Name: 提高蛋白质结晶的成功率随机Microseed矩阵筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-31T10:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: 学习随机微晶种基质筛选技术以提高蛋白质结晶成功率。该方法通过制备晶种储备液并建立筛选体系，可显著增加晶体数量、改善衍射质量，为结构生物学研究提供可靠的晶体来源。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作部分由英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC，项目编号：BB/1006478/1）资助。PRR 获得了英国皇家学会大学研究奖学金。

1. 战略考量
<ol>
	<li>用于微种子实验的晶种选择将根据实验目的的不同而有所变化。在项目初期，获得多个结晶初筛结果有助于为晶体优化提供不同的起始点。而重复微种子法（rMMS）极大地减少了晶体优化的需求，因为高质量晶体更有可能在相图的亚稳区中生长。 即 在系统经扰动或成核后能够恢复平衡的区域内，我们建议一旦获得首批晶体（或更准确地说，一旦首批晶体停止生长），即常规使用rMMS。</li>
	<li>对于第一轮微种子矩阵筛选（rMMS），应尽可能使用大量结晶材料制备种子储备液。如果仅有一个含有晶体的孔，或晶体较小，则可设置多个原始阳性条件的重复（不加种子）以增加晶体供应量。然而，若获得了多个不同的阳性条件，则可从多个条件中收集种子晶体并混合使用。</li>
	<li>为避免相分离，应在高盐条件下生长的晶体与在高聚乙二醇（PEG）条件下生长的晶体分别收获。若混合来自多个孔的晶体，应选择产生盐晶体可能性较低的储液溶液用于制备晶种悬浮液。例如，应避免使用高浓度的磷酸盐、硫酸盐、钙和镁。</li>
	<li>在项目后期，寻找具有不同晶胞的晶体可能非常重要，以改善衍射质量、避免孪晶，并获得适合结合配体的晶体。在此阶段，仅选择最合适的晶体（例如 应选用衍射质量最佳的晶体来制备晶种储备液。有时需要进行多轮微晶接种，每轮仅选用“最佳”晶体来制备下一轮的晶种储备液。若条件允许，应使用PEG 3000等“中性”沉淀剂悬浮晶种晶体，以促进形成新的晶体接触，并有助于在高盐溶液中不稳定的复合物结晶。 12.</li>
	<li>经典的微晶接种实验通常在确定了有前景的结晶条件之后以及后续优化过程中非常有用，该方法仅使用单一结晶条件。为了获得每滴中理想数量的晶体，通常需要对种子母液进行稀释。一种“组合式”微晶接种实验（即将一系列梯度稀释的种子母液加入同一结晶条件中）是快速确定种子母液最佳稀释度的有效方法。该方法的具体操作如下所述。</li>
</ol>
2. 种子库的制备
<ol>
	<li>使用本生灯火焰将玻璃巴斯德移液管制成圆头玻璃探针。
	<ol>
		<li>将移液管在中部附近加热至变软，然后迅速从火焰中取出，通过拉伸两端将其拉开。目标是将玻璃拉至直径小于0.25 mm。</li>
		<li>在玻璃直径约为0.25 mm处将其折断，并将断端短暂浸入火焰中。重复此操作，直至末端形成直径约0.75 mm的玻璃半球形探针。该探针适用于研碎结晶物质，因其尺寸适宜敲击0.01–1.0 mm尺度的固体样品，且不会损伤结晶板亚孔或盖玻片的塑料表面。较大的探针（约1.0 mm）可能更有效地压碎微小晶体，因为晶体可被夹在玻璃与塑料之间而受到挤压。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将含有种子珠的1.5 ml 微离心管置于冰上。</li>
	<li>使用双目显微镜或晶体成像系统检查已建立的结晶板，从板中选择一个或多个合适的孔，用于收获晶体材料以制备晶种储备液。可选用的材料包括细针状晶体、球晶、微晶以及形态不规则或发育不良的晶体。应在晶体停止生长后尽快制备晶种储备液，因为较陈旧的晶体材料更可能发生部分交联，从而降低其在晶种实验中的适用性。若对拟收获的晶体物质是否为盐或蛋白质存在疑问，可在打开前使用紫外荧光显微镜或成像系统观察该孔，或对晶体材料进行 原位 在托盘中进行X射线衍射分析。采用前一种方法时，蛋白质晶体在紫外照射下会发出荧光，而盐晶体则呈无色。</li>
	<li>打开选定的结晶板孔。对于96孔坐滴板，使用手术刀片沿选定孔周围的上层塑料密封膜切割。对于24孔悬滴板，使用镊子取下盖玻片，将盖玻片翻转后放置在稳定且洁净的表面上。吸取50 μl储液并转移至含有晶种微珠的微量离心管中，确保该管在整个操作过程中始终置于冰上。</li>
