Name: 代谢标记和膜分馏的比较蛋白质组学分析拟南芥悬浮细胞培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: 学习利用稳定同位素标记和蔗糖密度梯度离心技术分离拟南芥悬浮细胞质膜亚区室的方法。该方案通过定量质谱分析差异蛋白组成，帮助研究者发现植物信号传导过程中的新候选蛋白。

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实验步骤
提取方案中常用的试剂和缓冲液：
<ol>
	<li>JPL培养基用于 拟南芥 悬浮细胞培养
	<ul>
		<li>3 μM H3BO3</li>
		<li>3 μM MnSO₄4 x H2O</li>
		<li>1.1 μM ZnSO₄4 x 7 H2O</li>
		<li>0.15 μM KJ</li>
		<li>0.03 μM Na2MoO4 x 2 H2O</li>
		<li>3 nM CoCl2 x 6 H2O</li>
		<li>3 nM CuSO₄4 x 5 H2O</li>
		<li>0.9 mM CaCl2 × 2 H2O</li>
		<li>0.5 mM MgSO₄4 x 7 H2O</li>
		<li>0.5 μM FeSO4 x 7 H2O</li>
		<li>0.5 μM Na2EDTA × 2 H2O</li>
		<li>0.12 μM 盐酸硫胺</li>
		<li>0.16 μM 烟酸</li>
		<li>0.097 μM 盐酸吡哆素</li>
		<li>0.107 μM NAA</li>
		<li>0.375 mM KH2PO4</li>
		<li>0.061 mM NaH2PO4 x 2 H2O</li>
		<li>0.039 mM Na2HPO4</li>
		<li>0.027 mM 甘氨酸</li>
		<li>0.56 mM 肌醇</li>
		<li>1.5% 蔗糖</li>
		<li>10 mM K14一氧化氮3 或 10 mM K15一氧化氮3</li>
	</ul>
	</li>
</ol>
注意：应用 KOH 将 JPL 培养基的 pH 值调节至 5.7。培养基在使用前必须通过过滤或高压灭菌进行灭菌。
<ol start="2">
	<li>缓冲液 H
	<ul>
		<li>100 mM HEPES-KOH (pH 7.5)</li>
		<li>250 mM 蔗糖</li>
		<li>10% (w/v) 甘油</li>
		<li>5 mM EDTA</li>
		<li>5 mM 抗坏血酸</li>
		<li>0.6% (w/v) PVP K-25 或 K-30</li>
		<li>5 mM DTT（现用现加）</li>
		<li>1 mM PMSF（现用现加）</li>
		<li>蛋白酶和磷酸酶抑制剂（现用现加）
		<ul>
			<li>50 mM NaF</li>
			<li>1 mM Na3VO4</li>
			<li>1 mM 苯甲脒</li>
			<li>0.3 μM 微囊藻毒素</li>
			<li>4 μM 亮抑蛋白酶肽</li>
			<li>蛋白酶抑制剂混合物</li>
		</ul>
		</li>
	</ul>
	</li>
	<li>缓冲液 R
	<ul>
		<li>5 mM 磷酸钾</li>
		<li>0.33 M 蔗糖</li>
		<li>3 mM KCl</li>
		<li>0.1 mM EDTA</li>
		<li>1 mM DTT（现用现加）</li>
	</ul>
	</li>
	<li>缓冲液 TNE
	<ul>
		<li>25 mM Tris-HCl, pH 7.5</li>
		<li>150 mM NaCl</li>
		<li>5 mM EDTA</li>
	</ul>
	</li>
	<li>双相系统（6 g 系统适用于最多 15 g 新鲜样品重量）配制方法 
	在 15 ml Falcon 管中混合以下成分并充分混匀：
	<ul>
		<li>20% (w/w) 葡聚糖 T500 — 2.6 g</li>
		<li>40% (w/w) 聚乙二醇（PEG 3350）— 1.3 g</li>
		<li>蔗糖 — 0.678 g</li>
		<li>0.2 M 磷酸钾，pH 7.8 — 0.15 ml</li>
		<li>2 M KCl — 0.014 ml</li>
		<li>加水至双相系统总质量为 6 g。</li>
	</ul>
	</li>
	<li>TNE 缓冲液中的蔗糖溶液
	<ul>
		<li>2.4 M、1.6 M、1.4 M、0.15 M</li>
	</ul>
	</li>
	<li>胰蛋白酶消化试剂
	<ul>
		<li>UTU：6 M 尿素，2 M 硫脲（用 10 mM Tris-HCl 调至 pH 8.0）</li>
		<li>还原缓冲液（水中含 1 μg/μl DTT；6.5 mM）</li>
		<li>烷基化缓冲液（水中含 5 μg/μl 碘乙酰胺；27 mM）</li>
		<li>LysC 内肽酶（0.5 μg/μl）</li>
		<li>胰蛋白酶，经修饰的测序级（0.4 μg/μl）</li>
	</ul>
	</li>
	<li>C18 肽段脱盐试剂
	<ul>
		<li>重悬溶液：2% 三氟乙酸（TFA），5% 乙腈溶于水中</li>
		<li>溶液 A：0.5% 乙酸</li>
		<li>溶液 B：80% 乙腈，0.5% 乙酸</li>
	</ul>
	</li>
	<li>磷酸化肽段富集试剂
	<ul>
		<li>溶液 A：0.1% TFA，5% 乙腈</li>
		<li>溶液 B：0.1% TFA，80% 乙腈</li>
		<li>TiO2 10 μm</li>
		<li>氨水（储存液 25% 溶液）</li>
		<li>哌啶（储存液 100%）</li>
	</ul>
	</li>
</ol>
实验方案
1. 代谢标记 拟南芥 细胞悬浮培养
<ol>
	<li>培养 拟南芥 源自叶片的Col-0细胞悬浮培养物 17 完整 14N-JPL培养基（18；参见“常用试剂与缓冲液”部分）以及一组培养物 15N-JPL 培养基置于无菌烧瓶中，在光照强度为 80 至 100 μmol/m²/s 的恒定光照条件下培养2s，23 °C，120 rpm 恒定振荡条件下。</li>
	<li>为了维持细胞培养，将40 ml七日龄的细胞培养物接种至含有400 ml新鲜JPL培养基的1 L锥形瓶中。</li>
	<li>细胞培养物的收获发生于 通过 通过带有不锈钢网的宽口玻璃漏斗进行真空抽滤。细胞会积聚在网板和漏斗中，可轻松从此处收集。建议在研磨前将细胞于 -80 °C 或液氮中冷冻。</li>
</ol>
注意：对于15N代谢标记的细胞培养，应使用K15NO3 作为唯一氮源，连续传代至少两周，经历至少两个传代周期19。在进行比较蛋白质组学实验时，需同时培养15N标记的细胞和未标记的细胞（后者在普通培养基中维持）。随后将生物学处理施加于标记或未标记的细胞培养物，另一组则作为对照（图1）。在蛋白质制备过程中，将两组培养物混合20。在设计实验方案时，我们建议采用双向标记设计4，即同一种处理分别施加于15N标记的细胞和未标记的细胞各一次，而对应的未标记或15N标记细胞则作为对照。此种情况下，所需的细胞培养物数量为双倍。
