Name: 表面钝化单分子蛋白质研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 学习使用聚乙二醇两步涂层法对石英玻片进行表面钝化处理，以减少单分子荧光成像中的非特异性蛋白吸附。该方法通过氢氧化钾蚀刻和氨基功能化实现高质量表面钝化。

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S.D.C.、A.C.H. 和 C.J. 获得了欧洲研究理事会（ERC-StG-2012-309509）的启动资助项目支持。J.-M.N. 获得了韩国国家研究基金会（NRF）（2011-0018198）以及由韩国未来创造科学部（MSIP）资助的先锋研究中心计划（2012-009586）的支持。本工作还得到了韩国未来创造科学部（MSIP）资助的全球前沿项目“生物纳米健康卫士中心”（H-GUARD_2013-M3A6B2078947）的支持。Y.K.L. 和 J.-H.H. 获得了韩国首尔市首尔科学奖学金计划的支持。标记的 Rep 蛋白由 Sua Myong 博士慷慨赠予。

1. 载玻片的准备与清洁
微流控腔室由石英载玻片和盖玻片组成。在棱镜型全内反射荧光（TIRF）显微镜中，成像的是石英载玻片的表面。因此，使用 H2O、丙酮、KOH 和 piranha 溶液对石英载玻片进行彻底清洗至关重要。这种多步清洗可去除表面的荧光有机分子，避免其干扰单分子荧光测量。此外，piranha 蚀刻通过生成羟基使石英表面具有亲水性。这些游离的羟基基团对于第 3 步中的氨基硅烷化反应至关重要。
<ol>
	<li>钻孔石英载玻片。使用直径为3/4 mm的金刚石钻头在石英载玻片上钻一对孔（图2a）。若需要多个通道，可钻更多对孔（图2b）。这些孔用于在第7步中向微流控腔室注入溶液。
	<ol>
		<li>钻孔过程中保持钻头浸润在H2O中。H2O起到润滑作用，可延长钻头使用寿命。</li>
		<li>偶尔擦拭钻头尖端有助于提高钻孔效率。</li>
		<li>钻孔完成后，在载玻片一侧做标记，以便在PEG化过程中便于识别。这些标记可作为参考，避免后续操作中混淆。标记时可使用金刚石钻头。请勿使用任何笔，因为墨水可能污染表面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用H2O清洗。将载玻片放入玻璃染色缸中。通常一个染色缸可放置5至15片载玻片。用MilliQ H2O冲洗载玻片，重复3次，并用MilliQ H2O超声清洗5分钟以去除污物。弃去水后，再用MilliQ H2O冲洗3次。注意：本方案使用的超声功率为130 W。更高的超声功率可能会缩短石英载玻片的使用寿命。</li>
	<li>用丙酮清洗。将MilliQ H2O替换为丙酮，用丙酮超声清洗载玻片20分钟或更长时间。</li>
	<li>用H2O冲洗。弃去丙酮，用MilliQ H2O冲洗载玻片，重复3次，以彻底去除丙酮残留。</li>
	<li>用KOH清洗。将水替换为1 M KOH，并超声清洗20分钟或更长时间。过度蚀刻（例如过夜KOH处理）虽可提升表面质量，但可能引入划痕，进而干扰荧光成像。</li>
	<li>用H2O冲洗。用MilliQ H2O冲洗载玻片3次，以去除残留的KOH。</li>
	<li>浓硫酸-过氧化氢混合液（Piranha）蚀刻。
	<ol>
		<li>将载玻片转移至Duran载玻片架或自制的聚四氟乙烯（Teflon）载玻片架中，并将其放入位于通风橱内的烧杯（1 L）中。</li>
		<li>向烧杯中加入450 ml H2SO4。</li>
		<li>加入150 ml H2O2，使H2SO4与H2O2的比例为3:1。一旦溶液开始自发沸腾，温度将升至90 °C以上。确保在开始反应前H2O2溶液处于室温，否则沸腾溶液的温度可能低于90 °C。</li>
		<li>搅拌溶液以确保充分混合，然后静置20分钟。</li>
		<li>连同载玻片架一起将载玻片从Piranha溶液中取出，并转移至盛有MilliQ H2O的载玻片架中。同时，待Piranha溶液冷却至室温后，将其倒入指定的废液瓶中。</li>
		<li>用MilliQ H2O冲洗载玻片3次。后续步骤中需格外小心，避免载玻片受到任何可能的污染。继续进行第3步。建议立即进行后续操作。 
		* 警告：Piranha溶液具有极强反应性，操作时必须格外谨慎。此外，若不慎与丙酮等有机溶剂混合，可能引发爆炸。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 盖玻片清洗