	<li>使用第2.1节中准备的玻璃探针，在显微镜下将位于96孔板小孔或24孔板盖玻片上的晶体液滴彻底压碎。较小的晶体可能需要数分钟才能完全粉碎。此步骤可使实验者确认晶体易于压碎，表明其未发生交联，同时确认其并非盐结晶。盐结晶在压碎时会产生特有的“咔哒”声，并可被听见和感知。若晶体坚韧难以压碎，建议尝试获取并使用更新鲜的样品。</li>
	<li>从Seed Bead管中取出5 μl储液，转移至含有待收获晶体材料的相应子孔（坐滴实验）或盖玻片（悬滴实验）中。用移液器将液体上下吹打5–6次，尽可能充分重悬子孔或盖玻片中的内容物。将悬液重新移回Seed Bead管中，并重复此步骤两次，确保尽可能多地收获晶体材料。</li>
	<li>涡旋种子珠2分钟，每30秒停止一次，将管置于冰上冷却。</li>
	<li>制备稀释系列，将种子储备液用储液溶液逐级稀释4至10倍。通常，使用未稀释的种子储备液会产生过多晶体，因此需使用稀释后的种子储备液以控制每个孔中的晶体数量。在第一轮重复微种子悬滴法（rMMS）中，重要的是不要稀释种子储备液，因为种子浓度越高，获得结晶的几率越大。</li>
	<li>若不立即使用，将种子储备液及其稀释液转移至 -20 °C 或 -80 °C 冰箱中保存。为避免反复冻融可能降低种子储备液的效价，应将该样品分装成小体积 aliquot 后储存。 即 10–20 μl。冻存后，种子储备可长期保存，直至需要时使用。</li>
</ol>
3. 结晶板的制备
<ol>
	<li>根据结晶设施的可用情况以及实验人员的偏好，可采用24孔板进行悬滴蒸气扩散法，或采用96孔板进行坐滴蒸气扩散法来开展rMMS结晶筛选。rMMS结晶板的设置可通过手工操作、使用液体处理机器人分配仪，或两者结合的方式完成。</li>
	<li>手工设置的典型rMMS实验包含1.0 μl蛋白溶液、1.0 μl结晶条件溶液和0.5 μl晶种储备液。使用结晶机器人设置的典型实验则包含0.3 μl蛋白溶液、0.2 μl结晶条件溶液和0.1 μl晶种储备液。</li>
	<li>在24孔悬滴板中进行rMMS筛选时，首先使用手动移液器将96孔结晶筛选试剂板（以10 ml单管格式）中的每种条件溶液各300 μl转移至4块预涂油脂的24孔结晶板的相应孔中。
	<ol>
		<li>将每种300 μl储液池中的1 μl结晶条件溶液转移至对应的塑料盖玻片表面，该盖玻片的正反两面保护背条均已去除。</li>
		<li>在每1 μl结晶条件溶液中加入1 μl蛋白溶液，随后加入0.5 μl晶种储备液。将盖玻片翻转，使液滴朝下，并置于对应的孔上方。</li>
		<li>向下按压盖玻片，压缩密封油脂，形成牢固密封。待全部96个液滴设置完成后，应将板转移至培养箱或恒温房间中储存，通常温度范围为4–18 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在96孔坐滴板中进行rMMS筛选时，首先将深孔块格式的96孔结晶筛选板中的每种条件溶液各20–50 μl转移至结晶板的相应孔中。此转移步骤可使用结晶机器人或八通道移液器手工完成。
	<ol>
		<li>通过手工或机器人按照步骤3.1中所述体积将储液池溶液、蛋白溶液和晶种储备液加入各液滴中。某些 commercially available 结晶机器人不采用接触式分配，使用此类系统进行晶种储备液转移可能导致分配针头或相关管路堵塞。加样顺序可变：部分机器人可同时分配所有溶液；若无法实现，则应先加蛋白溶液，再加储液池溶液，最后加晶种储备液。</li>
		<li>若无接触式分配机器人，可使用配备钝头针头的微量玻璃注射器进行晶种转移。先将针头穿过储液池溶液进行冲洗，然后将晶种储备液逐滴加入各液滴中。</li>
		<li>使用透明密封膜密封板，随后转移至培养箱或恒温房间中储存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 结晶板的检查
<ol>
	<li>使用双目显微镜或晶体成像系统观察所有结晶实验。前者通常比后者能为用户提供更好的视野深度和放大倍数控制，但耗时更长。</li>
	<li>依次检查每个子孔/盖玻片，并记录任何晶体形成的迹象。实验建立后，应每24小时检查一次，持续5天，之后每7天检查一次，最长持续4周。</li>
	<li>通常需要进行多轮重复的微种子筛选（rMMS）才能获得适合衍射的高质量晶体。</li>
</ol>

