代谢标记和膜分馏的比较蛋白质组学分析拟南芥悬浮细胞培养

以下实验的总体目标是分离不同的膜亚区室并研究它们的差异蛋白质组成。这是通过在不同条件下对细胞进行稳定同位素标记来实现的，以实现处理的差异化。在质谱分析中，作为第二步，将来自两种处理的细胞材料混合，这确保了联合处理并减少样品间的差异。

接下来，质膜亚区室被纯化并通过蔗糖分离成无菌、富集和无菌的耗尽亚区室。根据定量质谱的数据，获得的梯度离心结果显示不同处理下子区室中的蛋白质丰度差异。与现有方法（如 Western blotting）相比，该方案的主要优点是我们可以定量记录数千种蛋白质的子区室分布，从而发现信号传导过程的新候选者。

这种方法的视觉演示至关重要，因为两相系统的 me 纯化很难学习。原因是它涉及很多步骤，精确控制和彻底处理非常重要。该方法可以通过发现新的候选蛋白质作为膜过程的调节因子来帮助回答信号领域中的关键问题 首先，如文本方案中所述，培养标记和未标记的拟南芥细胞悬浮培养物。

来自约一升 7 日龄细胞悬液培养物的匀浆细胞在液氮中根据新鲜重量在烧杯中混合相同量的标记和未标记的冷冻细胞培养物，并加入两倍体积的缓冲液 H，立即将烧杯放在摇床上摇动，直到材料融化且无冰。将样品与缓冲液 H 以 10， 000 Gs 离心 8 分钟平衡后，晶体通过一层镜面布将匀浆过滤到 250 mL离心管中。离心后，将 snat 装入体积约为 32 ml 的预冷超离心管中。

用缓冲液 h 平衡样品后，通过在 100， 000 Gs 和 4 摄氏度下离心 30 分钟来沉淀微粒体。离心后除去上清液，上清液中含有可溶性蛋白质。可以保存少量该级分用于进一步的蛋白质沉淀，随后对可溶性蛋白质的分析将每个样品的膜沉淀重新悬浮在相应量的缓冲液 R 中，如文本方案中所述，加载到 U one 两相系统的顶部。

如果使用 6 克两相系统，则准确加载 2 克重悬膜沉淀，将与用于样本复苏悬浮液相同体积的纯缓冲液 R 加载到 U2 上。以大约每秒一次倒置的速度将 U one 和 U2 管倒置 30 次，缓慢混合，在 1500 Gs 和 4 摄氏度下离心样品 10 分钟。离心后，从 U 2 中去除上层相。在使用相同的参数重复离心之前，将上层相从 U 1 转移到 U2 上。接下来，将 U2 的上层相移至超速离心管中，用 5 倍体积的缓冲液 R 稀释，并充分混合，在 200， 000 Gs 和 4 摄氏度下将样品离心 1 小时。

最后，重用。将膜沉淀悬浮在少量 T 和 E 缓冲液中，以分离耐洗涤剂的膜。通过 Bradford 测定检查质膜组分的浓度后，以去污剂与蛋白质的比例将 Triton X 100 添加到质膜组分中，重量重量比在 13 到 15 之间，最终去污剂浓度在 0.5 到 1% 之间以大约 100 RPM 和 4 摄氏度摇动样品 30 分钟。

然后将 3 体积的 2.4 摩尔蔗糖加入 1 体积的处理质膜中，以获得 1.8 摩尔的最终浓度的蔗糖。通过将相应的蔗糖溶液加载到 1.8 摩尔馏分的顶部，在超速离心管中制备蔗糖梯度将样品在 250， 000 GS 和 4 摄氏度下离心 18 小时。小心地从转子上取下超速离心管，以避免破坏低密度条带，在 0.15 摩尔和 1.4 摩尔蔗糖的界面处可能显示为乳白色环。

有时什么也看不到，但耐洗涤剂的蛋白质组分仍然存在。从梯度顶部去除 0.75 mL 体积的馏分 2 和 3，它们覆盖了相间环上方约 1.5 mL 的体积。和间期环以下 0.5 毫升。

表示耐洗涤剂的膜分数。将这些馏分收集到 15 毫升 Falcon 管中。馏分 9 和 10 包含洗涤剂可溶性膜组分，也可以收集进行比较。

要开始从耐洗涤剂级分中提取蛋白质，向收集的级分中加入四体积的甲醇，并彻底涡旋。然后加入一体积的氯仿，然后再次彻底涡旋。最后，加入 3 体积的水并涡旋，以 2000 G 的离心力将样品离心 5 次。

