Name: 肿瘤靶向性生长和基因表达的动力学测量 S。鼠伤寒沙门氏菌细菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 了解利用小鼠异种移植模型和生物发光成像技术实时监测肿瘤内减毒鼠伤寒沙门氏菌的基因表达动态与生长动力学的方法。该技术为评估细菌癌症治疗策略提供定量数据支持。

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感谢 H. Fleming 对稿件的审阅与编辑。本工作由 Misrock 博士后奖学金（TD）和 NDSEG 研究生奖学金（AP）资助。SNB 是霍华德·休斯医学研究所（HHMI）研究员。

1. 细胞准备
<ol>
 <li>使用标准细胞培养技术传代细胞系。本实验中使用了 OVCAR-8 细胞（NCI DCTD 肿瘤储存库，Frederick，MD）。将细胞培养至目标融合度为 80 - 100%。</li>
 <li>用 5 ml 胰蛋白酶孵育细胞 5 分钟，然后加入 5 ml RPMI 培养基 + FBS 以灭活胰蛋白酶。</li>
 <li>在血细胞计数板上收集并计数细胞。将细胞重悬于无酚红的 DMEM 培养基中，目标浓度为 5 × 107 个细胞/ml，或每瓶约 200 μl。</li>
 <li>加入 15% 低生长因子 Matrigel（BD Biosciences），并将细胞悬液置于冰上直至植入。</li>
</ol>
2. 肿瘤移植
<ol>
 <li>使用 3% 异氟烷麻醉 4 周龄雌性 Ncr/Nu 小鼠，等待约 5 分钟以确保进入深度麻醉状态。麻醉期间在眼睛上涂抹兽用眼膏，防止角膜干燥。</li>
 <li>将细胞悬液（每瘤 100 μl）吸入 1 ml 注射器中，并安装 27½ 号针头。</li>
 <li>在两侧后外侧 flank 区域分别进行注射：用镊子轻轻提起皮肤形成帐篷状，将细胞注入皮下基底部。注意不要刺入过深，以免引起出血。注射完毕后用镊子轻轻拔出注射器，避免液体飞溅。</li>
 <li>每日监测肿瘤生长情况，持续 10 至 20 天，直至肿瘤直径达到 2 至 4 mm。</li>
</ol>
3. 细菌制备
<ol>
 <li>从-80°C冻存菌种或冷藏平板中接种3 ml含氨苄青霉素的LB培养基，开始过夜培养细菌。本实验中使用的是S. typhimurium菌株ELH430（SL1344 PhoPQ- aroA-）。</li>
 <li>次日早晨，将过夜培养物按1:100比例稀释至过滤后的LB培养基中，培养至OD600为0.4–0.6。</li>
 <li>离心收集菌体，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，最后重悬于PBS中，调整OD600至0.1（约1 × 107 个细胞/ml）。</li>
</ol>
4. 细菌注射
<ol>
 <li>麻醉动物，并将其侧卧放置，尾巴朝向你的惯用手。使用兽医用眼膏涂抹眼睛，以防止麻醉期间眼睛干涩。</li>
 <li>使用温水或加热灯扩张尾静脉。</li>
 <li>用1 ml注射器吸取细菌悬液（每只小鼠100 μl），并将针头尖端弯曲至略小于90度。</li>
 <li>将注射器针头对准尾静脉，以较浅的角度刺入（应无阻力感），然后注入细菌。观察到血液被推动的迹象表明注射成功。</li>
</ol>
5. 小鼠成像
<ol>
 <li>在诱导室中对动物进行麻醉，然后将每只小鼠放置在成像平台上。麻醉期间使用兽用眼膏保护眼睛，防止角膜干燥。保持精确的体位固定，以确保不同时间点之间定量结果的可比性。</li>
 <li>使用 IVIS Spectrum 成像系统（Caliper Life Sciences）对动物进行成像。若同时成像多只动物，需在动物之间放置遮光屏障，以避免交叉照明。应首先对动物进行腹侧成像，以确认细菌的定位情况。</li>
 <li>在整个实验过程中（36 小时），每 2 小时使用 IVIS 对动物进行一次背侧成像。针对选定的感兴趣区域（ROI）生成时间序列曲线。</li>
</ol>
6. 细菌生物分布的定量分析
<ol>
 <li>使用 CO2 处死动物，并将其仰卧放置在吸水垫上。</li>
 <li>转动动物以暴露两侧腹股沟皮下肿瘤。剪开周围皮肤组织，分离并取出肿瘤。用镊子夹住肿瘤，使用反向剪刀动作去除皮肤。当大部分皮肤已被分离后，用镊子将肿瘤完全取出。</li>
 <li>将器官放入预先称重的微量离心管中。由于这些管子的质量可能差异显著，为获得定量结果，预先称重至关重要。</li>
</ol>
7. 定量分析细菌的生物分布
<ol>
 <li>在每个时间点，切除肿瘤并称重。</li>
 <li>加入 500 μl PBS + 15% 甘油，使用组织捣碎器（Tissue-Tearor，BioSpec）进行匀浆。每处理一个样品之间，用乙醇冲洗匀浆器 3 次。</li>
 <li>进行系列稀释，并接种平板以进行细菌菌落计数。若需在单个平板上接种多个稀释度，可使用预先分隔的平板。</li>
</ol>