微流控腔室由石英载玻片和盖玻片组成。当使用棱镜型全内反射荧光（TIRF）显微镜时，盖玻片的表面不会被成像，因此仅用 H2O 和 KOH 清洗盖玻片即可。如果需要对盖玻片表面进行成像（例如通过物镜型 TIRF 显微镜），则建议使用芬太那溶液处理盖玻片（步骤 1.7）。需要注意的是，如果盖玻片表面的 PEG 修饰质量不佳，可能会成为蛋白质的吸附位点，导致蛋白质浓度出现波动。
<ol>
	<li>用 H2O 清洗。将盖玻片（24 × 30、24 × 40 或 24 × 50 mm2）放入玻璃染色缸中。通常一个染色缸可放置 5 至 15 片盖玻片。用 MilliQ H2O 将盖玻片清洗 3 次。</li>
	<li>用 KOH 清洁。将水替换为 1 M KOH，并对盖玻片进行超声处理 20 分钟或更长时间。</li>
	<li>用 H2O 清洗。用 MilliQ H2O 将盖玻片清洗 3 次，以去除残留的 KOH。然后继续进行第 3 步。</li>
</ol>
3. 载玻片和盖玻片的氨基硅烷化
通过氨基硅烷化化学反应，在石英载玻片和盖玻片表面引入氨基官能团。甲醇用作溶剂，乙酸用作氨基硅烷化反应的催化剂。
<ol>
	<li>用甲醇冲洗。将染色皿中的 MilliQ H2O（来自步骤 1 和 2）替换为甲醇。将载玻片和盖玻片保留在甲醇中，直至步骤 3.3。不要将载玻片和盖玻片在甲醇中存放过长时间（例如 数小时），因为甲醇中的杂质会吸附到表面。</li>
	<li>配制氨基硅烷化溶液。
	<ol>
		<li>用甲醇反复冲洗 Pyrex 烧瓶数次。用甲醇超声清洗烧瓶至少 5 分钟或更长时间。建议使用专用且保持洁净的烧瓶。</li>
		<li>向烧瓶中加入 100 ml 甲醇。</li>
		<li>加入 5 ml 冰醋酸。</li>
		<li>加入 3 ml APTES（3-氨丙基三甲氧基硅烷），轻轻摇动使其混合均匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>氨基硅烷化处理。将含有载玻片和盖玻片的染色皿中的甲醇替换为氨基硅烷化反应混合液。
	<ol>
		<li>孵育 20–30 分钟。孵育期间，进行一次 1 分钟的超声处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用甲醇冲洗。将氨基硅烷化反应液替换为甲醇。弃去甲醇，加入新鲜甲醇溶液。重复此步骤三次。</li>
</ol>
4. 使用聚合物进行表面钝化（第一轮）
通过将 NHS-酯聚乙二醇（PEG）与石英载片和盖玻片的胺基涂层表面进行偶联，实现表面钝化。该反应在 pH 8.5 条件下，使用饱和浓度的 PEG 溶液孵育过夜完成。
<ol>
	<li>干燥载玻片和盖玻片。使用 N2 气体干燥载玻片和盖玻片，并将其放入洁净的移液管盒中，确保需要进行 PEG 修饰的一侧朝上。在移液管盒中加入适量 MilliQ H2O，形成湿润环境，以防止 PEG 修饰溶液在过夜孵育过程中干燥。</li>
	<li>配制反应缓冲液。将 84 mg 碳酸氢钠溶解于 10 ml MilliQ H2O 中，配制 0.1 M 新鲜碳酸氢钠缓冲液（pH 8.5）。无需调节 pH。该溶液可冷冻保存以备后续使用（例如，步骤 6.1）。</li>
	<li>配制 PEG 修饰溶液。
	<ol>
		<li>在 1.5 ml 离心管中配制 PEG 混合物，包含 0.2 mg 生物素化 NHS-酯 PEG（5,000 Da）13 和 8 mg NHS-酯 mPEG（5,000 Da）。若需处理 N 张载玻片，则在单个离心管中配制 N 倍量的 PEG 混合物。</li>
		<li>加入 64 µl（或处理 N 张载玻片时加入 N × 64 µl）新配制的缓冲液（步骤 4.2）。反复吹打以确保完全溶解。</li>
		<li>以 16,100 × g 离心 1 分钟以去除气泡。此后切勿再吹打，否则会重新引入气泡，干扰步骤 4.4 中的 PEG 修饰反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PEG 修饰。
	<ol>
		<li>取 70 µl PEG 修饰混合液滴加至步骤 4.1 中干燥的石英载玻片上。若使用 24 × 50 mm2 的盖玻片，则使用 90 µl。</li>
		<li>将步骤 4.1 中干燥的盖玻片轻柔地覆盖在溶液上。</li>