2. 质膜纯化
注意：除非另有说明，所有后续步骤均需在冷室中和/或在冰上进行。
<ol>
	<li>将约1升培养7天的细胞悬浮培养物在液氮中匀浆。材料可于-80 °C保存，直至后续使用。</li>
	<li>根据鲜重，将等量的标记与未标记的冷冻细胞培养物在烧杯中混合，并立即加入2倍体积的H缓冲液。若进行膜微区制备，建议标记和未标记细胞的鲜重均至少使用7 g。</li>
	<li>将烧杯置于摇床中，振荡至材料完全融化，溶液呈液态且无冰晶。</li>
	<li>将匀浆液通过一层Miracloth滤布过滤至50 ml离心管中。</li>
	<li>用缓冲液 H 平衡样品，然后在 10,000 x g 离心 8 分钟。</li>
	<li>将上清液加入预冷的超速离心管中（例如 用于 Beckman Coulter SW31Ti 转子，体积约为 32 ml</li>
	<li>用缓冲液H平衡样品，然后使用Beckman SW32Ti转子在4 °C下以100,000 × g离心30分钟，沉淀微粒体。</li>
	<li>离心后弃去上清液。</li>
</ol>
注意：上清液含有可溶性蛋白质。可保存少量该组分用于进一步的蛋白质沉淀，以及后续对可溶性蛋白质的分析。
<ol start="9">
	<li>将每个样品的膜沉淀物重悬于相应体积的缓冲液 R 中，并加样至 U1 双相系统的顶部（图 2）。若使用 6 g 双相系统，则准确加载 2 g 重悬的膜沉淀物。</li>
</ol>
注意：缓冲液 R 的最终体积取决于将要使用的双相体系的规模（使用 6 g 体系时约需 1.6 ml 缓冲液 R）。建议在重悬时使用较少的缓冲液，以便后续向双相体系中添加纯缓冲液以达到所需重量；而不建议在溶解时使用过多缓冲液，导致无法将全部样品加载到双相体系中。
<ol start="10">
	<li>在U2中加入与样品重悬时相同体积的纯缓冲液R。</li>
	<li>通过缓慢倒置U1和U2管30次（约每秒1次）进行混合。</li>
</ol>
注意：切勿剧烈振荡双相系统，否则可能导致超速离心步骤中两相无法有效分离。
<ol start="12">
	<li>在 4 °C 条件下以 1,500 × g 离心样品 10 分钟。</li>
	<li>离心后弃去上清液。</li>
	<li>将 U1 中的上层相转移至 U2，并在 4 °C 条件下以 1,500 × g 再次离心 10 分钟。</li>
	<li>将 U2 中的上层相转移至 SW41Ti 超速离心管中，加入五倍体积的缓冲液 R，充分混匀。</li>
</ol>
注意：最终的上层相在稀释五倍之前，可能需要分装到多个超速离心管中。
<ol start="16">
	<li>使用SW41Ti转子，在4 °C条件下以200,000 × g离心样品一小时。</li>
	<li>用少量TNE缓冲液重悬膜沉淀（通常使用200 μl缓冲液），用于分离去垢剂抗性膜。</li>
</ol>
注意：可保留少量该组分用于未分级血浆膜的分析。
注意：质膜组分在进行去垢剂抵抗膜和去垢剂可溶性组分的分离之前，可在 4 °C 下保存过夜。
3. 去垢剂抗性膜的制备
<ol>
	<li>通过 Bradford 法测定质膜组分的浓度。</li>
	<li>向质膜组分中加入 Triton X-100，去垢剂的终浓度应保持在 0.5–1% 之间，去垢剂与蛋白质的重量比应维持在 13–15 之间。</li>
	<li>在 4 °C 下以约 100 rpm 的速度振荡样品 30 分钟。</li>
	<li>向一份体积的处理后质膜中加入三份体积的 2.4 M 蔗糖溶液，使蔗糖的终浓度达到 1.8 M。</li>
	<li>在 SW41Ti 超速离心管中制备蔗糖梯度，将相应的蔗糖溶液叠加在 1.8 M 组分之上，如图 3所示。</li>
	<li>使用 Beckman SW41Ti 转子，在 4 °C 下以 250,000 × g 离心 18 小时。</li>
	<li>小心地将超速离心管从转子中取出，避免扰动低密度条带；该条带可能在 0.15 M/1.4 M 蔗糖界面处呈现为乳白色环状结构。有时可能无法观察到明显条带，但该组分仍含有去垢剂抗性蛋白组分。</li>
	<li>从梯度顶部收集 0.75 ml 体积的组分。第 2 和第 3 组分覆盖界面环上方约 1.5 ml 及下方 0.5 ml 的范围，代表去垢剂抗性膜组分，将其收集至 15 ml Falcon 管中。第 9 和第 10 组分含有去垢剂可溶性膜组分，也可收集用于比较。为进一步分析，可分别合并第 2 与第 3 组分，以及第 9 与第 10 组分。</li>
</ol>
4. 通过甲醇/氯仿法从去垢剂抵抗组分中提取蛋白质
注意：所有步骤均在室温下进行。
<ol>
	<li>向收集的组分中加入4倍体积的甲醇，并充分涡旋混匀。</li>
	<li>加入1倍体积的氯仿，充分涡旋混匀。</li>
	<li>加入3倍体积的水，充分涡旋混匀。</li>
	<li>使用台式离心机（e.g. Eppendorf 5417R）在2,000 × g下离心5分钟。</li>
	<li>移除位于中间相蛋白层上方的水相。</li>
	<li>加入3倍体积的甲醇，充分涡旋混匀。</li>
	<li>在4,000 × g下离心10分钟。</li>
	<li>弃去上清液并干燥沉淀。干燥后的沉淀可用于溶液内消化。</li>
</ol>
5. 溶液中胰蛋白酶消化
注意：本实验所有步骤均在室温下进行，以减少变性剂对氨基酸侧链产生不必要的衍生化反应。
<ol>
	<li>将样品溶解于少量 6 M 尿素、2 M 硫脲、pH 8（UTU）溶液中。使用与样品相容的最小体积（通常约为 40 μl）。</li>
	<li>将溶于 UTU 的样品在台式离心机（e.g. Eppendorf 5417R）中以 5,000 x g 离心 10 分钟，以沉淀不溶性物质。</li>
	<li>最终溶液的 pH 应接近 8.0，以保证胰蛋白酶消化的最佳效果。使用 pH 试纸检测。</li>
	<li>每 50 μg 样品蛋白加入 1 μl 还原缓冲液，并在室温下孵育 30 分钟。</li>
</ol>
注意：仅需对蛋白质含量进行粗略估计即可。当样品量有限时，与其浪费样品进行蛋白质测定，不如牺牲部分准确性。
<ol start="5">
	<li>每 50 μg 样品蛋白加入 1 μl 烷基化缓冲液，在室温避光条件下孵育 20 分钟。</li>
	<li>每 50 μg 样品蛋白加入 0.5 μl LysC，在室温下以 700 rpm 持续振荡孵育 3 小时。如有需要，消化反应也可过夜进行。然而，不建议在较高温度下延长孵育时间，因为在 pH 8 的水性条件下，长时间孵育可能增加肽段因吸附到塑料管材料而造成的损失。</li>
	<li>用 4 倍体积的 10 mM Tris-HCl（pH 8）稀释样品。</li>
</ol>
注意：此步骤绝对必要，可稀释尿素浓度，因为胰蛋白酶对高盐环境非常敏感。
<ol start="8">
	<li>每50 μg样品蛋白加入1 μl胰蛋白酶，于室温下以700 rpm持续振荡孵育过夜。</li>
	<li>将样品酸化至终浓度为0.2% TFA，使pH达到2（加入约1/10体积的2%三氟乙酸）。</li>
