改善情况。该实验可用于评估经治疗小鼠的运动耐受性/耐力。当小鼠在静息区域躺卧超过5秒，并在连续三次机械刺激（每5秒一次）后仍未尝试重新登上跑步机时，即判定为疲劳。基线测量通常在治疗前约一个月开始，用于评估每只受试小鼠的个体改善情况。该实验之后可进行其他附加检测，以监测肌纤维脆性、力量改善、移植细胞的植入与分化，以及移植肌肉的形态学改善情况（参见讨论部分）。
<ol>
	<li>使动物适应环境（通常分为三组：治疗组、未治疗组、&#160;以及野生型/非肌营养不良对照组）在首次测量前进行运动：将跑步机速度设置为6 m/min&#160;10分钟。每隔一天重复一次，持续一周。 
	故障排除：每天在同一时间点记录所有测量数据，以避免因昼夜节律周期导致的偏差。</li>
	<li>将动物放入跑步机中，此前跑步机已设置为10°倾斜&#176;.</li>
	<li>打开跑步机，起始速度设为6米/分钟（若动物不愿开始运动，可提供轻微的机械刺激）。</li>
	<li>启动计时器，并以每分钟2米的速度增加速度&#160;每2分钟一次</li>
	<li>当动物在休息区静止超过5秒且未尝试重新踏上跑台时，用棒轻轻触碰以刺激其恢复运动（见上文）。</li>
	<li>记录每只动物的表现（时间或距离）。</li>
	<li>每周或每10天重复测量至少3次。</li>
	<li>移植后重复相同步骤。</li>
	<li>将每只动物的测量数据与其基线表现进行比较，分析性能数据。建议将数值绘制成图表，表示为相对于基线的平均运动能力的百分比，并采用单因素或双因素方差分析（ANOVA）进行统计分析，随后根据需要选择适当的多重比较检验方法对各组间差异进行比较。</li>
</ol>
故障排除：每组使用至少5只年龄、基因型和性别相匹配的动物，并在移植后至少重复测量3次。
4. 移植肌肉中细胞植入与分化的评估
移植组和对照组肌肉在适当的时间点被取出（&#60;短期移植分析为2天，中期为2至3周 &#62;1个月以进行长期分析）。如果移植的细胞标记了GFP，则可在配备紫外光源的体视显微镜下通过直接荧光观察，评估新鲜分离肌肉中的细胞植入情况。
<ol>
	<li>将新分离的肌肉组织用6%（w/v）的阿拉伯树胶沿垂直轴方向固定并定位</li>
	<li>将样品置于预冷的异戊烷中脱水1分钟，再放入液氮中冷冻至少2分钟，随后立即置于-80 °C保存</li>
	<li>使用冷冻切片机对样品进行处理，获得厚度为7 μm的切片，并贴附于防脱载玻片上。尽可能取材肌肉的大部分区域，收集约8–10张载玻片，每张含30–40个切片。建议另收集一系列切片至1.5 ml离心管中，用于后续分子生物学或生物化学检测</li>
	<li>根据实验设计，采用不同的免疫荧光染色方法评估细胞植入情况。例如，在将HIDEM细胞移植至Sgca-null/scid/bg小鼠时，对切片进行如下染色：a）使用抗Lamin A/C抗体标记移植的人源细胞核；b）使用抗Laminin抗体显示肌肉的整体结构；c）使用抗Sgca抗体检测供体细胞来源的、在肌营养不良动物中原本缺失的蛋白的恢复情况</li>
	<li>使用荧光显微镜定量分析每张肌肉切片中位于肌纤维内和肌纤维外的供体细胞核数量，以及每张切片中由供体细胞衍生的骨骼肌纤维数量</li>
</ol>
5. 肌肉组织病理学
组织病理学分析可用于评估移植肌肉的形态结构。作为细胞治疗策略的结果，预期会出现组织结构的架构改善。
<ol>
	<li>将新鲜分离的肌肉组织在4℃下用4%多聚甲醛固定1小时 &#176;C.</li>
	<li>使用递增的蔗糖梯度对样品进行脱水处理（例如 7.5-15-30%（w/v）</li>
	<li>在最高浓度的蔗糖溶液中过夜放置肌肉组织。</li>
	<li>将样本包埋于Tissue Tek OCT中，置于预冷的异戊烷中直至OCT完全凝固（避免样本完全浸没），随后在液氮中冷冻至少2分钟，并立即转移至-80℃保存 &#176;C 用于储存。</li>
	<li>使用冷冻切片机对样品进行处理，以获得7 &#956;m 厚的切片，方法如上所述。</li>
	<li>根据标准的厂家说明书，使用苏木精和伊红或马松三色染色法对切片进行染色。</li>
</ol>
苏木精和伊红染色可用于计算再生肌肉的标志性特征，例如：a）肌纤维数量；b）横截面积；c）含有中央细胞核的肌纤维数量。马松三色染色用于计算纤维化指数，即用图像的总面积减去骨骼肌纤维所占的总面积：所得面积主要反映肌肉中的结缔组织和脂肪浸润。所有图像分析均可使用 ImageJ 软件（NIH）结合测量工具和细胞计数插件完成。