<ol><li>Bergfors, T. Protein Crystallization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBergfors%2C+T+%22IUL+Biotechnology+Series%22">IUL Biotechnology Series</a>. , 2nd, (2009).</li>
<li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRupp%2C+B+%22Biomolecular+Crystallography%3A+Priciples%2C+Practice+and+Application+to+Structural+Biology%22">Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology</a>. , Garland Science. (2010).</li>
<li>Babnigg, G., Joachimiak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+protein+crystallization+propensity+from+protein+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Funct.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Predicting protein crystallization propensity from protein sequence.</a> J. Struct. Funct. Genomics. 11 (1), 71-80 (2010).</li>
<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeds+to+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeds to crystals.</a> J. Struct. Biol. 142 (1), 66-76 (2003).</li>
<li>Ireton, G. C., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microseed+matrix+screening+to+improve+crystals+of+yeast+cytosine+deaminase%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60, 601-605 (2004).</li>
<li>Zhu, D. Y., Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+protein+crystal+growth+through+dynamic+seeding%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Optimizing protein crystal growth through dynamic seeding.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 61 (Pt 6), 772-775 (2005).</li>
<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+optimization+methods+for+nonautomated+crystallization+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Screening and optimization methods for nonautomated crystallization laboratories.</a> Methods Mol. Biol. 363, 131-151 (2007).</li>
<li>Xu, L., Butcher, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+receptor-binding+protein+P2+of+bacteriophage+PRD1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary X-ray analysis of receptor-binding protein P2 of bacteriophage PRD1.</a> J. Struct. Biol. 131 (2), 159-1563 (2000).</li>
<li>Rangarajan, E. S., Izard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+diffraction+of+full-length+human+selenomethionyl+metavinculin+crystals+by+streak-seeding%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+Sect.+F.+Struct.+Biol.+Cryst.+Commun%22%5BJournal%5D)">Improving the diffraction of full-length human selenomethionyl metavinculin crystals by streak-seeding.</a> Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 66 (Pt 12), 1617-1620 (2010).</li>
<li>Kadirvelraj, R., Harris, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stepwise+optimization+of+crystals+of+rhamnogalacturonan+lyase+from+Aspergillus+aculeatus%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D.+Biol+.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A stepwise optimization of crystals of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).</li>
<li>D'Arcy, A., Villard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+microseed+matrix-screening+method+for+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).</li>
<li>Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+Microseeding%3A+A+Theoretical+and+Practical+Exploration+of+Seed+Stability+and+Seeding+Techniques+for+Successful+Protein+Crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Crystal+Growth+%26+Design%22%5BJournal%5D)">Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization.</a> Crystal Growth & Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).</li>
<li>Obmolova, G., Malia, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoting+crystallization+of+antibody-antigen+complexes+via+microseed+matrix+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).</li>
<li>Villasenor, A. G., Wong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+matrix+microseeding%3A+improving+protein+crystal+growth+with+minimal+chemical+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).</li>
<li>Strynadka, N. C., James, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysozyme%3A+a+model+enzyme+in+protein+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22EXS%22%5BJournal%5D)">Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography.</a> EXS. 75, 185-222 (1996).</li>
<li>Diaz, A., Loewen, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirty+years+of+heme+catalases+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Thirty years of heme catalases structural biology.</a> Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

