测量靶向肿瘤的 S. Typhimurium 细菌的生长与基因表达动态

本实验的总体目标是研究在肿瘤内生长的 S tyrian 细菌的体内基因表达动态。首先，在小鼠异种移植癌症模型中，通过尾静脉静脉注射细菌。细菌定植于肿瘤并在其中呈指数级增殖，同时利用生物发光报告系统对基因表达进行可视化观察。

使用IVIS光谱成像系统进行整体动物生物发光成像。在24至48小时内采集一系列IVIS图像。该图像序列与通过匀浆并接种肿瘤所获得的菌落计数结果进行关联分析。

这些数据共同使我们能够实时定量测量靶向肿瘤的细菌在体内的基因表达和群体动态，实验中采用标准细胞培养技术进行细胞制备传代和细胞系操作。本实验中，我们使用 Ocar8 细胞，将细胞培养至 80% 至 100% 的目标汇合度后收获细胞，并在血细胞计数仪上计数，随后将细胞重悬于不含酚红的 DMEM 培养基中，目标浓度为每毫升 5 × 10⁷ 个细胞，即每瓶约 200 微升。加入 15% 低生长因子 Matrigel，并将细胞悬液置于冰上直至进行肿瘤移植。

使用3%异氟烷麻醉4周龄雌性裸鼠。将细胞以每瘤100微升的体积装入1毫升注射器中，并为两侧后 flank 区域的两个注射部位各安装一个27.5号针头。用镊子轻轻提起皮肤形成帐篷状，于基部注射细胞。

注意避免穿刺过深导致出血。使用镊子轻轻取出注射器，避免飞溅。每天监测肿瘤生长情况，持续10至20天，直至肿瘤直径达到2至4毫米。

细菌准备，从-80℃冰箱保存菌种或冷藏平板中接种细菌，在3毫升LB液体培养基（含抗生素）中过夜培养。本实验中使用的是沙门氏菌ELH430菌株。将过夜培养物按1:100比例稀释至过滤后的LB培养基中，继续培养至OD600达到0.4至0.6。

离心并用磷酸盐缓冲液洗涤三次，然后重悬至最终 OD 600 为 0.1 或约 1 × 10⁷ 个细胞/毫升。进行细菌注射时，先将动物麻醉，并使其尾部朝向你的优势手方向放置。找到尾静脉，并用温水或加热灯使其扩张。

将细菌以每只小鼠100 µL的体积加载到1 mL注射器中，并将芯片弯曲至略小于90度。将注射器针尖对准尾静脉，以较浅的深度穿刺，无阻力感，然后注入细菌。观察到血液流动位移表明注射成功。

等待大约12至18小时后再进行成像，以使定植发生。将小鼠放入诱导室中进行麻醉，然后将每只小鼠放置在成像平台上。

保持精确的位置以确保不同时间点之间的定量结果，使用 Ibis Spectrum 成像系统对动物进行成像。如果对多只动物进行成像，应在它们之间放置光屏障以防止交叉照明。进行动物解剖时，用镊子夹住肿瘤组织，使用反向剪刀动作去除皮肤。

当大部分皮肤已完全分离后，使用镊子将肿瘤完全移除。将器官放入预先称重的微量离心管中。由于这些离心管的质量可能存在显著差异，因此为获得定量结果，预先称重至关重要。

定量分析每个时间点的细菌生物分布：切除并称量肿瘤组织，加入500微升含15%甘油的磷酸盐缓冲液（PBS），使用组织破碎仪进行匀浆，随后进行系列稀释并涂布平板以进行细菌菌落计数，获得代表性结果。通过本方案，我们能够获取靶向肿瘤细菌在体内的生长情况及基因表达动态数据。整体工作流程在此总结。

在第一阶段，我们注射了细菌，并使用ivus对动物进行成像，通过生物发光信号来检测基因表达。随后在第二阶段，我们切除肿瘤组织，将其匀浆后进行平板培养，通过菌落计数来确定在肿瘤内生长的细菌数量。由细菌菌株产生的生物发光信号通过ivus成像可视化，其信号强度随注射剂量增加而增强，在所有情况下，由于衰减效应，最低定植剂量约为5×10⁵。

细菌会特异性定植于肿瘤，或在小鼠体内无法显著生长。信号通过辐射单位进行量化，以校正曝光时间；通常高于10的6次方或更大的值表明在特定感染下发生了定植。信号随时间延长而增强，持续24至48小时。此处信号峰值出现时间约为注射后36小时，但具体时间可能因所用菌株和质粒的不同而有所差异。为确保后续实验获得定量结果，每次成像时务必以完全相同的方式放置小鼠。

通过定量细菌在不同器官中的生物分布，可测量细菌随时间的生长情况。通过切除肿瘤并将其匀浆，进行连续稀释后平板培养，以定量活菌及肿瘤内的细菌数量。其他器官也可采用类似方法进行定量。此处我们使用脾脏，因为在反向计算稀释因子后，肿瘤与脾脏的细菌载量比值是评估细菌特异性的常用指标。

这些计数使我们能够测量随时间变化的特定细菌种群数量。在左侧，我们可以看到在整个实验过程中，细菌数量持续稳定增长。其倍增时间为一到三小时，明显低于分批培养实验中的倍增时间。

这可能是由于肿瘤微环境中营养条件较差所致。在右侧，我们对肿瘤与脾脏的比值进行了量化，观察到该比值在实验过程中逐渐升高。这些实验的目的是利用IVUS成像和菌落计数技术，对细菌及肿瘤环境的生长动态和基因表达进行定量监测。

我们已经证明，可以在肿瘤微环境中对细菌种群进行体内表征。未来，可设计并构建更复杂的基因表达程序，以在细菌中建立精密的治疗递送系统。