通过随机微晶种子矩阵筛选提高蛋白质结晶成功率

本实验的总体目标是提高从蛋白质结晶筛选实验中获得的蛋白质晶体的数量和衍射质量。为此，首先从利用目标蛋白质已开展的结晶筛选实验中识别出晶体或沉淀物质，收集该晶体或沉淀物，并用于制备晶种储备液。随后，设置一系列包含目标蛋白质和晶种的结晶筛选实验。

最后，需监测接种结晶筛板中晶体的形成情况，并对任何新形成的蛋白质晶体进行表征。最终，应用该方法可增加从结晶筛实验中获得的蛋白质晶体的数量、尺寸以及衍射质量。与现有方法（例如传统的微接种或宏接种）相比，该技术的主要优势在于操作快速、具有高度可扩展性，并且相较于其他接种方法能够显著探索更广泛的结晶空间。

该技术的另一个优势在于，种子晶体制备无需使用高质量的单晶起始材料。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为在晶体收获和操作步骤中需要较高的手动操作技巧。由于随机基质微晶接种法与其他晶体接种方法存在显著差异，因此对该方法进行直观演示至关重要。

该方法的细微之处对于成功至关重要，其中许多细节仅通过文字形式难以准确传达。必须使用放置在二目显微镜或晶体成像系统下的结晶托盘开始此操作。在最初一周内，每天检查托盘一次。

此后每周记录一次晶体大小。一旦确认晶体不再继续生长，即从培养板中选择一个或多个合适的孔用于收集结晶物质。在制备晶种储备时，可使用任何形态的晶体材料，包括细针状晶体、片状晶体、微晶以及形状不规则或发育不良的晶体。

较陈旧的材料更可能已发生部分交联，因此不太适合用于接种实验。收获当天，使用本生灯将玻璃巴斯德移液管加热，制成圆头探针。具体操作为：将移液管靠近中部位置加热，直至其变软。

然后迅速将其从火焰中取出，并通过拉伸两端将其拉开。目标是在玻璃管直径约为 0.25 毫米处将其拉至直径小于 0.25 毫米。折断玻璃管，并将断裂端短暂浸入火焰中。

重复此过程，直至在末端形成直径约为 0.75 毫米的玻璃半球。将含有种子微珠的 1.5 毫升微量离心管置于冰上。接着，打开选定的结晶板。

对于24孔悬滴培养板，使用一对镊子取下盖玻片，然后将盖玻片翻转并放置在稳定且洁净的表面上。

适用于96孔坐滴板。使用手术刀在选定孔顶部的塑料封膜上进行环切，然后用镊子移除切下的封膜部分。吸取50 µL储液，转移至含有晶种微珠的微量离心管中，确保该管在整个操作过程中始终置于冰上。此操作中最困难的环节是晶种储备液的制备。

必须严格按照所述方法并尽快完成此步骤。在显微镜下观察样本的同时，注意用探针充分研磨种子材料，并尽可能回收全部物质。使用先前准备好的玻璃探针，充分研磨盖玻片上的晶体。

滑落液滴。微小晶体可能需要数分钟才能彻底压碎。容易压碎的晶体未发生交联，且不是盐晶体。

尽管盐晶体在被压碎时会产生一种独特的声音，这种声音可以被听到并感受到。接下来，从种子微珠管中取出五微升储液，转移至对应的小孔中用于坐滴实验，或转移至含有待收获晶体材料的盖玻片上用于悬滴实验。将此液体上下吹打五到六次，以尽可能重悬小孔或盖玻片中的全部内容物。

将悬液重新移回晶种珠管中，并重复此步骤两次，确保尽可能多地收获结晶物质。涡旋振荡晶种珠2分钟，每30秒停止一次，将管置于冰上冷却。在含有储备溶液的1.5毫升离心管中进行。

制备稀释系列，将种子原液在储液中逐级稀释，每步稀释倍数为4至10倍。如果种子原液及稀释液不立即使用，可将10至20微升分装至-20摄氏度或-80摄氏度冰箱中保存。一旦冷冻，种子原液可长期保存，直至需要时使用。