本文介绍了一种用于rMMS蛋白质结晶筛选的通用方法。我们通过两种测试蛋白质的实验表明，使用该方法可显著提高结晶成功率。利用同步辐射对采用rMMS与非rMMS方法获得的部分晶体进行衍射分析，结果显示两种方法生长的晶体在衍射质量上差异不大，尽管此前有研究者报告称，在rMMS实验中更有可能获得高质量晶体11, 13。溶菌酶（HEWL）和BLC的结果可能具有非典型性，因为这两种蛋白质异常易于结晶。我们还说明了优化rMMS实验中晶种储备液浓度的重要性，并展示了如何通过稀释调节该浓度，以确保产生适量可用于衍射的优质晶体。	
	rMMS 是一种简单、高通量且高度可扩展的方法，可用于补充传统的筛选方法。实验可通过手动或机器人操作，在96孔板或24孔板中进行，支持悬滴或坐滴形式。rMMS 的主要局限在于，最初需要获得目标蛋白（或同源蛋白）的某种晶体材料，以制备晶种储备液。但需要注意的是，并不需要高质量的晶体材料；事实上，作者已成功利用微晶和无定形沉淀物制备了晶种储备液。rMMS 筛选的应用不仅限于天然蛋白晶体的生长。例如，rMMS 非常适用于培养硒代甲硫氨酸或硒代半胱氨酸取代突...

从Perutz、Kendrew及其同事最初将其应用于血红蛋白和肌红蛋白结构的测定，到如今结构基因组学联盟所采用的现代高通量自动化流程，大分子X射线晶体学为我们前所未有地揭示了蛋白质世界的结构细节。该技术仍是适用范围最广的实验方法，能够直接在原子或近原子分辨率（即 1–3 Å范围内）可视化蛋白质结构。应用X射线衍射技术测定蛋白质结构的前提是该蛋白质必须首先形成晶体，而这一环节至今仍是衍射方法解析结构过程中最主要的速率限制步骤1, 2。尽管我们对蛋白质结晶过程的理解已取得显著进展，并且在结晶筛选试剂盒、结晶板及相关技术的质量与可及性方面也有了重大改进，但目前仍无法可靠预测结晶成功的可能性3。可采用生物化学与生物物理方法评估目标蛋白质是否具备有利于晶体成核与生长的特性，即 蛋白质是否正确折叠、均一、单分散等；然而，这些信息尚无法提供对结晶倾向性的明确预测。	
	长期以来，接种法被认为是一种有效的方法，可用于提高现有晶体或结晶材料的数量、尺寸和质量4-7。该方法基于如下前提：支持晶体成核的条件可能并不适合后续晶体生长，反之亦然。通过将已成核的物质从一种条件转移至另一种条件，可尝试有效解耦这两个过程，从而探索新的、尚未开发的结晶空间，进而提高筛选实验的整体成功率。已有文献记录的成熟方法包括：（i）宏观接种（macroseeding），即将单个晶体整体从一种条件转移至另一种条件8；（ii）划线接种（streak seeding），即通过施加定向压力（例如使用猫须接触已有晶体表面）获取成核物质，随后将猫须划过新的结晶液滴以实现转移9；以及（iii）“经典”微接种（microseeding），即将研碎的晶体（或结晶物质）收集后产生的晶体“种子”转移至与产生种子时相似的结晶条件中10。值得注意的是，这三种方法均耗时较长且难以规模化，尤其是与现代液体处理结晶机器人所能实现的效率相比。这些因素在一定程度上导致人们认为接种法仅应在其他方法未能获得成果时才予以考虑。	
	随机矩阵微晶接种（rMMS）是一种较新的方法学创新，结合了传统微晶接种与高通量筛选及可扩展性的优势11-13。该方法依赖于由已成核的晶体材料制备的种子储备液，可将此种子液分装至标准96条件结晶筛选板中的每个子孔或盖玻片上。该方法适用于坐滴或悬滴蒸气扩散实验，可在24孔或96孔板格式中通过手工或液体处理机器人建立。实验已证明，rMMS可显著提高结晶成功率，并产生衍射质量更高、数量更多的晶体11, 13, 14，是晶体学家在持续追求结晶成功过程中所采用的一种创新技术手段。本文描述了一种通用的rMMS操作方法，并提供了展示该技术有效性的示例数据。

