代谢标记和膜分馏的比较蛋白质组学分析
2013年9月28日
在这里，我们描述了植物细胞质膜的基础上，未标记的混合物分馏成耐洗涤剂和清洁剂的可溶性和膜在体内完全15 N标记的拟南芥细胞培养一个强大的方法。该过程被施加于比较蛋白质组学研究，了解信令进程。
以下实验的总体目标是分离不同的膜亚室并研究它们的差异蛋白组成。这是通过在不同条件下对细胞进行稳定的同位素标记以区分处理方法来实现的。在质谱分析作为第二步中，将两种处理方法的细胞材料混合，这确保了联合处理并减少了样品之间的变异。
接下来，等离子体膜亚室被纯化并通过蔗糖分离为无菌、富含和无菌耗竭亚室。根据定量质谱的数据，得到梯度离心结果，显示了在不同处理下亚室的蛋白质丰度差异。与现有方法（如蛋白质印迹）相比，该协议的主要优势是我们可以定量记录数千种蛋白质的亚室分布，从而发现新的信号传导过程候选者。
对于这种方法的视觉演示至关重要，因为清洁两相系统的纯化很难学习。原因是它涉及很多步骤，精确的控制和彻底的处理非常重要。这种方法可以通过发现新的蛋白质候选者作为膜过程的调节剂来帮助回答信号领域的关键问题。从文本协议中描述的标记和未标记的拟南芥ana细胞悬浮培养物开始。
将约一升七天的细胞悬浮培养物的同质化细胞在液态氮中混合，根据新鲜重量在搅拌器中混合相同数量的标记和未标记的冷冻细胞培养物，并加入两倍体积的缓冲液H，立即将搅拌器放在摇床上，摇晃直到材料融化且没有冰。通过一层镜布将浆液过滤到250毫升离心管中，用缓冲液H平衡样品后，以10,000 Gs的速度离心八分钟。离心后，将snat装入预冷的超离心管中，体积约为32毫升。
用缓冲液h平衡样品后，通过在100,000 Gs和四摄氏度下离心30分钟来盘取微粒。离心后，移除上清液，上清液含有可溶性蛋白。可以保存少量此分数用于进一步的蛋白沉淀和随后的可溶性蛋白分析，用文本协议中描述的缓冲液R的相应量重新悬浮每个样品的膜盘，并将其加载到U一两相系统的顶部。
如果使用六克两相系统，则加载重新悬浮的膜盘的确切两克，加载与样品重悬悬浮液使用的纯缓冲液R相同体积的缓冲液R到U2。通过每秒大约一次翻转30次来缓慢混合U一和U2管，将样品在1500 Gs和四摄氏度下离心10分钟。离心后，从U2中取出上相。在使用相同参数重复离心之前，将上相从U一转移到U2。接下来，将U2的上相移动到超超离心管中，用五倍体积的缓冲液R稀释并充分混合，将样品在200,000 Gs和四摄氏度下离心一小时。
最后，重新使用。将膜盘悬浮在少量的T和E缓冲液中以分离耐洗涤剂的膜。通过Bradford检测法检查等离子体膜分数的浓度后，以洗涤剂与蛋白质的重量比在13至15之间，最终洗涤剂浓度在0.5至1%之间，将Triton X 100加入等离子体膜分数中。在四摄氏度和100 RPM下摇晃样品30分钟。
然后向处理过的等离子体膜的一体积中加入三体积的2.4摩尔蔗糖，以获得1.8摩尔的最终蔗糖浓度。通过在1.8摩尔分数的顶部加载各个蔗糖溶液，在超离心管中制备蔗糖梯度。将样品在250,000 GS和四摄氏度下离心18小时。小心地从转子中取出超离心管，以避免低密度带的破坏，这可能在0.15摩尔和1.4摩尔蔗糖的界面处可见为乳白色环。
有时什么都看不到，但耐洗涤剂的蛋白质分数仍然存在。从梯度顶部取出0.75毫升体积的分数，即分数2和3，覆盖界面环以上约1.5毫升的体积。以及界面环以下0.5毫升的分数。
代表耐洗涤剂的膜分数。将这些分数收集到15毫升的Falcon管中。分数9和10含有可溶于洗涤剂的膜分数，也可以收集以进行比较。
要开始从耐洗涤剂分数中提取蛋白质，向收集的分数中加入四倍体积的甲醇，然后彻底涡流。然后再次彻底涡流后加入一倍体积的氯仿。最后，加入三倍体积的水并彻底涡流。将样品在2000 Gs下离心五分钟。
使用台式离心机，移除界面中蛋白层上方的水相。接下来，加入三倍体积的甲醇并涡流。彻底移除S上清液，然后提取颗粒以准备溶液消化。
开始溶液消化，将样品溶解在六摩尔尿素、两摩尔甲状腺pH 8的小体积中（简称UTU）。尽可能使用与样品兼容的最低体积。在旋转样品并按照文本协议进行消化后，用四倍体积的10毫摩尔的Tris HCL pH 8稀释样品。
然后向每50微克样品蛋白添加一微升胰蛋白酶，在室
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Overview
This study presents a method for fractionating plant plasma membranes into detergent resistant and soluble membranes using labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The approach facilitates comparative proteomic analysis to investigate signaling processes.
Key Study Components
Area of Science
- Plant Biology
- Proteomics
- Cell Membrane Studies
Background
- Understanding membrane sub compartments is crucial for studying cellular signaling.
- Stable isotope labeling allows for differentiation of protein compositions under various conditions.
- Existing methods like Western blotting have limitations in quantifying protein distributions.
- Mass spectrometry provides a robust platform for analyzing protein abundances.
Purpose of Study
- To separate different plasma membrane sub compartments.
- To analyze differential protein composition across treatments.
- To identify new candidates involved in signaling processes.
Methods Used
- Stable isotope labeling of Arabidopsis thaliana cell cultures.
- Mass spectrometric analysis for protein quantification.
- Sucrose gradient centrifugation for membrane purification.
- Comparative analysis of protein abundances across treatments.
Main Results
- Successful separation of plasma membrane sub compartments.
- Identification of differential protein abundances under various conditions.
- Quantitative data revealing new insights into signaling processes.
- Enhanced understanding of protein distribution compared to traditional methods.
Conclusions
- The developed method offers a robust approach for studying plant membrane proteins.
- It enables the discovery of novel signaling candidates.
- This protocol improves the accuracy of proteomic studies in plant biology.
Frequently Asked Questions
Chapters in this video
0:05
Title
1:35
Plasma Membrane Purification
3:56
Detergent Resistant Membrane Preparation
5:33
Extraction of Proteins from the Detergent Resistant Fraction and In-solution Trypsin Digestion
7:04
Use of C18-StageTips for Peptide Desalting and Concentration
8:48
Results: Comparative Proteomic Analysis
11:00
Conclusion