可以使用24孔板结合悬滴蒸汽扩散法，或使用96孔板结合坐滴蒸汽扩散法进行RMMS结晶筛选。若要在24孔悬滴板中进行MMS筛选，需用移液器将96种条件结晶筛选溶液中的每种条件各300微升，从10毫升单管装溶液中手动转移至4块24孔板的每个孔中。

从每个300微升储液槽中，将一微升的每种结晶条件溶液转移至已去除正反面保护背条的塑料盖玻片表面，盖玻片表面预先均匀涂覆脱模剂。在盖玻片上加入一微升蛋白溶液，随后加入0.5微升晶体种子原液。在RMMS的第一轮中，切勿使用稀释后的种子溶液。

因为种子浓度越高，获得结晶的几率就越大。将每个盖玻片翻转，使液滴朝下，并置于相应位置上方。向下按压盖玻片，压缩封固油脂，形成牢固的密封。

当所有96个液滴形成后，将该板转移至4至18摄氏度的培养箱或恒温房间中储存。为在96孔坐滴板中进行MMS筛选，使用结晶机器人或八通道移液器，将96条件结晶筛选试剂盒（深孔块格式）中每种条件的20至50微升转移至结晶板中对应的各个孔内。

接下来，向液滴中加入1.0 µL蛋白溶液、1.0 µL结晶条件溶液以及0.5 µL晶种储备液。使用透明封板膜密封结晶板，并将其转移至4至18°C的培养箱或恒温房间中进行储存。实验建立后，需在最初五天内每天观察一次，随后在最长四周的时间内每七天观察一次，使用体视显微镜或晶体成像系统进行检查。依次检查每个子孔或盖玻片，并记录任何晶体形成的迹象。

将我们的MMS筛选实验结果与非ED筛选结果进行比较，并记录任何差异。可能需要进行多轮RMMS实验。在获得适合衍射的优质晶体之前，需完成额外的循环。

根据需要使用保存的稀释种子储备液，以控制每个孔中的晶体数量。为证明RMMS的有效性，将筛选方法应用于血红蛋白、白色溶菌酶和牛肝过氧化氢酶的结晶，每种蛋白质均测试了3 × 96种条件。

使用 J-C-S-G-P-A-C-T 和 Morpheus 进行结晶筛选。五天后，从每个结晶板中选择一个能够支持晶体材料生长的条件，用于制备晶种储备液。五天后，检查结晶板并记录含有晶体的液滴数量。

该图总结了本实验的结果，并对鸡卵清溶菌酶进行了定量分析。当对该蛋白质应用RMMS时，与非ED培养板相比，结晶成功率提高了4到10倍。值得注意的是，对于牛肝过氧化氢酶，在Morpheus筛选中仅发现一个条件能够产生晶体，而应用RMMS后则鉴定出55个条件能够产生晶体。

此外，在所有情况下，无论使用何种结晶筛选试剂盒，采用 JCSG 和 PACT 筛选试剂盒进行牛肝蛋白结晶的成功率分别提高了三倍和两倍。而且，无论使用何种结晶筛选条件，我们的随机微晶接种矩阵筛选（MMS）所获得的晶体总数均显著高于非 RMMS 筛选。我们得出结论：本研究所建立的 MMS 方法是一种简单而高效的策略，可显著提高蛋白质结晶筛选实验的成功率。观看本视频后，您应能够充分掌握如何开展随机微晶接种矩阵筛选实验，包括晶体材料的识别与收集、晶种悬液的制备，以及最终的接种结晶实验的建立。一旦掌握，该方法将非常实用。

该技术可在一小时内完成。使用液体处理机器人进行随机矩阵微晶接种筛选实验时，耗时约一小时；而手动操作的实验则大约需要三小时。在进行此操作时，重要的是确保所有接种后的结晶筛选板在储存前均已妥善密封。