<ol><li>Hohmann, E. L., Oletta, C. A., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+phoP%2FphoQ-deleted%2C+aroA-deleted+live+oral+Salmonella+typhi+vaccine+strain+in+human+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a phoP/phoQ-deleted, aroA-deleted live oral Salmonella typhi vaccine strain in human volunteers.</a> Vaccine. 14 (1), 19-24 (1996).</li>
<li>Leschner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Invasion+of+Salmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+Is+Accompanied+by+Strong+Hemorrhage+Promoted+by+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Tumor Invasion of Salmonella enterica Serovar Typhimurium Is Accompanied by Strong Hemorrhage Promoted by TNF-alpha.</a> Plos One. 4 (8), (2009).</li>
<li>Min, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+bioluminescence+imaging+of+tumor-targeting+bacteria+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitative bioluminescence imaging of tumor-targeting bacteria in living animals.</a> Nat. Protoc. 3 (4), 629-636 (2008).</li>
<li>Min, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+real-time+imaging+of+tumors+and+metastases+using+tumor-targeting+light-emitting+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Noninvasive real-time imaging of tumors and metastases using tumor-targeting light-emitting Escherichia coli.</a> Mol. Imaging Biol. 10 (1), 54-61 (2008).</li>
<li>Choy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+noninvasive+fluorescent+and+bioluminescent+small+animal+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging.</a> Biotechniques. 35 (5), 1022-1033 (2003).</li>
<li>Pawelek, J. M., Low, K. B., Bermudes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-targeted+Salmonella+as+a+novel+anticancer+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector.</a> Cancer Research. 57 (20), 4537-4544 (1997).</li>
<li>Fu, X., Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ovarian+carcinoma+metastatic+models+constructed+in+nude+mice+by+orthotopic+transplantation+of+histologically-intact+patient+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens.</a> Anticancer Res. 13 (2), 283-286 (1993).</li>
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<li>Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+perfect+%28bacterial%29+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 10 (11), 785-794 (2010).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tumor+gene+by+shRNA-expressing+Salmonella-mediated+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting tumor gene by shRNA-expressing Salmonella-mediated RNAi.</a> Gene Ther. 18 (1), 95-105 (2011).</li>
<li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-seeking+Salmonella+amino+acid+auxotrophs%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs.</a> Curr Opin Biotechnol. 22 (6), 917-923 (2011).</li>
<li>Nguyen, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+Salmonella+typhimurium+as+an+imageable+therapeutic+probe+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered Salmonella typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer.</a> Cancer Research. 70 (1), 18-23 (2010).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+therapy+with+a+Salmonella+typhimurium+leucine-arginine+auxotroph+cures+orthotopic+human+breast+tumors+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Targeted therapy with a Salmonella typhimurium leucine-arginine auxotroph cures orthotopic human breast tumors in nude mice.</a> Cancer Research. 66 (15), 7647-7652 (2006).</li>
<li>Danino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synchronized+quorum+of+genetic+clocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synchronized quorum of genetic clocks.</a> Nature. 463 (7279), 326-330 (2010).</li>
<li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmentally+controlled+invasion+of+cancer+cells+by+engineered+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria.</a> J. Mol. Biol. 355 (4), 619-627 (2006).</li>
<li>Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+gene+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineered gene circuits.</a> Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).</li>
<li>Prindle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensing+array+of+radically+coupled+genetic+%27biopixels%27%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A sensing array of radically coupled genetic 'biopixels'.</a> Nature. 481 (7379), 39-44 (2012).</li>
<li>Xu, D. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+delivery+of+siRNAs%3A+a+new+approach+to+solid+tumor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial delivery of siRNAs: a new approach to solid tumor therapy.</a> Methods Mol. Biol. 487, 161-187 (2009).</li>
<li>Zheng, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+amplified+protein+expression+therapy%3A+Salmonella+as+a+tumor-selective+protein+delivery+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol.+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor amplified protein expression therapy: Salmonella as a tumor-selective protein delivery vector.</a> Oncol. Res. 12 (3), 127-1235 (2000).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+balanced-lethal+host-vector+system+based+on+glmS%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A novel balanced-lethal host-vector system based on glmS.</a> Plos One. 8 (3), e60511(2013).</li>
<li>Prindle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Circuits+in+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic Circuits in Salmonella typhimurium.</a> ACS Synthetic Biology. , (2012).</li>
<li>Danino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+expression+dynamics+of+tumor-targeted+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo gene expression dynamics of tumor-targeted bacteria.</a> ACS Synthetic Biology. , (2012).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial-temporal+imaging+of+bacterial+infection+and+antibiotic+response+in+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Spatial-temporal imaging of bacterial infection and antibiotic response in intact animals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17), 9814-9818 (2001).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