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</ol>

F.S.T. 已提交一项国际专利申请（申请号：PCT/GB2013/050112），其中包含本文所述部分策略。他的研究获得了 Promimetic 公司和 DWC 公司的资助。

iPSCs 可以在保持其自我更新潜能的同时无限扩增，从而被诱导分化为多种细胞谱系12。由于这一特性及其他原因，iPSC 来源的干细胞/祖细胞被认为是自体基因治疗和细胞治疗策略中极具前景的细胞来源13。作者此前发表的研究报道了从小鼠和人类 iPSCs 中生成具有类似于周细胞来源的 MABs 表型的肌源性祖细胞（IDEMs），并证实这些细胞在肌营养不良小鼠模型中可有效参与肌肉再生7。
最大化 IDEM 成肌潜能的前提是细胞中表达成肌因子 MyoD。通过使用他莫昔芬诱导型 MyoD-ER 表达盒进行转导，可实现对 MyoD 表达的精确时间控制，其优势在于能够同步整个培养体系中 MyoD 的激活，并可在后续的 体内 实验中发挥作用。本文描述了一种基于每块肌肉（或每侧股动脉）单次给药的细胞移植策略。然而，已有研究表明，在不同的细胞治疗方案中，重复细胞注射可有效提高 MAB 的移植效率8。因此，若 IDEM 移植效果不理想，值得尝试多次移植以增加细胞剂量，从而提高其对宿主肌肉的贡献。</p...