</ol>
注意：样品可保存在 -20 °C 条件下以备后续使用，但如果保存时间较短（一周内），最好将样品保存在 StageTips 上并置于 4 °C，或在 StageTips 脱盐后保存。
6. C18-StageTips 的制备
<ol>
	<li>将 Empore C18 膜置于干净平整的表面，例如一次性塑料培养皿。</li>
	<li>使用直径为 1.5 mm 的钝头皮下注射针头冲切出小圆片。膜片会粘附在针头内，可转移至移液枪头中。</li>
	<li>将膜片从针头中推出，并用一段适配针头内径的熔融石英或细管将其固定在移液枪头的锥形部位。</li>
</ol>
注意：StageTips 可在室温下干燥保存21。
7. 使用 C18-StageTips 进行肽段脱盐与浓缩
<ol>
	<li>条件化 C18- 将50 μl溶液B加入制备好的StageTip中，然后将Tip置于台式离心机中，以2,000 rpm离心2 min例如 Eppendorf 5417R)</li>
</ol>
注意：使用适配器将StageTips置于Eppendorf离心机中离心，液体将收集于2 ml反应管中。对于较大规模的制备，也可将StageTips放入含有96个200 μl吸头的吸头架中，并将液体收集至微孔板中。
注意：在台式离心机中，切勿使用超过 3,000 × g 的转速例如 Eppendorf 5417R) 因存在离心导致C脱落的风险18 从尖端取下圆盘。
<ol start="2">
	<li>使用100 μl溶液A对StageTip进行平衡。将Tip置于台式离心机中，以5,000 x g离心例如 Eppendorf 5417R)</li>
	<li>重复步骤 2。</li>
	<li>将样品小心地移液至装有圆盘的移液枪头中，然后将样品加载到圆盘上。</li>
</ol>
注意：一个圆盘可结合约 100 μg 的蛋白质。
<ol start="5">
	<li>将小柱在离心机中离心，直至样品全部体积通过 C18 芯片。</li>
	<li>用 100 μl 溶液 A 洗涤 StageTips 两次。每次洗涤后均需将小柱在离心机中离心。</li>
</ol>
注意：洗涤并加载后的 StageTips 可在 4 °C 下保存长达一周时间。
<ol start="7">
	<li>用 40 μl 溶液 B 洗脱样品。将洗脱液收集至新的 1.5 ml 离心管中。</li>
	<li>在真空浓缩仪中浓缩样品。在理想条件下，当剩余液体约为 1 至 2 μl 时，停止脱水过程。</li>
</ol>
注意：干燥的样品可在 -80 °C 下保存数年。
<ol start="9">
	<li>向样品中加入终体积为 9 μl 的重悬溶液，并转移至微孔板中用于质谱分析。</li>
</ol>
注意：所用重悬缓冲液的最终体积取决于实验人员的需求以及所用质谱仪的灵敏度。
8. 磷酸化肽段富集的替代方案
注意：进行磷酸化肽段富集时，第2步中的蛋白质提取必须在磷酸酶抑制剂存在下进行。
注意：后续步骤无需确定蛋白质的精确浓度。只需对蛋白质含量有大致估计，以避免样品不必要的损失即可
<ol>
	<li>制备 C8-StageTips（C18-StageTips 的制备方法与第6步相同）。</li>
	<li>将 1 mg 的 TiO2-beads 转移至已制备好的 C8-StageTips 顶部（每 100 μg 蛋白质使用 1 mg TiO2）。</li>
	<li>用 100 μl 溶液 C 平衡 TiO2-tips，在台式离心机（例如 Eppendorf 5417R）中以 2,000 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>将第 7.7 步中消化并脱盐后的 100 μg 肽段（应溶于 100 μl 溶液 B 中）与 100 μl 溶液 A 混合。</li>
	<li>将混合样品上样至已平衡的 TiO2 柱；在 1,000 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>收集穿流液，并将其再次上样至同一小柱（保留第二次穿流后的液体）。</li>
	<li>用 100 μl 溶液 A 洗涤小柱，在台式离心机（例如 Eppendorf 5417R）中以 2,000 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>用 50 μl 5% 氨水洗脱样品。</li>
	<li>用 50 μl 5% 哌啶洗脱样品（两次洗脱液可合并）。</li>
	<li>立即加入 50 μl 20% 磷酸对样品进行酸化，pH 应约为 2。</li>
</ol>
注意：保存二氧化钛（TiO2）尖端并回收粉末。可用溶液 B 清洗后再次使用一至两次。
<ol start="11">
	<li>再次使用 C18 小柱对酸化样品进行脱盐（参见步骤 8）。</li>
</ol>
9. 肽混合物的液相色谱-串联质谱分析
<ol>
	<li>用重悬缓冲液重悬脱盐后的磷酸化肽段。</li>
	<li>将重悬的样品上样至选定的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）系统，并在数据依赖模式下采集质谱数据，建议分辨率设置为60,000（半峰全宽）。</li>
</ol>
注意：为了获得最佳的碎裂效果，应采用中性丢失扫描22，或者如果有条件，可使用多级激活技术23。如果具备电子转移解离（ETD）功能，则可在不丢失磷酸基团的情况下实现肽骨架的碎裂24。
注意：需要从原始数据中提取峰列表，并提交至数据库进行鉴定和定量分析。本文介绍了使用 Mascot 和 MSQuant 的设置方法，适用于来自 LTQ、LTQ-Orbitrap 和 LTQ-FT 仪器（Thermo Scientific）的原始数据文件。
<ol start="3">
	<li>在 MSQuant 的“Helper”菜单中使用 DTAsupercharge 提取峰列表。使用默认设置。</li>
	<li>将生成的峰列表文件提交至 Mascot 搜索引擎。关键设置：前体离子质量容差为 10 ppm，MS/MS 质量容差为 0.5 Da。固定修饰：半胱氨酸的羧甲基化；可变修饰：甲硫氨酸的氧化、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化。定量方法：15N 代谢标记。</li>
	<li>将 Mascot 结果保存为网页文件。</li>
	<li>将 Mascot 结果文件和原始文件加载到 MSQuant 中。选择所有目标蛋白质并运行“自动定量”。程序将从原始文件中读取全扫描谱图，并对每种肽段的标记与未标记对应物进行峰面积积分。</li>
	<li>将定量结果导出至电子表格程序或制表符分隔的文本文件。随后可在 Excel 中或使用其他软件包（如 Statquant 25 或 cRacker 26）对数据进行进一步的统计分析。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。
作者 Witold Szymanski 是马克斯·普朗克分子植物生理研究所的员工。作者 Waltraud Schulze 是德国霍恩海姆大学的员工。