		<li>为获得均匀且高质量的 PEG 修饰，需避免引入气泡。由于表面张力作用，大多数气泡可在五分钟内自发从反应体系中逸出。</li>
		<li>将载玻片置于避光且湿润的环境中孵育。本实验所用 NHS-酯 PEG 在 pH 8 条件下的半衰期约为 1 小时。至少孵育 2 小时。过夜孵育可获得更高质量的 PEG 修饰效果（数据未显示）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 长期保存
将 PEG 修饰的载玻片和盖玻片在 -20 ºC 的 N2 环境中保存。
<ol>
	<li>干燥载玻片和盖玻片。小心地将盖玻片向一侧滑动，从而拆卸载玻片和盖玻片，用 MilliQ H2O 冲洗，并用 N2 吹干。</li>
	<li>储存载玻片和盖玻片。若需立即使用，请继续进行第二轮 PEG 化处理（步骤 6）。若需长期储存，请执行以下步骤。
	<ol>
		<li>将一对载玻片和盖玻片放入一个 50 ml 离心管中，确保 PEG 化表面彼此背向放置。</li>
		<li>将管盖部分旋紧，对管内抽真空，然后充入 N2。这些步骤有助于长期保持 PEG 化表面的质量。随后将管盖完全拧紧，并于 -20 °C 保存。载玻片的质量可保持长达 3 个月（图 3a，右侧）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 使用聚合物进行表面钝化（第二轮）
额外进行一轮 PEG 化反应，以使 PEG 层更加致密，并淬灭表面残留的任何氨基。使用较短的 NHS-酯 PEG 分子（333 Da）可能更有效地穿透已有的 PEG 层。建议在使用载玻片前立即进行第二轮 PEG 化。
<ol>
	<li>配制反应缓冲液。配制 0.1 M 的新鲜碳酸氢钠缓冲液（pH 8.5）。也可使用第 4.2 步中的冷冻溶液。</li>
	<li>配制 PEG 修饰溶液。将 7 µl 的 250 mM MS4-PEG 溶解于 63 μl 碳酸氢钠缓冲液中。</li>
	<li>PEG 修饰反应。按照第 4.4 步的相同操作进行。孵育 30 分钟至过夜。</li>
	<li>干燥载玻片和盖玻片。拆开载玻片与盖玻片的配对组件，用 MilliQ H2O 冲洗，用 N2 吹干，并存放于洁净的移液管盒中。随后进入第 7 步，组装微流控腔室。</li>
</ol>
7. 组装微流控芯片
使用一对PEG修饰的石英载玻片和盖玻片组装微流控腔室。双面胶带用作间隔物。腔室用环氧树脂胶密封，并通过石英载玻片上的孔引入溶液。
<ol>
	<li>将石英载玻片平放在表面上，使PEG修饰面朝上。</li>
	<li>通过在载玻片上粘贴双面胶带，在PEG修饰面上对角方向制作一个通道（宽度为5至7 mm）。确保孔洞位于通道中央。在制作腔室过程中注意不要损坏PEG修饰面。通过以不同方式放置和粘贴双面胶带，可制作多通道载玻片（见图2）。</li>
	<li>将PEG修饰的盖玻片轻轻放置在上方，完成腔室构建，PEG修饰面应朝下。</li>
	<li>通过按压盖玻片覆盖双面胶带区域来密封腔室。操作应轻柔但充分，确保腔室完全密封、不漏水。</li>
	<li>用环氧树脂胶密封腔室的边缘。</li>
	<li>使用p200移液器加入50 µl浓度为0.1 mg/ml的链霉亲和素（Streptavidin）或中性亲和素（Neutravidin）溶液（溶于T50缓冲液：10 mM Tris-HCl [pH8.0]，50 mM NaCl），使其固定在生物素化的PEG层上。孵育1分钟后，用100 µl T50缓冲液冲洗。</li>
	<li>加入用于单分子成像的生物素化生物分子。</li>
</ol>
8. 载玻片的重复利用
回收石英载玻片。使用过的载玻片通过移除盖玻片和双面胶带进行回收。
<ol>
	<li>使用后，将腔室存放在自来水中。长期浸泡在水中有助于腔室的拆卸。</li>
	<li>使用微波炉将腔室在自来水中煮沸。使用派热克斯（Pyrex）烧杯，煮沸10分钟或更长时间。</li>
	<li>用刀片取下盖玻片和双面胶带。切勿将石英载片垂直于其平面方向按压，否则会破裂。操作时刀片应远离微流道，以免在通道表面造成划痕。</li>
	<li>用家用洗涤剂并以手指轻轻擦拭，对载片进行清洗。</li>
	<li>将载片放入玻璃染色缸中。通常一个染色缸可放置5至15片载片。加入10%家用洗涤剂，并超声处理20分钟或更长时间。随后用大量自来水冲洗载片。</li>
	<li>进入步骤1.2。</li>
</ol>