Mesoangioblasts（MABs）是一类与血管相关的肌肉前体细胞，来源于周细胞的一个亚群1-3。与卫星细胞等经典肌肉前体细胞相比，MABs的主要优势在于，当通过动脉内递送时，它们能够穿越血管壁，从而在细胞治疗方案中促进骨骼肌的再生4。这一特性已在小鼠和犬类的肌营养不良模型中得到评估和证实1,5,6。这些临床前研究为首次在人体开展的I/II期临床试验奠定了基础，该试验基于向杜氏肌营养不良患儿动脉内移植供体HLA相同的MABs（EudraCT编号：2011-000176-33；目前在意大利米兰圣拉斐尔医院进行）。在需要数十亿细胞来治疗全身肌肉的细胞治疗策略中，一个主要障碍是“药物产品”（即细胞）的增殖潜力有限。此外，最近的研究表明，某些类型的肌营养不良患者无法获得MABs，例如在肢带型肌营养不良2D型（LGMD2D；OMIM #608099）中即存在此问题7。
为克服这些局限性，近期已建立了一种从人和小鼠iPSCs中诱导生成MAB样干细胞/祖细胞的方案7该方法可获得易于扩增的细胞群体，其血管相关基因表达特征和免疫表型与成体肌肉来源的MABs高度相似。在表达成肌调节因子MyoD后，小鼠和人源IDEMs（分别为MIDEMs和HIDEMs）均可发生终末骨骼肌分化。为实现这一目的，可利用能够驱动MyoD表达的载体对IDEMs进行转导，该表达可为组成型，也可为诱导型。8-10使用包含与雌激素受体融合的 MyoD cDNA（MyoD-ER）的慢病毒载体，从而可在给予他莫昔芬（一种雌激素类似物）后诱导其转入细胞核11该策略可高效形成肥大的多核肌管7值得注意的是，IDEMs 不具有致瘤性，移植后可在宿主肌肉内定植并分化，并可利用不同载体进行遗传学矫正例如 慢病毒或人工染色体），为未来的自体治疗策略奠定了基础。上述文献已描述了IDEMs的建立、鉴定与移植方法。7. 本方案论文详细描述了用于评估的实验方法 体外 IDEMs的成肌分化及其移植后在肌肉再生小鼠模型中疗效的后续评估指标。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>MegaCell DMEM</td><td>Sigma</td><td>M3942</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5671</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Sigma</td><td>I3390</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>马血清</td><td>Euroclone</td><td>ECS0090L</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Lonza</td><td>DE14801F</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS 钙/镁离子无</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ITS（胰岛素-转铁蛋白-硒）</td><td>Gibco</td><td>51500-056</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>非必需氨基酸溶液</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fer-In-Sol</td><td>美赞臣</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ferlixit</td><td>Aventis</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>油酸</td><td>Sigma</td><td>01257-10 mg</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>亚油酸</td><td>Sigma</td><td>L5900-10 mg</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）</td><td>Gibco</td><td>AA 10-155</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>生长因子减少型Matrigel</td><td>Becton Dickinson</td><td>356230</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>肝素钠</td><td>Mayne Pharma</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>有害的</td></tr><tr><td>专利蓝染料</td><td>Sigma</td><td>19, 821-8</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-4884</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>TAAB</td><td>P001</td><td>有害的</td></tr><tr><td>他莫昔芬</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>4-OH 他莫昔芬</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>pLv-CMV-MyoD-ER(T)</td><td>Addgene</td><td>26809</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>心脏毒素</td><td>Sigma</td><td>C9759</td><td>有害的</td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>黄蓍胶</td><td>MP Biomedicals</td><td>104792</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>异戊烷</td><td>VWR</td><td>24,872,323</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tissue-tek OCT</td><td>樱花</td><td>4583</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>VWR</td><td>27,480,294</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>极化玻璃载片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>J1800AMNZ</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>伊红Y</td><td>Sigma</td><td>E4382</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Sigma</td><td>HHS32</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>马松三色染色</td><td>Bio-Optica</td><td>04-010802</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>小鼠抗肌球蛋白重链抗体</td><td>DSHB</td><td>MF20</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>小鼠抗 Lamin A/C 抗体</td><td>诺沃卡斯特拉</td><td>NLC-LAM-A/C</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Fluka</td><td>B2261</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>兔抗层粘连蛋白抗体</td><td>Sigma</td><td>L9393</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;材料与设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>可吸收抗菌缝合线 4-0</td><td>Ethicon</td><td>vcp310h</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>30 G 针头注射器</td><td>BD</td><td>324826</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>跑步机</td><td>Columbus 仪器</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>尼康</td><td>SMZ800</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Leica</td><td>DMIL LED</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>异氟烷装置</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>光纤</td><td>Euromecs（荷兰）</td><td>EK1</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>加热垫</td><td>兽医技术</td><td>C17A1</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Swann-Morton</td><td>11REF050</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>手术镊</td><td>精细科学工具</td><td></td><td>5/45</td></tr><tr><td>高温灼烧器</td><td>Bovie Medical</td><td>AA01</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;培养基成分&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">培养基成分如下所述。&lt;br/&gt; HIDEMs 生长培养基： &lt;ul&gt; &lt;li&gt;MegaCell Dulbecco's Modified Eagle Medium（MegaCell DMEM）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;5% 胎牛血清（FBS）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;2 mM 谷氨酰胺&lt;/li&gt; &lt;li&gt;0.1 mM &amp;beta;-巯基乙醇&lt;/li&gt; &lt;li&gt;1% 非必需氨基酸&lt;/li&gt; &lt;li&gt;5 ng/ml 人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;100 IU/ml 青霉素&lt;/li&gt; &lt;li&gt;100 mg/ml 链霉素&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt; 或者，如果上述某些试剂无法获得，HIDEMs 可在以下培养基中培养： &lt;ul&gt; &lt;li&gt;Iscove's 改良型 Dulbecco's 培养基（IMDM）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;10% FBS&lt;/li&gt; &lt;li&gt;2 mM 谷氨酰胺&lt;/li&gt; &lt;li&gt;0.1 mM &amp;beta;-巯基乙醇&lt;/li&gt; &lt;li&gt;1% 非必需氨基酸（NEAA）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;1% ITS（胰岛素/转铁蛋白/硒）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;5 ng/ml 人 bFGF&lt;/li&gt; &lt;li&gt;100 IU/ml 青霉素&lt;/li&gt; &lt;li&gt;100 mg / ml 链霉素&lt;/li&gt; &lt;li&gt;0.5 &amp;mu;油酸和亚油酸&lt;/li&gt; &lt;li&gt;1.5 &amp;mu;M Fe&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; (Fer-In-Sol)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;0.12 &amp;mu;M Fe&lt;sup&gt;3+&lt;/sup&gt; (Ferlixit)&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt; MIDEMs 生长培养基： &lt;ul&gt; &lt;li&gt;DMEM&lt;/li&gt; &lt;li&gt;20% FBS&lt;/li&gt; &lt;li&gt;2 mM 谷氨酰胺&lt;/li&gt; &lt;li&gt;5 ng/ml 人 bFGF&lt;/li&gt; &lt;li&gt;100 IU/ml 青霉素&lt;/li&gt; &lt;li&gt;100 mg/ml 链霉素&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt; 分化培养基： &lt;ul&gt; &lt;li&gt;DMEM&lt;/li&gt; &lt;li&gt;2% 马血清（HS）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;100 IU/ml 青霉素&lt;/li&gt; &lt;li&gt;100 mg/ml 链霉素&lt;/li&gt; &lt;li&gt;2 mM 谷氨酰胺&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt; &lt;br/&gt; &lt;br/&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;表1. 试剂、材料、设备和培养基列表&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