本文所述方案包含多个步骤，所有步骤对于获得纯净且具有代表性的植物质膜分馏（分为去垢剂抗性膜和去垢剂可溶性组分）均至关重要。因此，必须严格按照说明执行每一步骤。
使用非离子型去污剂处理质膜组分（步骤 3.2）对膜微区分离的质量影响最大。为了在不同制备样品之间获得可重复的结果，并能够比较同一实验中的不同样品，精确测定质膜中的蛋白质浓度至关重要，并且必须始终按照相同的蛋白质含量比例加入去污剂，同时确保最终浓度一致。实际操作中意味着，有时需要对蛋白质浓度较高的样品进行稀释，或使用不同浓度的 Triton X-100 储存液。
在生物化学研究中，近期研究人员倾向于采用无去垢剂的方法来分离膜微区28-30。这些方法通过极细针头进行剪切，以机械方式破坏质膜，类似于法国压榨细胞装置的原理。这些方法已成功应用于富含膜微区的哺乳动物细胞培养物，但尚未见报道将其应用于具有细胞壁的生物体（如酵母、植物细胞）。结合定量蛋白质组学与甾醇干扰试剂（如甲基-β-环糊精）的研究表明，从植物质膜制备的DRM组分确实含有作为膜微区标志物的蛋白...