通过该实验流程，我们能够获得定植于肿瘤中的细菌在生长及基因表达动态方面的时程数据。这些测量通常可常规开展 体外 在批量培养或微流控装置中，它们的实施要困难得多 体内. 
有多种方法可对这些实验方案进行修改。尽管我们使用了OVCAR-8细胞系来构建小鼠模型，但其他多种细胞系也可等效使用。例如，可使用经荧光素酶标记的细胞系，以实现肿瘤与细菌荧光素酶信号通道的三维共定位。此外，尽管我们采用了双侧后 flank 注射模型，但也可使用不同数量和位置的注射位点，以构建适用于研究不同现象的模型。例如，若肿瘤大小是一个重要变量，可制备细胞的系列稀释液并同时注射至不同位点，从而生成大小不一的肿瘤。最后，尽管我们使用了 S. typhimurium ELH430菌株，其他菌株 S. typhimurium 或其他细菌，例如 C. novyi，E. coli，V. cholorae，B. longum 可与这些方法等效使用，但注射用的细菌计数可能需要调整。
本...

合成生物学在过去十年中迅速发展，现已具备解决能源与健康领域重要问题的潜力。然而，由于安全性的担忧以及缺乏临床应用设计标准，其在临床领域的拓展受到限制。 体内 基因回路。要加速具有高影响力医学应用的发展，需要采用能够直接与医疗基础设施对接的方法、在受控实验室环境之外仍能发挥作用的基因回路，以及安全且经临床认可的微生物宿主。 
多种菌株因能够优先在肿瘤中生长而被研究用于癌症治疗。这些菌株包括 C. novyi，E. coli，V. cholorae，B. longum，以及 S. typhimurium3-8. S. typhimurium 在多项人体临床试验中表现出安全性和耐受性，因此引起了特别关注9-12这些细菌最初被发现可通过刺激宿主免疫系统以及消耗癌细胞代谢所需的营养物质来产生抗肿瘤效应。随后通过基因改造使其能够生产治疗性载荷。尽管这些研究代表了利用细菌进行肿瘤治疗的重要进展，但大多数现有研究依赖于高水平表达，通常导致高剂量递送、脱靶效应以及宿主抗性的产生。13-16. 
如今，合成生物学可能通过利用计算机设计的基因回路来实现可编程的货物生产，这些基因回路能够执行高级的感知与递送功能17-20。这些回路可被设计为递送系统，能够感知肿瘤特异性刺激，并根据需要自我调控货物的生成。然而，迄今为止，在活体（in vivo）条件下研究这些回路功能仍具有挑战性。
由于质粒是合成回路的常用框架，本文介绍了一种用于表征基于质粒的基因表达动态的方法 体内 使用小鼠模型。这些方法利用延时生物发光成像和生物分布的定量测量。结合使用，这些方法为研究基于质粒的网络提供了框架 体内 用于临床应用。