诱导多能干细胞来源的类血管壁细胞样肌源性前体细胞在小鼠肌肉再生模型中的移植

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

源自患者的诱导多能干细胞（iPSC）可能是未来自体细胞治疗方案中一种极为宝贵的细胞来源。可从患有不同类型肌营养不良症患者的iPSC中建立类似于周细胞来源的中血管母细胞的iPSC来源成肌干细胞/前体细胞（iPSC来源的类中血管母细胞干细胞/前体细胞：IDEMs）。患者特异性的IDEMs可通过不同策略（例如 慢病毒载体、人工作染色体）进行遗传学校正，并通过过表达成肌调节因子MyoD来增强其成肌分化潜能。该成肌潜能随后通过体外（in vitro）特异性分化检测进行评估，并采用免疫荧光法进行分析。IDEMs的再生潜能进一步在体内（in vivo）通过两种代表性小鼠模型中的肌肉内和动脉内移植进行评估，这些模型分别表现出急性与慢性肌肉再生。IDEMs对宿主骨骼肌的贡献随后通过多种功能测试在移植小鼠中得以确认。特别是，通过跑台实验研究动物运动能力的改善情况。细胞的植入与分化则通过对移植肌肉组织进行多种组织学和免疫荧光检测进行评估。总体而言，本文描述了目前用于评估IDEMs分化能力的实验方法与工具，重点介绍移植方法及后续的疗效评价指标，以分析细胞移植的有效性。

所报道的代表性结果遵循主要方案 体外/体内 工作流程中所示的检测方法 图148小时后，在经4OH-他莫昔芬处理的MyoD-ER转导IDEM细胞培养物中可识别出MyoD阳性细胞核图2A）。随后，细胞融合并分化为多核的肌管（图2B）。当移植到急性肌肉损伤的小鼠模型中时，IDEMs 可促进组织再生（图3）。通过跑步机运动耐受试验，评估了IDEMs在小鼠肌营养不良模型的基因与细胞治疗环境中的疗效： 图4 显示将野生型MIDEMs移植到Sgca-null/scid/beige小鼠后获得的结果，表明经治疗小鼠的运动能力有所改善7. 离体 移植肌肉的分析显示，GFP阳性区域代表了IDE Ms定植于宿主组织的程度（图5A-C），从而证明供体细胞能够植入 dystrophic 肌肉中。重要的是，移植的细胞能够分化 体内，形成新的骨骼肌纤维。事实上 图5</stro...