1972年，Jonathan Singer 和 Garth Nicolson 提出了流动镶嵌模型，这是一种细胞膜的结构模型，取代了20世纪60年代初普遍接受的蛋白质-脂质-蛋白质三明治模型。Singer 和 Nicolson 提出，生物膜可被视为一种二维液体，其中所有的脂质和蛋白质分子均可自由且容易地扩散5。自那时以来，质膜的结构模型及其组成知识变得更加复杂。特别是在质膜中，可以观察到诸如蛋白质复合物以及基于脂质/固醇的结构无序微区等结构。在人工模型膜6,7中，固醇和鞘脂能够从其他脂质种类中发生侧向分离，形成具有不同物理特性的区域。细胞膜内的这种分离主要源于固醇与磷脂和鞘脂的高度饱和烃链之间的自缔合特性8。特别是，刚性的固醇环倾向于与更僵硬且更直的饱和脂质种类相互作用，这些相互作用迫使邻近的烃链采取更伸展的构象，从而增加膜的厚度和硬度。
富含固醇的膜微区的一个常见特征是，其在经非离子型去污剂（如 Triton X-100 或 Brij 35）处理后仍保持不溶性。这些组分曾被认为与膜微区完全相同，并根据其生化制备方法被称为去污剂抗性膜（detergent resistant membranes, DRM）2。然而，由于生化方法制备的 DRM 可能并不直接对应于活细胞内的任何特定膜区室，因此在 DRM 提取过程中使用非离子型去污剂的方法受到了一些质疑9。特别是，在此类制备过程中，去污剂与蛋白质的比例似乎至关重要，因为不同的去污剂种类以及不同用量均可能导致去污剂抗性膜组分的组成存在差异10。然而，已有证据表明，某些特定蛋白质会特异性地与细胞中富含固醇的膜结构域结合，并且这些蛋白质在去污剂抗性膜组分的生化制备物中显著富集11。在植物 DRM 组分中发现的、其在 DRM 中的存在依赖于固醇的核心蛋白主要包括 GPI 锚定蛋白，例如类束蛋白样阿拉伯半乳聚糖蛋白（fasciclin-like arabinogalactan proteins, FLAs）以及 SKU 蛋白家族成员。此外，还检测到一些信号转导相关蛋白，如类受体激酶和磷脂酶11。这些结果与大量关于哺乳动物膜微区的蛋白质组学研究结果一致12,13。同时，在植物中，越来越多的证据表明膜微区在应激响应过程中发挥重要作用14-16。
本文所述方案提供了一种分离质膜微区的可靠方法，特别是采用特定的蛋白质与去垢剂浓度比例，使我们能够描绘出应激诱导的富含固醇膜区室的改变4,11,14。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>除特别注明外，所有化学品均购自 Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氨水（25% 储备液）</td><td>WAKO</td><td>010-03166</td><td></td></tr><tr><td>TiO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 10 &amp;mu;m </td><td>GL-Science</td><td>5020-75010</td><td></td></tr><tr><td>Empore C18 萃取盘</td><td>Varian</td><td>12145004</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;聚乙二醇&lt;/em&gt;（PEG 3350）</td><td>Sigma</td><td>88276</td><td></td></tr><tr><td>葡聚糖 T500</td><td>Roth</td><td>9219.2</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物（PIC）</td><td>Sigma</td><td>P9599</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>NLM-765-PK</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Optima L-80 XP 超速离心机</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EASY-nLC II 纳升液相色谱仪</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ-Orbitrap 质谱仪</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5810R 离心机</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5417R 离心机</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>恒温混匀仪</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speed Vac RVC 2-25 真空浓缩仪</td><td>Christ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unimax 2010 摇床</td><td>Heidolph</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