<table><tbody><tr><td>1 ml 注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>3/10 cc 胰岛素注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide 针头</td><td>BD Biosciences</td><td>301629</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基（1X），液体，含 L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166-5G</td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂肉汤</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2897</td><td></td></tr><tr><td>LB 肉汤（Luria-Bertani 肉汤）</td><td>BD Biosciences</td><td>244610</td><td></td></tr></tbody></table>

测量靶向肿瘤的 s. typhimurium 细菌的生长与基因表达动态

Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

这些实验的目的是获取减毒伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）在肿瘤内生长过程中菌落生长和基因表达动态的定量时间序列数据。
通过皮下注射人卵巢癌细胞系OVCAR-8（NCI DCTD肿瘤库，美国马里兰州弗雷德里克），我们在小鼠体内建立了移植瘤模型。
我们将减毒的鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）菌株（ELH430:SL1344 phoPQ- 1）转化，导入组成型表达的荧光素酶（luxCDABE）质粒，以实现可视化2。这些菌株可特异性定植于肿瘤组织，同时对小鼠基本保持无致病性1。
肿瘤生长至可测量大小后，通过尾静脉以不同剂量静脉注射细菌。体内成像系统（IVIS）用于在60小时时间内实时监测肿瘤局部的细菌基因表达。在每个时间点，切除肿瘤组织，将其匀浆后接种培养，以定量细菌菌落数量，并与基因表达数据进行关联分析。
综合这些数据可定量评估细菌在肿瘤内生长及基因表达的 in vivo 动态。

使用本实验方案，我们能够获得有关 体内 肿瘤靶向细菌的生长与基因表达动态。整体工作流程总结如下 图1. 
在第一阶段，我们注射细菌（绿色），并使用IVIS对动物进行成像，以生物发光（蓝色）作为报告信号来检测基因表达。
然后，在第二阶段，我们切除肿瘤，将其匀浆并接种于培养基进行菌落计数，以确定肿瘤内生长的细菌数量。
使用IVIS可视化细菌菌株产生的生物发光（图2）。信号强度随注射剂量增加而增强，最低定植剂量约为5 × 105（图2A）。在所有情况下，减毒细菌仅能特异性定植肿瘤或无法在小鼠体内生长。通过辐射通量单位对信号进行定量，以校正曝光时间的影响，通常当数值达到10^6或更高时，表明已实现定植。
对于特定感染，信号在24-48小时内随时间逐渐增强（图2B</st...

这些实验的目的是获取减毒伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）在肿瘤内生长时的定量时间序列数据，以研究其菌落生长和基因表达动态。本视频涵盖了肿瘤细胞的制备与移植、细菌的制备与注射、活体动物生物发光成像、肿瘤组织切除以及细菌菌落计数。