由诱导性多能干细胞（iPSC）衍生的成肌祖细胞是治疗肌肉营养不良症的细胞治疗策略中颇具前景的候选细胞。本方案描述了在急性与慢性肌肉再生小鼠模型中，评估iPSC来源的血管壁干细胞（一类肌肉祖细胞）移植后植入与分化能力所需的移植操作及功能检测方法。

源自患者的iPSCs可成为未来自体细胞治疗方案中一种极为宝贵的细胞来源。源自iPSC的成肌干细胞/前体细胞（类似于周细胞来源的中动脉血管母细胞，即iPSC来源的类中动脉血管母细胞：IDEMs）可由来自不同类型肌营养不良症患者的iPSCs建立。针对患者特异性的IDEMs，可采用多种策略进行基因校正（例如慢病毒载体、人源人工染色体），并通过过表达成肌调控因子MyoD增强其成肌分化潜能。该成肌潜能随后在体外通过特定的分化检测进行评估，并采用免疫荧光法进行分析。IDEMs的再生能力进一步在体内通过两种代表性的小鼠模型进行评估，这些小鼠模型分别表现出急性与慢性肌肉再生特征，移植途径包括肌肉内注射和动脉内注射。在移植小鼠中，通过多种功能测试验证IDEMs对宿主骨骼肌的贡献。特别是通过跑台实验研究动物运动能力的改善情况。随后，通过一系列组织学和免疫荧光检测方法对移植肌肉中的细胞植入与分化情况进行评估。总体而言，本文描述了目前用于评估IDEMs分化能力的实验方法与工具，重点介绍细胞移植技术及后续用于分析细胞移植疗效的各项检测指标。