代谢标记与膜组分分离用于比较蛋白质组学分析 拟南芥 悬浮细胞培养

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

质膜微区是基于脂质和甾醇环境物理特性形成的结构，在信号传导过程中具有特定作用。从植物细胞中提取富含甾醇的质膜微区用于蛋白质组学分析是一项具有挑战性的任务，主要由于制备步骤繁多，且容易受到其他细胞区室成分的污染。在植物细胞中，质膜仅占所有膜结构的约5-20%，因此获得高纯度的质膜组分十分困难。常用的一种方法是利用聚乙二醇和葡聚糖进行水相两相分离，该方法可获得纯度达95%的质膜囊泡1。质膜中富含甾醇的微区在碱性pH条件下经冷的非离子型去污剂处理后不溶解。这种去污剂不溶性膜组分可通过蔗糖梯度超速离心与主要的质膜组分分离2。随后，可通过甲醇/氯仿沉淀法从蔗糖梯度的低密度条带中提取蛋白质。提取的蛋白质经胰蛋白酶消化、脱盐后，最终通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行分析。我们针对富含甾醇微区的提取方案已优化，适用于拟南芥（Arabidopsis thaliana）细胞培养物中纯净的去污剂不溶性膜组分的制备。
我们采用Arabidopsis thaliana悬浮细胞培养物的全代谢标记法，以K15NO3作为唯一氮源，用于在特定生物学处理后进行定量比较蛋白质组学研究3。通过将标记与未标记的细胞培养物按等比例混合后共同进行蛋白质提取，可将样品制备步骤对最终定量结果的影响降至最低。此外，在提取过程中发生的材料损失会对对照组和处理组产生相同的影响，因此轻链与重链肽段的比例将保持恒定。在本方法中，标记或未标记的细胞培养物之一接受生物学处理，另一组则作为对照4。

利用本方案中采用代谢标记的Arabidopsis细胞培养物，可从植物组织中分离质膜（步骤2，图2和图4），并进一步在质膜中富集去垢剂抗性膜组分（步骤3，图3和图5）。随后，本方案可从这些去垢剂抗性膜组分中提取蛋白质（步骤4），并对蛋白质进行消化以进行比较蛋白质组学分析（步骤5）。最后，磷酸化肽段的可选富集步骤（步骤8）在研究细胞信号转导过程时尤为有意义。最终步骤为对来自标记与未标记细胞培养物的膜组分中蛋白质丰度比值进行定量数据分析（步骤9，图6）。
两相系统混合（步骤2）并随后离心后的典型结果是形成清晰的有色上相和绿色的下相（图2）。质膜囊泡主要分布于上层聚乙二醇（PEG）相，而来自绿色叶绿体及其他内部膜结构的膜囊泡则进入下层葡聚糖相。如果未能观察到颜色分离，则说明步骤2操作不当，导致质膜被大量内膜成分污染。通过蛋白质组学分析两相系统中质膜组分的小量等分试样以及下相中的蛋白质，可验证质膜蛋白的富集情况。下相含有细胞的内膜系统。例如...