测量靶向肿瘤的 S. Typhimurium 细菌的生长与基因表达动态

这些实验的目的是获取减毒伤寒沙门氏菌生长和基因表达动态的定量时间序列数据……

本实验的总体目标是研究在肿瘤内生长的 S tyrian 细菌的体内基因表达动态。首先，在小鼠异种移植癌症模型中，通过尾静脉静脉注射细菌。细菌定植于肿瘤并呈指数级增殖，同时利用生物发光报告系统对基因表达进行可视化观察。使用IVIS光谱成像系统进行整体动物生物发光成像。在24至48小时内采集一系列IVIS图像。该图像序列与通过匀浆并接种肿瘤获得的菌落计数结果进行关联分析。这些数据共同使我们能够实时定量测量肿瘤靶向细菌在体内的基因表达和群体动态，使用标准细胞培养技术进行细胞制备传代和细胞系操作。在本实验中，我们采用 Ocar8 细胞，将细胞培养至 80% 至 100% 汇合度后收获，并在血细胞计数仪上计数细胞，随后重悬于不含酚红的 DMEM 培养基中，目标浓度为每毫升 5 × 10⁷ 个细胞，即每瓶约 200 微升。加入 15% 低生长因子 Matrigel，并将细胞悬液置于冰上直至进行肿瘤移植。使用3%异氟烷对四周龄雌性裸鼠进行麻醉。将细胞悬液以每瘤100微升的体积装入1毫升注射器中，并为每侧后 flank 区的两个对称注射部位分别安装27.5号针头。用镊子轻轻提起皮肤形成帐篷状，于基底部注射细胞悬液。注意避免穿刺过深导致出血。使用镊子轻轻取出注射器，避免飞溅。每天监测肿瘤生长情况，持续10至20天，直至肿瘤直径达到2至4毫米。细菌准备：从–80°C保存的菌种或冷藏平板中接种细菌，在3 mL含抗生素的LB培养基中开始过夜培养。本实验中我们使用了沙门氏菌（S. typhimurium）菌株ELH430。将过夜培养物按1:100比例稀释至过滤后的LB培养基中，并培养至OD600达到0.4至0.6。离心并用磷酸盐缓冲液洗涤三次，然后重悬至最终OD 600为0.1，或约每毫升1×10⁷个细胞。进行细菌注射时，先麻醉动物，并将其固定，使尾巴朝向你的惯用手。找到尾静脉，并使用温水或加热灯使其扩张。用1毫升注射器每只小鼠接种100微升细菌，并将针头弯曲至略小于90度。将注射器针尖对准尾静脉，以较浅的深度刺入，无阻力感，然后注入细菌。观察到血液流动位移表明注射成功。等待大约12至18小时后再进行成像，以使定植发生。将小鼠置于诱导室中麻醉，然后将每只小鼠放置在成像平台上。保持精确的位置以确保不同时间点之间的定量结果，使用 Ibis Spectrum 成像系统对动物进行成像。如果对多只动物进行成像，应在它们之间放置光屏障，以防止交叉照明。进行动物解剖时，用镊子夹住肿瘤，使用反向剪刀动作去除皮肤。当大部分皮肤已完全分离后，使用镊子将肿瘤完全移除。将器官放入预先称重的微量离心管中。由于这些离心管的质量可能存在显著差异，因此为获得定量结果，预先称重至关重要。定量分析每个时间点的细菌生物分布：切除并称量肿瘤，加入500 µL PBS和15%甘油，使用组织破碎仪进行匀浆，随后进行系列稀释并涂布平板以进行细菌菌落计数，获得代表性结果。通过本方案，我们能够获得靶向肿瘤细菌在体内的生长情况及基因表达动态数据。整体工作流程在此总结。在第一阶段，我们注射了细菌，并使用ivus对动物进行成像，通过生物发光信号来检测基因表达水平。随后在第二阶段，我们切除肿瘤组织，将其匀浆后进行平板培养，通过菌落计数来确定在肿瘤内生长的细菌数量。由细菌菌株产生的生物发光信号通过ivus成像可视化，其信号强度随注射剂量增加而增强，在所有情况下，最低定植剂量约为5×10⁵，这受到细菌衰减特性的影响。细菌会特异性定植于肿瘤，或在小鼠体内无法显著生长。信号通过辐射单位进行量化，以校正曝光时间；通常高于10的6次方或更大的值表明在特定感染条件下发生了定植。信号随时间延长而增强，持续24至48小时。此处信号峰值出现时间约为注射后36小时，但具体时间可能因所用菌株和质粒的不同而有所差异。为确保后续实验获得定量结果，每次成像时务必以完全相同的方式放置小鼠。通过定量细菌在不同器官中的生物分布，可测量细菌随时间在各器官内的增殖情况。通过切除并匀浆肿瘤组织，进行系列稀释后平板培养，以定量活菌及肿瘤内的细菌数量。其他器官也可采用类似方法进行定量。本实验中选用脾脏，因为经稀释因子反向计算后，肿瘤与脾脏的细菌载量比值是评估细菌特异性的常用指标。这些计数使我们能够测量随时间变化的特定细菌种群数量。在左侧，我们可以看到在整个实验过程中，细菌数量持续稳定增长。其倍增时间为一到三小时，显著低于分批培养实验中的倍增时间。这可能是由于肿瘤微环境中营养条件较差所致。在右侧，我们对肿瘤与脾脏的比值进行了量化，观察到该比值在实验过程中逐渐升高。这些实验的目的是利用IVUS成像和菌落计数技术，对细菌及肿瘤环境的生长动态和基因表达进行定量监测。我们已证明，可在肿瘤微环境中对细菌种群进行体内表征。未来，可设计并构建更复杂的基因表达程序，以在细菌中建立精密的治疗递送系统。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

肿瘤靶向性生长和基因表达的动力学测量<em&gt; S。鼠伤寒沙门氏菌</em&gt;细菌

来源：Liu, P. C., et al. 一种低成本、自动化莫比恒化器的设计与使用：用于抗生素药物筛选条件下细菌的适应性进化。 J. Vis. Exp. (2016)本视频展示了如何使用微流控芯片在甲氧苄啶抗生素胁迫条件下，对野生型和耐甲氧苄啶的大肠杆菌（E.