<table><tbody><tr><td>MRC 96 孔结晶板</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD11-00-100</td><td>不适用于紫外光，用于机器人建立的筛选</td></tr><tr><td>ClearView 密封膜</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD6-01S</td><td></td></tr><tr><td>鸡卵清溶菌酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>纯度约 95%</td></tr><tr><td>牛肝过氧化氢酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td>&amp;gt;95% 纯度</td></tr><tr><td>木聚糖酶</td><td>Hampton Research</td><td>HR7-104</td><td></td></tr><tr><td>来自丹尼尔薯蓣果的索马甜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7630</td><td></td></tr><tr><td>来自嗜热蛋白解芽孢杆菌 rokko 的嗜热菌蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1512</td><td></td></tr><tr><td>JCSG-plus HT-96 筛选试剂盒</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-40</td><td>用于机器人建立的筛选</td></tr><tr><td>PACT premier HT-96 筛选试剂盒</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-36</td><td>用于机器人建立的筛选</td></tr><tr><td>Morpheus HT-96 筛选试剂盒</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-47</td><td>用于机器人建立的筛选</td></tr><tr><td>Crystal Ph&amp;#8211;nix 液体处理系统</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>602-0001-10</td><td></td></tr><tr><td>晶种珠试剂盒</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-320</td><td></td></tr><tr><td>双目光学立体显微镜</td><td>Leica</td><td>M165C</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2646-100EA</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne 0.1–2.5 &amp;mu;l 移液器</td><td>Starlab</td><td>S7100-0125</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne 2–20 &amp;mu;l 移液器</td><td>Starlab</td><td>S7100-0221</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne 100–1000 &amp;mu;l 移液器</td><td>Starlab</td><td>S7100-1000</td><td></td></tr><tr><td>JCSG-plus 筛选试剂盒</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-37</td><td>用于手工建立的筛选</td></tr><tr><td>PACT premier 筛选试剂盒</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-29</td><td>用于手工建立的筛选</td></tr><tr><td>Morpheus 筛选试剂盒</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-46</td><td>用于手工建立的筛选</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5415-1EA</td><td></td></tr><tr><td>CrystalClene 18 mm 盖玻片</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD4-17</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 玻璃巴斯德吸管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z722669</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-360</td><td></td></tr><tr><td>24 孔 XRL 结晶板</td><td>Molecular Dimensions Limited</td><td>MD3-11</td><td>用于手工建立的筛选</td></tr><tr><td>30% (w/v) PEG 8000，0.2 M 硫酸铵，0.1 M 二甲胂酸钠，pH 6.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20% (w/v) PEG 8000，0.2 M 醋酸镁，0.1 M 二甲胂酸钠，pH 6.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20% (w/v) PEG 6000，100 mM 柠檬酸，pH 5.0</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过随机微晶种子矩阵筛选提高蛋白质结晶成功率

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

随机微晶种子矩阵筛选（rMMS）是一种蛋白质结晶技术，该方法将晶种加入随机筛选条件中。通过提高晶体在蛋白质相图亚稳区生长的可能性，通常可获得更多的结晶条件，提升所获晶体的质量，并为数据收集和浸泡实验提供充足的晶体资源。本文介绍一种通用的rMMS方法，适用于坐滴或悬滴蒸气扩散实验，可通过手工操作或液体处理机器人建立，适用于96孔或24孔板格式。

