代谢标记与膜组分分离用于比较蛋白质组学分析 拟南芥 悬浮细胞培养

以下实验的总体目标是分离不同的膜亚区室，并研究它们不同的蛋白质组成。通过在不同条件下对细胞进行稳定同位素标记，从而能够区分不同的处理组。在第二步的质谱分析中，将来自两种处理组的细胞材料混合，以确保后续步骤统一处理，减少样品间差异。

接下来，通过蔗糖密度梯度离心将质膜亚区室进一步纯化并分离为无菌、富集及无菌耗竭的亚区室。基于定量质谱数据，离心结果呈现出在不同处理条件下各亚区室中蛋白质丰度的差异。该方案相较于现有方法（如蛋白质印迹法）的主要优势在于，我们能够对数千种蛋白质在亚区室中的分布进行定量记录，从而发现参与信号转导过程的新候选蛋白。

该方法的可视化演示至关重要，因为双相系统中ME的纯化过程较难掌握，其原因在于该过程涉及多个步骤，且需要精确的控制和彻底的操作。该方法可通过发现新的作为膜过程调控因子的蛋白质候选物，帮助回答信号传导领域中的关键科学问题。首先，按照文本方案中所述方法培养标记与未标记的拟南芥（Arabidopsis）ANA细胞悬浮培养物。

取约一升培养七天的细胞悬浮液，在液氮中将等量的标记与未标记冷冻细胞（按鲜重计）混匀，置于烧杯中，加入两倍体积的H缓冲液，立即将烧杯置于摇床上，振荡至材料完全融化且无冰晶残留。用一层镜布将匀浆过滤至250毫升离心管中，用H缓冲液平衡样品后，于10,000 ×g离心8分钟。离心后，将上清液转移至预冷的超速离心管中，每管体积约为32毫升。

用缓冲液平衡样品后，于 100,000 G 和 4 摄氏度条件下离心 30 分钟，使微粒体沉淀。离心后去除上清液，该上清液含有可溶性蛋白质。可保留少量此组分用于进一步的蛋白质沉淀，以及可溶性蛋白质的后续分析。将各样品的膜沉淀物重悬于相应体积的缓冲液 R 中，具体操作如文本方案所述，然后加样至 U 1 两相系统的上层。

若使用六克两相系统，则准确加载两克重悬的膜沉淀，并在U2中加入与样品重悬液所用体积相同的纯缓冲液R。通过每秒约一次的速度倒置30次，缓慢混合U1和U2试管，然后在1500 ×g及4°C条件下离心10分钟。离心后，移除U2中的上相。将U1中的上相转移至U2，再使用相同参数重复离心步骤。接着，将U2中的上相转移至超速离心管中，加入五倍体积的缓冲液R并充分混匀，然后在200,000 ×g及4°C条件下离心1小时。

最后，进行再利用。将膜沉淀物重悬于少量 T 和 E 缓冲液中，用于分离去垢剂抗性膜。通过 Bradford 法测定质膜组分的浓度后，向质膜组分中加入 Triton X-100，使去垢剂与蛋白质的重量比在 13 至 15 之间，最终去垢剂浓度在 0.5% 至 1% 之间。将样品在约 100 RPM 条件下，4°C 摇动 30 分钟。

然后向一份体积的处理后质膜中加入三份体积的 2.4 摩尔蔗糖溶液，使蔗糖的终浓度为 1.8 摩尔。在超速离心管中制备蔗糖梯度，将相应的蔗糖溶液加在 1.8 摩尔组分的上方。在 250,000 ×g 和 4 摄氏度条件下离心样品 18 小时。小心地从转子中取出超速离心管，避免扰动低密度条带，该条带可能在 0.15 摩尔与 1.4 摩尔蔗糖界面处呈现为乳白色环状结构。

有时可能看不到任何物质，但去垢剂抗性蛋白组分仍然存在。从梯度顶部取出0.75毫升体积的组分，即第二和第三组分，涵盖界面环上方约1.5毫升体积的部分，以及界面环下方0.5毫升的部分。

代表去污剂抗性膜组分。将这些组分收集至15毫升Falcon离心管中。第9和第10组分含有去污剂可溶性膜组分，也可同时收集用于比较。

为开始从去污剂抵抗组分中提取蛋白质，向收集的组分中加入四倍体积的甲醇，并充分涡旋混匀。然后加入一倍体积的氯仿，再次充分涡旋混匀。最后加入三倍体积的水，充分涡旋后，在2000 G下离心五分钟。