在微流控芯片上培养细菌以研究抗生素耐药性

我们描述了一种用于追踪由胞内细菌引发的内膜系统破裂的方法 志贺氏菌 福氏 和 结核分枝杆菌...

由胞内病原体引起的液泡破裂的单细胞测量

本视频文章介绍了一种已成功建立的高通量流程，可用于感染并分析大量斑马鱼胚胎，从而为利用完整动物脊椎模型进行化合物筛选和药物发现提供了一种新的强大工具。...

高通量研究体系的建立与优化 表皮葡萄球菌 和 Mycobacterium marinum 感染作为药物发现的模型

本文介绍了用于假定噬菌体基因功能表征的表型组学方法。技术包括一种可监测宿主合成代谢的改良检测方法——多表型检测平板（MAPs），以及能够测量对分解代谢影响的既定代谢组学方法。...

噬菌体表型组学：通过生理学方法表征新型病毒蛋白

利用简单的微生物系统可以在实验室中研究分选（空间隔离）在进化情景中的作用，这类系统能够对空间分布进行可控调节。通过改变起始细胞密度，可使用荧光标记的细菌菌株在枯草芽孢杆菌（Bacillus...

监测表面定植微生物群体中的空间分离现象

对细菌生长进行定量评估对于从系统层面理解微生物生理学至关重要。本文介绍了一种实验操作方案和分析方法，可实现对细菌生长的精确、高通量分析，这是系统生物学研究中的一个关键课题。...

精确、高通量的细菌生长分析

本文介绍了一种在细胞水平上分析动物组织中细菌基因表达的方法。该方法为研究细菌群体在感染过程中响应组织环境而产生的表型多样性提供了资源。...

一种基于荧光的方法用于研究感染组织中的细菌基因调控

在微量滴定板中培养放射性标记的细菌，可实现高通量取样，从而对核苷酸池含量（包括(p)ppGpp）进行多次技术重复和生物学重复检测。可监测由生理应激源引发的生长转换及其从应激中恢复过程中的效应。...

使用微量滴定板放射性标记法结合薄层色谱进行体内多重复测定大肠杆菌（Escherichia coli）的(p)ppGpp水平

通过高通量延时成像技术，对固定化的酵母细胞在微菌落生长过程中的生长表型进行精确测量。同时，可监测其胁迫耐受性、蛋白质表达及蛋白质定位，从而生成整合型数据集，用于研究环境差异、遗传差异以及同基因型细胞间基因表达异质性如何调控细胞生长。...

高通量活体成像微菌落以测量生长与基因表达的异质性

抗生素持留现象描述了敏感同基因群体中的少数亚群在短时间内耐受高剂量杀菌性抗生素的能力。本实验方案结合多种方法，在将大肠杆菌（Escherichia...

Escherichia coli中抗生素持留现象的群体与单细胞分析

噬菌体（phages）是一类感染细菌的病毒，是肠道微生物组的重要组成部分。尽管这些共生微生物影响着细菌的适应性和种群动态，但其对肠道稳态及疾病的影响机制仍知之甚少。本实验方案采用小鼠模型研究分离的T4噬菌体，该方法可适用于其他噬菌体-细菌组合的研究。...

T4 噬菌体与小鼠肠道内E. coli的相互作用：研究宿主-噬菌体体内动态关系的典型模型

了解利用小鼠异种移植模型和生物发光成像技术实时监测肿瘤内减毒鼠伤寒沙门氏菌的基因表达动态与生长动力学的方法。该技术为评估细菌癌症治疗策略提供定量数据支持。

测量靶向肿瘤的 S. Typhimurium 细菌的生长与基因表达动态

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