使用台式离心机，去除界面中蛋白质层上方的水相。接下来，加入 3 体积的甲醇并涡旋。在吸取沉淀之前彻底去除 S 上清液 为溶出消化做准备。

通过将样品溶解在小体积的 6 摩尔尿素、2 摩尔甲状腺 pH 8 缩写 UTU 中来开始溶出消化。使用与样品兼容的尽可能小的体积。离心样品并按照文本方案中的说明进行消化后，用四体积的 10 毫摩尔 tris HCL PH 8 稀释样品。

然后，每 50 μg 样品蛋白加入 1 μL 胰蛋白酶，在室温下以 700 RPM 的速度持续振荡孵育过夜，以 4， 000 GS 离心样品 10 分钟。最后，通过添加大约 1/10 体积的 2% 三氟乙酸，将样品酸化至 0.2% TFA 终浓度，达到 pH 2。要制造 C 18 载物台吸头，请将 C 18 研磨盘放在平坦干净的表面上，例如一次性塑料培养皿。

使用直径为 1.5 毫米的钝头皮下注射针打出一个小圆盘。圆盘卡在针头中，可以转移到移液器吸头中。将圆盘从针头中推出，并使用一块熔融石英或针头内部的管接头将其固定在移液器吸头的锥形中，通过将 50 微升溶液 B 放在准备好的载物台吸头上来调节 C 18 阶段吸头。

在离心机中以 2000 RPM 的速度旋转吸头两分钟 在台式离心机中，使用 100 微升溶液平衡载物台吸头 a. 在台式离心机中以 5， 000 GS 的速度旋转吸头。重复平衡并旋转。

小心地将样品移液到圆盘内为移液器吸头中，将样品加载到圆盘上。在离心机中旋转吸头，直到整个样品体积都通过 C 18 圆盘。用 100 微升溶液 A 清洗载物台尖端两次，在离心机中旋转尖端后，将 EIT 收集在新鲜的 1.5 毫升反应管中，加入 40 微升溶液 B 并离心。

同样，在理想条件下将样品浓缩在 speed vac 中。当只剩下一两微升液体时停止脱水过程。最后一步，向样品中加入最终体积为 9 微升的 Resus 悬浮溶液，并将其转移到微量滴定板进行质谱分析。

质膜蛋白的富集可以通过对两相系统下期的质膜小 eloqua、组分和蛋白质进行蛋白质组学分析来显示。下层阶段包含细胞的内膜。例如，通常已知的质膜蛋白（如受体激酶蛋白）在包含内膜的质膜部分具有高丰度，而在包含内膜的低相部分则显示低丰度。

反过来，内质网的已知蛋白质在内膜部分显示高丰度，并且在质膜部分未观察到。在理想情况下，随后富集的耐洗涤剂膜组分将导致形成低密度膜囊泡的乳白色环。正如预期的那样，在大约五分之一的管高处，在耐洗涤剂膜或 DRM 组分中发现了最高丰度的残余蛋白。

相反，不存在于膜、微结构域（如 A、b、C 转运蛋白）的 DRM 组分中不显示丰度增加。此外，典型的污染物，例如来自 A TPAs F zero 复合物的线粒体蛋白和来自 60 s 核糖体的核糖体蛋白，在 DRM 组分中没有显示出丰富的丰度。尽管在质谱分析后仍可鉴定出微量，但可以定量区分质膜中蛋白质磷酸化状态的蛋白质丰度比、标记和未标记的细胞培养物的组分。

MS 定量窗口的典型结果应显示大多数鉴定肽的离子强度比为 1：1。那些离子强度比显著偏离一比一的肽被认为在标记和未标记的细胞培养物之间存在差异调节，并且是与受所应用处理影响的蛋白质匹配的候选肽。成功代谢标记的良好质量控制是将标记和未标记的肽版本结合为纳米 HPLC 分离中的单个峰，如下所示。

一旦掌握，该技术可以在从提取开始到样品加载到质谱仪的三天内完成。按照此程序，可以执行其他方法，如 Western Belt，以回答有关特定靶蛋白请求的其他问题。因此，在观看此视频后，我们应该对如何混合稳定同位素标记的植物细胞培养物、如何在两相系统上进行质膜纯化以及如何分离无菌富集和无菌耗尽膜子区室有一个很好的了解。