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</ol>

我们没有需要披露的内容。

本方案中的关键步骤
在进行氨基硅烷化反应之前，必须使表面具有亲水性。这一目的通过 piranha 蚀刻实现，该过程可在玻璃/石英表面产生游离的羟基。建议不要将经过 piranha 蚀刻的表面长时间暴露于水（H2O）或空气中，因为表面的亲水性会逐渐下降。
NHS-酯类 PEG 分子具有反应活性。建议将其分装后在氮气环境中于 -20 ºC 保存。APTES 试剂在室温下的保存期限较短，建议每月更换新的试剂。
本实验方案的修改
当因实际原因无法使用 piranha 蚀刻时，可改用 KOH 长时间蚀刻（例如 过夜），此法同样可暴露羟基。该替代方法的缺陷在于，由于产生严重划痕，载玻片在数次重复使用后即无法继续使用。
通常采用丙烷喷灯灼烧玻璃/石英表面，这种方法可有效去除荧光性有机物7。本实验方案未包含此步骤，因其与 piranha 刻蚀步骤重复。需注意，该操作可能导致羟基发生氧化。因此，若表面已使用 KOH 或 piranha 溶液进行刻蚀，则不应再进行此操作。
当使用pH值低于7的缓冲液进行单分子成像时，聚乙二醇（PEG）的构象会从“蘑菇”状转变为“刷子”状，从而降低钝化程度。因此，当使用低于7.0的pH值时，建议使用二琥珀酰亚胺酒石酸酯进一步钝化表面7。
展望
本研究提供了一种实现高质量表面钝化的可靠方案。该方案将适用于涉及蛋白质14以及细胞提取物和免疫沉淀物中蛋白质复合物的单分子荧光研究15。它还将广泛用于其他单分子技术，如力谱和扭矩谱分析16。此外，该方案在防止细胞吸附到表面方面也具有重要应用价值17。
本工作中提供的方案因其多步操作而具有较高难度。使用脂质-PEG8和多聚赖氨酸-PEG9进行表面钝化是另一种可选方法。由于该方法无需任何化学反应，因此易于实施。然而，其钝化程度不如通过表面化学修饰所达到的效果高。