使用台式离心机，去除位于蛋白层与间相之间的水相。接着加入三倍体积的甲醇并涡旋振荡。在进行溶液内消化前，彻底去除上清液S，保留沉淀。

开始溶液内消化，将样品溶解于少量六摩尔尿素、两摩尔盐酸胍、pH 8（简称UTU）中。使用与样品相容的最小体积。样品离心并按文本方案进行消化后，加入四倍体积的10毫摩尔Tris-HCl pH 8稀释样品。

然后每50微克样品蛋白质加入1微升胰蛋白酶，于室温下以700转/分钟持续振荡孵育过夜，随后在4,000 ×g 下离心10分钟。最后，通过加入约十分之一体积的2%三氟乙酸，将样品酸化至三氟乙酸终浓度为0.2%，使pH达到2。制备C18固相萃取小柱时，将一个C18膜圆盘置于洁净的平整表面（如一次性塑料培养皿）上。

使用直径为1.5毫米的钝头皮下注射针打取一个小圆片。该圆片会粘附在针内，并可转移至移液枪头中。将圆片从针头中推出，并使用一段熔融石英或适合针内径的管件将其固定在移液枪头的锥形部位，通过在制备好的C18固相萃取小柱上加入50 µL溶液B对其进行预处理。

在台式离心机中，以2000 RPM的转速离心尖端两分钟。使用100微升溶液a在台式离心机中平衡Stage Tip。以5,000 ×g在台式离心机中离心尖端。重复平衡和离心步骤。

将样品小心地移入装有C18小柱的移液枪头中，以完成上样。将枪头放入离心机中离心，直至样品全部通过C18小柱。用100微升溶液A将StageTip清洗两次。枪头离心后，用新的1.5毫升离心管收集洗脱液，并加入40微升溶液B，随后进行离心。

再次在理想条件下，使用真空浓缩仪将样品浓缩。当剩余液体约为一到两微升时，停止脱水过程。最后一步，向样品中加入九微升的Resus重悬溶液，混匀后转移至微孔板，用于质谱分析。

通过蛋白质组学分析两相系统中下相的小量等分试样、组分及蛋白质，可显示质膜蛋白的富集情况。下相含有细胞的内膜结构。例如，典型的已知质膜蛋白（如受体激酶蛋白）在质膜组分中丰度较高，而在含有内膜结构的下相组分中丰度较低。

内质网的已知蛋白质在内膜组分中表现出高丰度，而在质膜组分中未被检测到。随后对去垢剂抗性膜组分进行富集，在理想情况下会形成一层乳白色低密度膜囊泡环状物。在离管底约五分之一高度处，可检测到remn蛋白在去垢剂抗性膜（DRM）组分中丰度最高，符合预期结果。

相反，不存在于膜中的蛋白质，例如微结构域中的A b、C转运蛋白，在DRM组分中不会表现出丰度增加。此外，典型的污染物，如来自ATP酶F零复合物的线粒体蛋白以及来自60S核糖体的核糖体蛋白，在DRM组分中也不会表现出富集的丰度。尽管在质谱分析后仍可能检测到微量成分，但通过定量分析可明确区分血浆膜中蛋白质磷酸化状态的蛋白丰度比，以及标记与未标记细胞培养物的组分差异。

在 MS 定量窗口中，典型结果应显示大多数已鉴定肽段的离子强度比为 1:1。离子强度比显著偏离 1:1 的肽段被认为在标记与未标记的细胞培养物之间存在差异调控，是与处理干预所影响蛋白相匹配的候选肽段。成功的代谢标记良好的质量控制指标是，如图所示，在纳米液相色谱分离中，标记与未标记的肽段形式应合并为单一峰形。

一旦掌握，该技术从提取开始到样品上样至质谱仪，可在三天内完成。在完成该实验步骤后，还可进行其他方法，如Western印迹，以进一步探究特定目标蛋白的表达情况。因此，在观看本视频后，我们应能够充分理解如何混合稳定同位素标记的植物细胞培养物，如何利用双相系统进行质膜纯化，以及如何分离富含甾醇与缺乏甾醇的膜亚区室。