评估精子竞争能力差异的方法 果蝇

以下实验的总体目标是检测具有不同基因型的黑腹果蝇（drosophila melanogaster）雄性在精子竞争能力上的差异。该检测通过追踪可观察的遗传标记来实现，这些标记可用于确定与两只不同基因型雄蝇交配的雌蝇所产后代的父本来源。在实验中，雌蝇首先与一只参照雄蝇交配，随后再与一只实验雄蝇交配。通过观察后代的 eye coloration（眼色），可推断出由实验雄蝇所生育的后代所占的比例。

实验结果通过实验组雄性精子与参照组雄性精子的相对表现，间接比较了它们的竞争能力。这些方法有助于回答生物学领域中遗传学与进化方面的关键问题，例如评估某一遗传因素对精子竞争能力（SPR）的影响。演示本实验流程的将是本实验室的 S 及本科生。以下方案阐述了一种名为 sic 的遗传因素的分析方法，该基因推测编码一种参与精子运动能力的蛋白质。

首先准备15到20个小瓶，每瓶中加入少量培养基。在培养基表面轻轻撒上几粒干燥的活性酵母颗粒。以促进后续操作的进行。

始终使用新鲜的营养培养基，例如玉米粉酵母培养基。然后向每个小瓶中加入8至10只雌蝇，但不要超过此数量，并加入5只雄蝇。可通过观察若干形态学差异进行性别鉴定。

将小瓶储存于 25 摄氏度条件下，并至少每隔三到五天将成虫转移至新的小瓶中。为获得最佳效果，应每隔一天转移一次成虫。保留含有卵的小瓶，以收集后代。

所需小瓶的数量取决于研究中实验雄性类型的数量以及统计功效所需的个体估计数量。在将亲本转移出小瓶后四到五天，通过向培养基中插入一张多次折叠的纸张来增加小瓶内可供化蛹的表面积。当观察到蛹体颜色变深时，检查小瓶中的蛹。

这些果蝇将在杂交设置后的11至12天内，于24小时内羽化。从此类试管中开始收集处女雌蝇和未经交配的雄蝇。每天清晨首先处理掉前一晚已羽化的果蝇。

然后在当天每隔四到六小时进行一至两次，从试剂瓶中收集果蝇，通过向瓶内通入二氧化碳使果蝇麻醉。接着轻敲瓶子将果蝇震落，于体视显微镜下进行性别鉴定。根据性别和表型将所需果蝇分别放入不同的试剂瓶中，并正确标记试剂瓶。

切勿将小瓶装载超过10个，以防潜在风险。为利用果蝇闭合时间的规律，需将处女雌蝇置于12小时光照与12小时黑暗的循环条件下进行培养。闭合的高峰期出现在主观黎明后1至2小时，以及关灯前2小时。

该实验有两种版本，分别称为进攻性实验和防御性实验。本节介绍如何在第一天早晨进行进攻性实验，并使用吸管器完成第一次交配的设置。

吸管由一段连接在移液器吸头上的管子组成，吸头内设有屏障，可将吸入的果蝇保留在吸头内。吸头的内径已加宽。用于果蝇实验时，准备含有十只四至五日龄未交配雌蝇的培养管。

每天设置两到三个小瓶，连续五天，每个小瓶中放入10只未经交配的参照品系雄蝇。每个小瓶中的果蝇允许交配两小时，随后弃去参照品系雄蝇，用吸管将每只雌蝇转移至新的小瓶中，并将每个小瓶标记为V1，让雌蝇在小瓶中停留两天。在第三天，将每只雌蝇与另一基因型的未经交配雄蝇进行第二次交配。

在主观黄昏前两小时，使用吸管将雌性转移到一个新的试管中，与同基因型的三日龄、五日龄或六日龄实验雄性果蝇共同培养。用雄性基因型标记试管，并将新试管标记为 V2。次日早晨即为第四天。

在果蝇主观黎明前两小时，使用吸虫器丢弃雄蝇。第六天，将每只雌蝇转移至另一标注为V3的新试管中。第十天，在第十七天丢弃雌蝇。

检查来自子代的 V 一试管，确定该雌蝇与参考雄蝇交配时是否为处女蝇，以及其是否与参考雄蝇成功交配。同一天，使用二氧化碳麻醉击倒果蝇，检查 V 二试管中的子代。

按眼睛颜色和性别进行分类。然后记录第一只和第二只雄性父本产生的后代数量。在本实验中，只有雌性后代能够明确地归属于参照雄性或实验雄性父本。

在其他实验中，也可利用不同的遗传标记来确定雄性子代的父本。检查后的子代可弃去，但需暂时保留V2代的两个小瓶。在第20天进行检查，再次记录V2代两个小瓶中子代的父本情况，并首次检查V3代小瓶中已羽化的子代。

然后在三天后的第23天，检查V3中出现的子代。同样，应将记录的子代数量按每只雌虫分别整理，以便于直观观察，并便于使用统计软件对V2和V3的计数进行高效分析。为计算参照雄虫和实验雄虫产生的子代总数，需计算每只雌虫的P2值，即实验雄虫产生的子代数占该雌虫与实验雄虫和参照雄虫交配后所产生的全部子代数的比例。

某些雌性个体必须从分析中排除。首先，没有后代或后代极少的个体；其次，在实验过程中死亡的个体；第三，仅被两个雄性中其中一个成功授精的雌性个体。注意观察 P two 值之间是否存在统计学差异。

根据 P 值分布的偏度以及方差与平均比例之间的依赖关系，选择在实验雄性类型中使用参数检验或非参数检验。数据通常不服从正态分布。可对原始 P 值在进行学生 t 检验或方差分析（ANOVA）前先进行反正弦转换（也称为角转换），或直接使用非参数检验方法，例如在黑腹果蝇（drosophila melanogaster）的 WIL Coxin 两次进攻实验中所采用的方法。

实验中的雄性个体分为两组，一组具有功能性的ESIC簇，另一组则不具有。总体而言，58%至83%的雌性个体提供了有效信息。与具有完整ESIC簇的雄性相比，缺乏功能性ESIC簇的雄性表现出显著更低的P2评分。

这表明SIC簇能够增强精子的竞争能力。观看本视频后，您应充分掌握如何开展双重交配实验，从而能够检测突变型雄性与对照雄性之间在精子竞争能力上的差异。