在进行单分子蛋白质研究时，必须实现高质量的表面钝化，以确保实验不受任何由表面引起的蛋白质功能异常或变性的影响1,2。尽管使用表面活性剂（如牛血清白蛋白）处理的玻璃表面常用于单分子核酸研究3，但其钝化程度尚不足以满足蛋白质研究的要求。而涂覆有聚合物（聚乙二醇，PEG）的玻璃表面在钝化性能上更为优越4-6，因此自其引入单分子荧光研究以来7-10，已成为单分子蛋白质研究中普遍采用的方法。该聚合物涂层过程需要经过多步表面处理7,11,12，因此若无详细操作说明，很难完整准确地执行整个流程。通常，表面钝化的程度会因所采用的具体方案不同而有所差异。本文提供了一个稳健的、分步详述的操作流程，旨在消除单分子蛋白质研究中的主要瓶颈之一。整体流程参见图1。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1. 载玻片的制备与清洗&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma</td><td>32201</td><td>1 L</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>631-0136 631-0144 631-0147</td><td>24 × 32 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;、22 × 40 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;、24 × 50 mm&lt;sup&gt;2 &lt;/sup&gt;&amp;nbsp;（No.1&amp;frac12;，矩形）</td></tr><tr><td>金刚石钻头</td><td>MTN-Giethoorn, 荷兰</td><td>LA-0564-00DB</td><td>3/4 mm</td></tr><tr><td>Duran 载玻片架</td><td>LGS, 荷兰</td><td>213170003</td><td></td></tr><tr><td>玻璃染色缸</td><td>Fisher Scientific</td><td>300101</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Boom</td><td>6233905</td><td>1 L，30% 过氧化氢。&lt;br/&gt;开启后的瓶装试剂应储存于 4 &amp;deg;C。</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Boom</td><td>80900627.9010</td><td>硫酸，95–98%</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>30603</td><td>氢氧化钾</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td>1 L</td></tr><tr><td>超声波清洗仪</td><td>Branson</td><td></td><td>台式超声波清洗器，3510</td></tr><tr><td>石英载玻片</td><td>Finkenbeiner</td><td></td><td>1&amp;rdquo; × 3&amp;rdquo;，厚度 1 mm</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2. 盖玻片清洗&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Duran 载玻片架</td><td>LGS, 荷兰</td><td>213170003</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>30603</td><td>氢氧化钾</td></tr><tr><td>超声波清洗仪</td><td>Branson</td><td></td><td>台式超声波清洗器，3510</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;3. 载玻片与盖玻片的氨基硅烷化处理&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma</td><td>320099-500ML</td><td>冰乙酸</td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778-100ML</td><td>3-氨基丙基三甲氧基硅烷。&lt;br /&gt;在氮气&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;保护下室温保存，每月更换一次。</td></tr><tr><td>烧瓶（200 ml）</td><td>VWR</td><td>Flask (200 ml)</td><td>Pyrex 烧瓶。&lt;br/&gt;专用于氨基硅烷化处理的烧瓶。</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td>1 L</td></tr><tr><td>超声波清洗仪</td><td>Branson</td><td></td><td>台式超声波清洗器，3510</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;4. 使用聚合物进行表面钝化（第一轮）&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>生物素-mPEG</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SVA-5000-100mg</td><td>生物素-PEG-SVA，分子量 5,000&amp;nbsp;Da。&lt;br /&gt;分装 1–2 mg（足够处理 10 片载玻片）后，于 -20 &amp;deg;C 在氮气&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;保护下保存。</td></tr><tr><td>mPEG</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000-1g</td><td>mPEG-琥珀酰亚胺基戊酸酯（SVA），分子量 5,000 Da。&lt;br /&gt;分装 80 mg（足够处理 10 片载玻片）后，于 -20 &amp;deg;C 在氮气&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;保护下保存。</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;5. 表面钝化（第二轮）&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>二甲基亚砜 BioReagent，用于分子生物学，&amp;ge;99.9%</td></tr><tr><td>DST</td><td>Pierce</td><td>20589</td><td>二琥珀酰亚胺基酒石酸酯</td></tr><tr><td>MS4-PEG</td><td>Pierce</td><td>22341</td><td>短链 NHS-酯 PEG，分子量 333 Da。&lt;br /&gt;将 100 mg MS4-PEG 溶于 1.1 ml DMSO 中。分装 20 &amp;micro;l 于 -20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;6. 微流控腔室的组装&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>双面胶带</td><td>Scotch</td><td></td><td>10 mm 宽</td></tr><tr><td>环氧树脂</td><td>Thorlabs</td><td>G14250</td><td>Devcon 5 分钟快干环氧胶</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-1 KG</td><td>氯化钠</td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Pierce</td><td>31000</td><td>ImmunoPure NeutrAvidin 生物素结合蛋白。&lt;br /&gt;以 5 mg/ml 浓度溶于 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 中，4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>链霉亲和素</td><td>Invitrogen</td><td>S-888</td><td>储存浓度为 5 mg/ml，溶于 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 或 T50 中，4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>Trizma 碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1 KG</td><td>Tris</td></tr></tbody></table>