本文介绍了一种基于未标记与标记去污剂混合物的植物质膜分馏的稳健方法，可将质膜分离为去污剂抗性膜和去污剂可溶性膜 体内 完全 15N标记 拟南芥 细胞培养。该方法适用于比较蛋白质组学研究，以理解信号传导过程。

质膜微区是基于脂质和固醇环境的物理特性形成的结构，在信号转导中具有特定功能……

以下实验的总体目标是分离不同的膜亚区室，并研究它们不同的蛋白质组成。通过在不同条件下对细胞进行稳定同位素标记，从而能够区分不同的处理组。在第二步的质谱分析中，将来自两种处理组的细胞材料混合，以确保后续步骤统一处理，减少样品间差异。接下来，通过蔗糖密度梯度离心将质膜亚区室进一步纯化并分离为无菌、富集及无菌耗竭的亚区室。基于定量质谱数据，离心结果呈现出在不同处理条件下各亚区室中蛋白质丰度的差异。该方案相较于现有方法（如蛋白质印迹法）的主要优势在于，我们能够对数千种蛋白质在亚区室中的分布进行定量记录，从而发现参与信号转导过程的新候选蛋白。该方法的可视化演示至关重要，因为双相系统中ME的纯化过程较难掌握，其原因在于该过程涉及多个步骤，且需要精确的控制和彻底的操作。该方法可通过发现新的作为膜过程调控因子的蛋白质候选物，帮助回答信号传导领域中的关键科学问题。首先，按照文本方案中所述方法培养标记与未标记的拟南芥（Arabidopsis）ANA细胞悬浮培养物。取约一升培养七天的细胞悬浮液，在液氮中将等量的标记与未标记冷冻细胞（按鲜重计）混匀，置于烧杯中，加入两倍体积的H缓冲液，立即将烧杯置于摇床上，振荡至材料完全融化且无冰晶残留。用一层镜布将匀浆过滤至250毫升离心管中，用H缓冲液平衡样品后，于10,000 ×g离心8分钟。离心后，将上清液转移至预冷的超速离心管中，每管体积约为32毫升。用缓冲液平衡样品后，于 100,000 G 和 4 摄氏度条件下离心 30 分钟，使微粒体沉淀。离心后去除上清液，该上清液含有可溶性蛋白质。可保留少量此组分用于进一步的蛋白质沉淀，以及可溶性蛋白质的后续分析。将各样品的膜沉淀物重悬于相应体积的缓冲液 R 中，具体操作如文本方案所述，然后加样至 U 1 两相系统的上层。若使用六克两相系统，则准确加载两克重悬的膜沉淀，并在U2中加入与样品重悬液所用体积相同的纯缓冲液R。通过每秒约一次的速度倒置30次，缓慢混合U1和U2试管，然后在1500 ×g及4°C条件下离心10分钟。离心后，移除U2中的上相。将U1中的上相转移至U2，再使用相同参数重复离心步骤。接着，将U2中的上相转移至超速离心管中，加入五倍体积的缓冲液R并充分混匀，然后在200,000 ×g及4°C条件下离心1小时。最后，进行再利用。将膜沉淀物重悬于少量 T 和 E 缓冲液中，用于分离去垢剂抗性膜。通过 Bradford 法测定质膜组分的浓度后，向质膜组分中加入 Triton X-100，使去垢剂与蛋白质的重量比在 13 至 15 之间，最终去垢剂浓度在 0.5% 至 1% 之间。将样品在约 100 RPM 条件下，4°C 摇动 30 分钟。然后向一份体积的处理后质膜中加入三份体积的 2.4 摩尔蔗糖溶液，使蔗糖的终浓度为 1.8 摩尔。在超速离心管中制备蔗糖梯度，将相应的蔗糖溶液加在 1.8 摩尔组分的上方。在 250,000 ×g 和 4 摄氏度条件下离心样品 18 小时。小心地从转子中取出超速离心管，避免扰动低密度条带，该条带可能在 0.15 摩尔与 1.4 摩尔蔗糖界面处呈现为乳白色环状结构。有时可能看不到任何物质，但去垢剂抗性蛋白组分仍然存在。从梯度顶部取出0.75毫升体积的组分，即第二和第三组分，涵盖界面环上方约1.5毫升体积的部分，以及界面环下方0.5毫升的部分。代表去污剂抗性膜组分。将这些组分收集至15毫升Falcon离心管中。第9和第10组分含有去污剂可溶性膜组分，也可同时收集用于比较。为开始从去污剂抵抗组分中提取蛋白质，向收集的组分中加入四倍体积的甲醇，并充分涡旋混匀。然后加入一倍体积的氯仿，再次充分涡旋混匀。最后加入三倍体积的水，充分涡旋后，在2000 G下离心五分钟。使用台式离心机，去除位于蛋白层与间相之间的水相。接着加入三倍体积的甲醇并涡旋振荡。在进行溶液内消化前，彻底去除上清液S，保留沉淀。开始溶液内消化，将样品溶解于少量六摩尔尿素、两摩尔盐酸胍、pH 8（简称UTU）中。使用与样品相容的最小体积。样品离心并按文本方案进行消化后，加入四倍体积的10毫摩尔Tris-HCl pH 8稀释样品。然后每50微克样品蛋白质加入1微升胰蛋白酶，于室温下以700转/分钟持续振荡孵育过夜，随后在4,000 ×g 下离心10分钟。最后，通过加入约十分之一体积的2%三氟乙酸，将样品酸化至三氟乙酸终浓度为0.2%，使pH达到2。制备C18固相萃取小柱时，将一个C18膜圆盘置于洁净的平整表面（如一次性塑料培养皿）上。使用直径为1.5毫米的钝头皮下注射针打取一个小圆片。该圆片会粘附在针内，并可转移至移液枪头中。将圆片从针头中推出，并使用一段熔融石英或适合针内径的管件将其固定在移液枪头的锥形部位，通过在制备好的C18固相萃取小柱上加入50 µL溶液B对其进行预处理。在台式离心机中，以2000 RPM的转速离心尖端两分钟。使用100微升溶液a在台式离心机中平衡Stage Tip。以5,000 ×g在台式离心机中离心尖端。重复平衡和离心步骤。将样品小心地移入装有C18小柱的移液枪头中，以完成上样。将枪头放入离心机中离心，直至样品全部通过C18小柱。用100微升溶液A将StageTip清洗两次。枪头离心后，用新的1.5毫升离心管收集洗脱液，并加入40微升溶液B，随后进行离心。再次在理想条件下，使用真空浓缩仪将样品浓缩。当剩余液体约为一到两微升时，停止脱水过程。最后一步，向样品中加入九微升的Resus重悬溶液，混匀后转移至微孔板，用于质谱分析。通过蛋白质组学分析两相系统中下相的小量等分试样、组分及蛋白质，可显示质膜蛋白的富集情况。下相含有细胞的内膜结构。例如，典型的已知质膜蛋白（如受体激酶蛋白）在质膜组分中丰度较高，而在含有内膜结构的下相组分中丰度较低。内质网的已知蛋白质在内膜组分中表现出高丰度，而在质膜组分中未被检测到。随后对去垢剂抗性膜组分进行富集，在理想情况下会形成一层乳白色低密度膜囊泡环状物。在离管底约五分之一高度处，可检测到remn蛋白在去垢剂抗性膜（DRM）组分中丰度最高，符合预期结果。相反，不存在于膜中的蛋白质，例如微结构域中的A b、C转运蛋白，在DRM组分中不会表现出丰度增加。此外，典型的污染物，如来自ATP酶F零复合物的线粒体蛋白以及来自60S核糖体的核糖体蛋白，在DRM组分中也不会表现出富集的丰度。尽管在质谱分析后仍可能检测到微量成分，但通过定量分析可明确区分血浆膜中蛋白质磷酸化状态的蛋白丰度比，以及标记与未标记细胞培养物的组分差异。在 MS 定量窗口中，典型结果应显示大多数已鉴定肽段的离子强度比为 1:1。离子强度比显著偏离 1:1 的肽段被认为在标记与未标记的细胞培养物之间存在差异调控，是与处理干预所影响蛋白相匹配的候选肽段。成功的代谢标记良好的质量控制指标是，如图所示，在纳米液相色谱分离中，标记与未标记的肽段形式应合并为单一峰形。一旦掌握，该技术从提取开始到样品上样至质谱仪，可在三天内完成。在完成该实验步骤后，还可进行其他方法，如Western印迹，以进一步探究特定目标蛋白的表达情况。因此，在观看本视频后，我们应能够充分理解如何混合稳定同位素标记的植物细胞培养物，如何利用双相系统进行质膜纯化，以及如何分离富含甾醇与缺乏甾醇的膜亚区室。