（A）rMMS 实验示例
为了验证rMMS筛选方法的有效性，我们将该方法应用于鸡蛋清溶菌酶（HEWL）和牛肝过氧化氢酶（BLC）的结晶。这两种酶均极易结晶，且其结构已被充分表征15, 16，因此是展示rMMS所能实现的更高结晶成功率的理想测试对象。结晶实验采用96孔坐滴板格式，并通过液体处理机器人完成。将两种酶的冻干粉末分别溶解于20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、pH 7.5的缓冲液中，配制成终浓度分别为100 mg/ml和20 mg/ml的蛋白溶液。针对每种蛋白，分别使用三种包含96种条件的结晶筛选试剂盒：JCSG、PACT和Morpheus。非微晶接种的结晶筛选采用50 μl的储液体积，坐滴体积为2 μl，由1 μl蛋白溶液与1 μl储液混合而成。六块结晶板被置于18 °C恒温房间中，并每日使用双目光学显微镜进行观察，记录任何晶体生长的迹象。五天后，从每块板中选择一个能够支持晶体物质生长的条件，用于制备微晶种子储备液。rMMS筛选的操作流程与非rMMS筛选相同，唯一区别在于坐滴体积为2.5 μl，包含1 μl蛋白溶液、1 μl储液和0.5 μ...