本实验的总体目标是评估诱导性多能干细胞来源的肌肉前体细胞在急性与慢性肌肉再生小鼠模型中的成肌潜能。首先通过体外实验评估细胞的成肌潜能，第二步是通过肌肉内注射移植这些细胞。或者，通过显微外科手术将细胞注入股动脉。最后一步是评估经治疗动物 dystrophic 表型的功能改善情况。最终，采用免疫荧光和组织学检测来证明供体细胞在宿主肌肉中的植入及其功能贡献。该方法有助于解答骨骼肌再生领域的关键问题，例如细胞治疗策略的研究。该技术的应用前景涵盖肌营养不良症的治疗，因为它可能为利用诱导多能干细胞（iPS细胞）衍生的祖细胞进行自体细胞治疗策略提供途径。尽管该方法主要用于深入了解基于干细胞的治疗方法，但它也可应用于其他系统，例如分子的递送，包括肌肉内或动脉内注射，以及后续对肌肉功能和形态影响的分析。我们最初产生这一方法的想法，是在意识到诱导性多能干细胞（IPSL）培养能够提供一种克服成体干细胞某些局限性的途径，例如组织活检来源有限以及扩增潜力不足等问题。首先，构建一个稳定细胞系，该细胞系中的细胞被转导了可被他莫昔芬诱导的载体，该载体过表达成肌调节因子 MyoD。接着，用 1% Matrigel 包被培养板，经培养基洗涤后，将转导后的细胞接种至培养板中，并在 37°C 条件下于生长培养基中孵育。细胞应在一到两天内达到汇合状态。当细胞准备就绪后，在生长培养基中加入一微摩尔的羟基他莫昔芬。24小时后，将生长培养基更换为含有一微摩尔羟基他莫昔芬的分化培养基。每天观察细胞培养物中肌管的形成情况，并每隔一天用新鲜的分化培养基更换一半的培养液。当培养物准备就绪后，将其用于移植实验。本实验采用营养不良且免疫缺陷的小鼠，以评估肌内移植的植入程度。在移植前24小时，对动物注射他莫昔芬进行预处理。细胞也应在移植前一晚，在培养基中添加他莫昔芬进行预处理。在移植当天，用胰蛋白酶消化细胞，计数并离心，用PBS洗涤细胞一次，然后在无钙无镁的PBS中重悬，调整细胞浓度至每30微升含10⁶个细胞。麻醉动物并消毒皮肤后，定位胫骨前肌，确定近端肌腱的附着点，插入针头。在此点下方两毫米处进针。将针头以与胫骨成15度角倾斜插入肌肉5毫米，边缓慢注射细胞悬液边回撤针头。当针头仍有两毫米留在肌肉内时，排空注射器。从肌肉中拔出针头时需小心操作，以避免细胞悬液沿针道溢出。采用相同的操作步骤，在跟腱和股四头肌的肌腱连接处上方两毫米处进行小腿肌肉注射。对于股动脉内移植，需在远端肌腱上方两毫米处进行注射。按照先前所述方法，用他莫昔芬对动物和细胞进行预处理。准备移植时，按先前所示方法制备细胞，但需在离心前进行过滤。将细胞沉淀重悬于无钙、无镁的 PBS 中，并加入 10%专利蓝染料，以便观察细胞悬液的分布情况。在注射前，轻轻重悬注射器中的细胞，并去除所有气泡；麻醉后，剃除并消毒操作区域，如图所示，做一个5至7毫米的切口，并定位股部血管束。用镊子轻轻去除覆盖在血管束上的结缔筋膜。接着，用镊子尖端轻轻插入股静脉和神经与动脉之间，逐步扩大间隙，从而将股静脉和神经与动脉小心分离。股静脉较为脆弱。在将其与股动脉分离时，注意不要夹伤。分离后，用镊子的一端提起动脉，用另一端夹住动脉。使用30 G针头穿刺动脉，在夹闭区域的远端以约每秒5微升的输注速度注入50微升细胞悬液。缓慢将针头和镊子从动脉中取出，以恢复肢体的血流。用无菌纱布按压以防止出血，必要时进行电灼止血。专利蓝染料可实现对正确注射位置的即时识别，若注射正确，整个肢体将迅速变为浅蓝色，缝合伤口并监测动物直至其恢复。给予三天镇痛处理，并每天检查伤口。通过跑步机实验评估经处理小鼠运动能力的每日变化。基线测量大约在治疗前一个月开始，用于评估每只受试动物的改善情况。测试前的第一步是让动物适应运动。为此，将跑步机速度设定为每分钟6米，持续10分钟。每隔一天重复此操作，持续一周。待动物熟悉设备后，将坡度设置为10度，并将动物放入跑台的跑道中。启动跑台，初始速度设为6米/分钟。对不愿开始运动的动物可轻轻 nudging 以促使其运动。接着，启动计时器，并在动物于休息区域停留超过五秒后，每两分钟将速度增加两米每分钟。无需尝试重新启动跑步机，只需用棒轻轻触碰动物以刺激其重新开始运动。当动物在休息区域停留超过五秒且未尝试重新登上跑步机时，即判定为疲劳。在连续给予三次机械刺激（每次间隔5秒）后，记录每只动物的表现，并在细胞移植两周后开始，每周或每10天重复测量至少三次。在治疗组小鼠完成检测后，重复相同的实验流程。通过与基线比较来评估性能变化。在四次给予羟基他莫昔芬48小时后，可在培养物中转导了myo DER的样本内观察到myo de阳性细胞核。如下图所示。一周后，细胞融合并分化为多核的肌管。当将其移植到急性肌肉损伤的对称模型中时，这些细胞可促进组织再生，且跑台运动耐受试验显示，移植后治疗组小鼠的运动能力得到改善。移植肌肉的离体分析显示，GFP阳性区域代表了IMS在宿主组织中的定植范围，从而证明供体细胞能够植入到营养不良性肌肉中。重要的是，移植的细胞能够在体内分化，形成新的骨骼肌纤维。此例显示了经基因校正的IMS在α-肌聚糖缺失的skid beige小鼠中表达α-肌聚糖的情况。Masson三色染色显示，经处理的肌肉中纤维化组织的量有所减少。在此基础上，可进一步采用FreeWheel测试、伊文思蓝染色法（Evan's Blue Dye assay）以及单根肌纤维或整体肌肉力学检测等方法，以回答有关自主运动功能改善、肌纤维脆性及特异性力量等方面的问题。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过体外（in vitro）、体内（in vivo）和离体（ex vivo）实验，评估由诱导多能干细胞（iPS细胞）衍生的成肌祖细胞的成肌分化能力、移植潜能及其功能效能。

transplantation-induced-pluripotent-stem-cell-derived-mesoangioblast

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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