单分子蛋白质研究中的表面钝化

Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies

单分子荧光光谱技术已被证明在理解纳米尺度下多种生物学现象方面具有重要作用。该技术为生物科学提供的典型成果包括对蛋白质-蛋白质以及蛋白质-核酸相互作用机制的深入认识。在单分子水平上研究蛋白质相互作用时，通常需要将蛋白质或其底物固定在玻璃表面，以便进行长期观测。然而，这种固定方式可能引入不必要的表面干扰效应。因此，必须对玻璃表面进行钝化处理，使其呈惰性。使用聚乙二醇（PEG）进行表面包被因其在防止蛋白质非特异性吸附于玻璃表面方面的优异性能而备受关注。然而，由于该聚合物包被过程涉及一系列复杂的表面处理步骤，并且要求最终表面完全不含任何荧光分子，因此操作难度较高。本文提供了一个可靠且详细的实验方案，包含逐步操作说明，涵盖表面清洗（包括piranha溶液蚀刻）、氨基官能化修饰以及最终的PEG包被。为了获得高密度的PEG涂层，我们提出了一种新的策略，即分两轮对表面进行PEG分子处理，显著提高了钝化质量。我们还针对每个关键步骤提供了代表性结果和实用建议，使任何研究人员均可实现高质量的表面钝化。

在完成微流控室组装（步骤 7.1 - 7.6）后、执行步骤 7.7 之前，建议对 PEG 修饰的表面进行质量控制。
如果表面钝化成功，则在向腔室中加入1-10 nM荧光标记蛋白后，每个成像区域（25 mm × 25 mm）内非特异性吸附的蛋白质少于10个（图3a，左）。
如果清洗或反应步骤中的任何一步未正确执行，非特异性吸附的蛋白质数量会显著增加，CCD 屏幕可能因荧光信号而饱和。例如，若跳过piranha蚀刻步骤，则观察到的非特异性吸附量会增加约100倍（图3a；比较左侧与中间）。若跳过第二次PEG化步骤，则观察到的非特异性吸附量大约增加3倍（图3b）。当使用过期试剂（例如 在室温下存放数月的APTES）时，PEG化程度显著降低（数据未显示）。此外，在表面完成PEG化后若经过较长时间，其质量也会明显下降（图3a；比较左侧与右侧）。
据我们所知，这是首次将两轮 PEGylation 修饰用于单分子研究。两轮 PEGylation 可确保形成最高质量的 PEG 层（图 3b）。双层 PEGylation 的优越性在视频中表现尤为显著（比较 视频 1a 与 视频 1b）。在这些视频中，使用双层 PEGylation 时，溶液中荧光分子产生的背景信号明显更弱，表明双层 PEGylation 修饰层对蛋白的排斥作用更有效。尽管强烈建议采用这一两步法流程，但如果实验可容忍非最优钝化效果，第二步 PEGylation 步骤亦可省略。
<img alt="表面处理流程图，包含化学蚀刻、氨基硅烷化和聚乙二醇化步骤。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50549/50549fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1：表面处理示意图。（a）载玻片依次用丙酮、KOH和piranha溶液清洗，随后用APTES进行功能化修饰，并用NHS-酯基PEG进行聚乙二醇化。（b）盖玻片用KOH清洗，必要时 дополнительно使用piranha溶液清洗，随后同样用APTES进行功能化修饰，并用NHS-酯基PEG进行聚乙二醇化。 
 