本文介绍了一种通用的随机微晶种子矩阵筛选方法。该技术可显著提高蛋白质结晶筛选实验的成功率，减少后续优化的需要，并为数据收集及配体浸泡实验提供稳定可靠的晶体来源。

随机微晶种基质筛选（rMMS）是一种蛋白质结晶技术，该技术将晶种加入随机筛选条件中。通过增加……

本实验的总体目标是提高从蛋白质结晶筛选实验中获得的蛋白质晶体的数量和衍射质量。为此，首先从利用目标蛋白质已建立的蛋白质结晶筛选实验中识别出晶体或沉淀物，收集该晶体或沉淀材料，并用于制备晶种储备液。随后，设置一系列包含目标蛋白质和晶种的结晶筛选实验。最后，监测接种结晶筛中的晶体形成情况，并对任何新生成的蛋白质晶体进行表征。最终，应用此方法可增加从结晶筛实验中获得的蛋白质晶体的数量、尺寸以及衍射质量。与现有方法（例如传统的微接种或宏接种）相比，该技术的主要优势在于操作快速、具有高度可扩展性，并且相较于其他接种方法能够显著探索更广泛的结晶空间。该技术的另一个优势在于，它不需要使用高质量的结晶起始材料来制备晶种。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为在晶体收获和操作步骤中需要较高的手动操作技巧。本方法的可视化演示至关重要，因为随机基质微晶接种法与其他晶体接种方法存在显著差异。该方法的细微之处是成功的关键，其中许多细节难以通过文字准确传达。必须使用坐式结晶板，并在双目显微镜或晶体成像系统下开始此操作。在最初一周内，每天检查结晶板一次。此后每周记录一次晶体大小。一旦确认晶体不再继续生长，即从培养板中选择一个或多个合适的孔用于收集晶体材料。在种子晶体制备过程中，可使用任何晶体材料，包括细针状晶体、片状晶体、微晶以及形状不规则或发育不良的晶体。较陈旧的材料更可能部分交联，因此不太适合用于接种实验。收获当天，使用本生灯将玻璃巴斯德移液管加热，制成圆头探针。操作时，将移液管中部附近加热至变软即可。然后迅速将其从火焰中取出，并通过拉开两端将其拉伸。目标是在玻璃管直径约为0.25毫米处，将其拉至直径小于0.25毫米。折断玻璃管，并将断裂端短暂浸入火焰中。重复此过程，直至末端形成直径约为 0.75 毫米的玻璃半球。将含有种子微珠的 1.5 毫升微量离心管置于冰上。接着，打开选定的结晶板。对于24孔悬滴培养板，使用一对镊子取下盖玻片，然后将盖玻片倒置并放置在稳定且洁净的表面上。适用于96孔坐滴板。使用手术刀在选定孔顶部的塑料封膜上进行环切，然后用镊子将切下的封膜部分移除。吸取50 µL储液，转移至含有晶种珠的微量离心管中，确保该管在整个操作过程中始终置于冰上。此操作中最困难的环节是晶种储备液的制备。必须严格按照所述方法精确操作，并尽可能快速完成。在显微镜下观察样本的同时，使用探针彻底碾碎种子材料，并尽可能充分回收。使用先前准备好的玻璃探针，将盖片上的晶体彻底碾碎。滴落液滴。微小晶体可能需要数分钟才能彻底压碎。易于压碎的晶体未发生交联，且不是盐晶体。尽管盐晶体在被压碎时会产生一种独特的声音，这种声音可以被听到并感受到。接下来，从种子珠管中取出五微升储液，转移至相应的亚孔中用于坐滴实验，或转移至含有待收获晶体材料的盖玻片上用于悬滴实验。将此液体上下吹打5到6次，以尽可能充分重悬亚孔或盖玻片中的内容物。将悬浮液重新转移回晶种珠管中，并重复此步骤两次，确保尽可能多地收获结晶物质。涡旋振荡晶种珠2分钟，每30秒停止一次，将管置于冰上冷却。在含有储液溶液的1.5毫升离心管中进行。进行系列稀释，将种子储备液在储液中逐级稀释，每步稀释倍数为4至10倍。如果种子、储备液及稀释液不会立即使用，请将10至20微升的分装样品置于负20摄氏度或负80摄氏度冰箱中保存。一旦冷冻，种子储备液可长期保存，直至需要时使用。RMMS 结晶筛选可采用 24 孔板进行悬滴蒸气扩散法，或采用 96 孔板进行坐滴蒸气扩散法。在 24 孔悬滴板中进行 MMS 筛选时，使用移液器将 10 毫升单管格式的 96 种条件结晶筛选液中的每种条件各 300 微升，手动转移至 4 块 24 孔板的各个孔中。从每个 300 微升储液槽中，将一微升的每种结晶条件溶液转移至已去除前后两面保护背衬条的相应塑料盖玻片表面，盖玻片表面预先经充分涂油处理。在盖玻片上加入一微升蛋白质溶液，随后加入 0.5 微升晶体种子原液。在 RMMS 的第一轮中，切勿使用稀释后的种子溶液。因为种子浓度越高，获得结晶的几率就越大。将每个盖玻片翻转，使液滴朝下，并置于相应位置上方。向下按压盖玻片，压缩顶部的真空脂，形成牢固的密封。当所有96个液滴形成后，将该试剂盘转移至4至18摄氏度的培养箱或恒温房间中储存。为在96孔坐滴试剂盘中进行MMS筛选，可使用结晶机器人或八通道移液器，将96条件结晶筛选板（深孔块格式）中每种条件的20至50微升转移至结晶试剂盘中对应的各个孔内。接下来，向液滴中加入1.0 µL蛋白溶液、1.0 µL结晶条件液和0.5 µL晶种储备液。用透明封口膜密封结晶板，将其转移至4至18°C的培养箱或恒温房间中进行储存。实验建立后，需在最初五天内每天观察一次，随后在最长四周的时间内每七天观察一次，使用双目显微镜或晶体成像系统进行检查。依次检查每个子孔或盖玻片，记录任何晶体形成的迹象。将我们的MMS筛选实验结果与非ED筛选结果进行比较，并记录任何差异。可能需要观察多个RMMS循环。在获得适合进行额外循环的最优化衍射质量晶体之前。根据需要使用保存的稀释种子储备液来控制每个孔中的晶体数量。为了证明 RMMS 的有效性，将筛选方法应用于每种蛋白质（人源蛋白、白色溶菌酶和牛肝催化剂）在 3 个 96 条件下的结晶过程。采用 J-C-S-G-P-A-C-T 和 Morpheus 进行结晶筛选。五天后，从每个结晶板中选择一种能够支持晶体材料生长的条件，用于制备晶种储备液。五天后，对结晶板进行观察，记录含有晶体的液滴数量。该图总结了本实验的结果，并对鸡蛋清溶菌酶进行了定量分析。当对该蛋白质应用RMMS时，与非ED培养皿相比，结晶成功率提高了4到10倍。值得注意的是，对于牛肝过氧化氢酶，在Morpheus筛选中仅发现一个条件能够形成晶体，而使用RMMS后则鉴定出55个条件。此外，在所有情况下，无论使用何种结晶筛选方法，采用JCSG和PACT筛选体系分别使牛肝过氧化氢酶结晶的成功率提高了三倍和两倍；而且无论采用何种结晶筛选试剂盒，本研究的MMS筛选所获得的晶体总数均显著高于非RMMS筛选。我们得出结论：本研究所建立的MMS方法是一种简单而高效的策略，可显著提高蛋白质结晶筛选实验的成功率。观看本视频后，您应能够充分掌握如何开展随机微晶种子矩阵筛选实验，包括晶体材料的识别与收集、晶种悬液的制备，以及最终的接种结晶实验的建立。一旦掌握，该技术将可广泛应用。该技术可在一小时内完成。使用液体处理机器人进行随机矩阵微晶接种筛选实验时，耗时约一小时；而手动操作则大约需要三小时。在进行此操作时，重要的是确保所有接种后的结晶筛选板在储存前均已密封良好。