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生物学

代谢标记和膜分馏的比较蛋白质组学分析<em&gt;拟南芥</em&gt;悬浮细胞培养

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利用FACS辅助的细胞类型特异性表达谱分析研究植物组织和器官特异性的光敏色素反应 拟南芥

一种用于制备的方法 拟南芥 适用于荧光激活细胞分选（FACS）的叶片原生质体，可用于特定细胞群体的研究。该方法适用于任何 拟南芥...

细胞特异性分析 拟南芥 使用荧光激活细胞分选法分离叶片细胞

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基于15N代谢标记与定量质谱法的多蛋白复合物比较分析新方法

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植物原生质体mRNA相互作用组捕获

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一步亲和纯化并行分析蛋白质-蛋白质与蛋白质-代谢物复合物的2合1方法

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拟南芥叶绿体亚区室的制备及其用于免疫印迹或蛋白质组学分析的蛋白质定位研究

对多种生物分子进行全系统分析，对于深入了解生物过程的功能与作用机制至关重要。本文详细描述了一种高通量提取方法，可从同步培养的衣藻（Chlamydomonas）单一样本中同时提取脂质、代谢物、蛋白质和淀粉。...

一种用于深入分析绿色藻类Chlamydomonas reinhardtii同步培养物的多组学提取方法

高通量单细胞RNA测序（scRNA-seq）方法的可行性和有效性预示着植物研究进入单细胞时代。本文介绍了一种分离特定拟南芥（Arabidopsis...

植物细胞类型的分离与转录组分析

学习利用稳定同位素标记和蔗糖密度梯度离心技术分离拟南芥悬浮细胞质膜亚区室的方法。该方案通过定量质谱分析差异蛋白组成，帮助研究者发现植物信号传导过程中的新候选蛋白。

代谢标记与膜组分分离用于比较蛋白质组学分析拟南芥悬浮细胞培养

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