improving-success-rate-protein-crystallization-random-microseed

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

提高蛋白质结晶的成功率随机Microseed矩阵筛选

评估二维（2D）结晶实验以形成有序的膜蛋白阵列，是电子晶体学中一项极为关键且困难的任务。本文介绍了我们用于筛选和鉴定主要分子量在15–90...

通过电子晶体学评估小膜蛋白的二维结晶实验以用于结构生物学研究

分子的三维结构能够提供其功能机制的独特理解。在接近原子分辨率下测定结构的主要方法是X射线晶体学。本文中，我们将演示当前获得适用于X射线晶体学结构解析的任意大分子三维晶体的方法。...

用于X射线晶体学的蛋白质结晶

本方案描述了从膜蛋白在立方相脂质中的重组开始，获得可用于衍射分析的晶体所需的关键步骤，包括利用LCP-FRAP预结晶实验筛选初始条件、设置LCP结晶试验以及晶体的收获。...

膜蛋白在脂质介相中的结晶

本文描述并讨论了用于常规制备大量筛选板及纳升级结晶液滴以进行蒸汽扩散实验的自动化系统与方案。...

MRC分子生物学实验室大分子结晶的自动化方案

通过晶体学对生物大分子进行结构研究需要高质量的晶体。本文我们展示了一种可用于OptiCrys（由我们实验室开发的全自动仪器）和/或微透析装置的实验方案，该方案基于对结晶相图的理解，用于生长大尺寸、高质量的晶体。...

优化用于中子大分子晶体学的晶体生长

本文介绍了一种利用微晶接种法在稀疏矩阵筛选中生成经I3C（5-氨基-2,4,6-三碘间苯二甲酸）衍生物修饰的蛋白质晶体的方法。该方法可通过液体分配机器人或手工设置结晶板。...

使用随机微晶种子矩阵筛选法对蛋白质晶体进行I3C衍生化

本文的目的是使读者充分理解如何将小体积蒸气扩散法用于生长大尺寸单晶蛋白晶体的实验方案，转变为适用于序列晶体学的大体积批量微晶结晶方法。...

优化内切肽酶晶体生长以用于序列晶体学实验

本文介绍了如何在晶上晶装置上设置蛋白质结晶，以及如何利用芯片结晶平台在室温下进行自动化的序列数据收集。...

片上结晶与室温大规模连续衍射

本方案介绍了一种利用96孔高通量透析板筛选蛋白质结晶条件及晶体生长的简便方法。同时展示了使用透析管进行微晶大规模生长，适用于序列晶体学和微晶电子衍射（MicroED）应用。...

高通量蛋白质结晶的微透析方法 via Microdialysis

本方案详细描述了高通量结晶筛选实验的全过程，涵盖从1,536微孔板的制备到6周实验周期结束的各个步骤。内容包括样品准备、成像获取，以及用户如何利用人工智能驱动的图形用户界面快速高效地分析数据，识别大分子结晶条件。...

高通量筛选以获得蛋白质晶体学的晶体初筛结果

学习随机微晶种基质筛选技术以提高蛋白质结晶成功率。该方法通过制备晶种储备液并建立筛选体系，可显著增加晶体数量、改善衍射质量，为结构生物学研究提供可靠的晶体来源。

通过随机微晶种子矩阵筛选提高蛋白质结晶成功率

探索更多视频