<img alt="聚乙二醇化微流控芯片组装示意图：步骤流程、玻璃/石英载片、环氧树脂键合。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50549/50549fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2：微流控芯片。（a）单通道芯片。显微镜载玻片上有两个钻孔，使用两段双面胶带与盖玻片组装而成。（b）三通道芯片。显微镜载玻片上有六个钻孔，使用四段双面胶带与盖玻片组装而成。
<img alt="表面处理的显微镜图像：piranha蚀刻、PEG化效应、样品老化分析。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50549/50549fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3：使用溶液中标记染料的蛋白质所获得的CCD图像。（a）采用棱镜型全内反射荧光显微镜，结合60倍物镜，对含有10 nM Cy3标记Rep蛋白的溶液进行成像。（左）按照本文所述方案制备的表面。（中）按照本文所述方案制备表面，但跳过了piranha蚀刻步骤。（右）按照本文所述方案制备表面，并在氮气环境中于-20 ºC保存3个月。（b）使用含有10 nM Cy3标记Rep蛋白的溶液获得的CCD图像。（左）按照本文所述方案制备的表面。（右）按照本文所述方案制备表面，但跳过了第二轮PEG化步骤。比例尺 = 5 µm。
视频 1：溶液中染料标记蛋白质的 CCD 视频。采用棱镜型全内反射荧光显微镜，使用 60 倍物镜拍摄含有 10 nM Cy3 标记 Rep 蛋白溶液的 CCD 视频，时间分辨率为 100 毫秒。（a）表面制备按照本文所述实验方案进行。（b）表面制备按照本文所述实验方案进行，但省略了第二轮 PEG 修饰步骤。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50549/Movie1a.avi" target="_blank">点击此处</a>查看视频 1a，<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50549/Movie1b.avi" target="_blank">点击此处</a>查看视频 1b。

我们介绍了一种使用聚乙二醇（PEG）对玻璃表面进行钝化的方法。本方案涵盖了表面清洗、表面功能化以及PEG涂层的制备。我们提出了一种新的策略，即对表面进行两轮PEG分子处理，与现有方法相比，该方法可获得更高质量的钝化效果。

单分子荧光光谱技术已被证明在理解纳米尺度下多种生物现象方面具有重要作用。重要……

本实验的总体目标是获得高质量的官能化石英载玻片表面。首先使用水和丙酮清洗钻孔的石英载玻片和盖玻片，然后用氢氧化钾和piranha溶液对载玻片进行蚀刻，以提高表面质量。接下来，将载玻片和盖玻片用氨基进行功能化处理，随后使用聚合物对表面进行两轮处理，使玻璃表面呈惰性。最后一步是将载玻片和盖玻片组装成微流控腔室，使聚乙二醇（PEG）包被或经PEG修饰的表面相对放置。最终，通过两轮PEG分子处理表面的新策略显著提高了钝化质量，这一点在单分子荧光显微镜观察中得到了证实。该技术相较于现有技术（如氧化钾刻蚀后进行聚合物涂层）的主要优势在于能够确保更优的质量。由于需要进行多种表面处理，初学者在使用该方法时可能会遇到困难。开始操作前，请参照文本方案中的详细步骤准备石英载片。将载玻片放入玻璃染色缸中进行清洗。通常每个染色缸可放置5至15张载玻片。用UE水冲洗载玻片，重复冲洗三次后，再用UE水超声处理五分钟以去除污物，倒掉水后，再用UE水额外冲洗三次。接下来，将超纯水替换为丙酮，并用丙酮超声处理载玻片20分钟或更长时间，弃去丙酮，用Milli-Q水冲洗载玻片以去除任何残留的丙酮。随后，将水替换为1摩尔的氢氧化钾溶液，并超声处理载玻片20分钟或更长时间。过度刻蚀会提高表面质量，但可能引入划痕，从而干扰荧光成像。用 Milli Q 水冲洗载玻片三次，以去除氢氧化钾残留，从而进行 piranha 蚀刻。将载玻片转移至 Duran 载玻片架或自制的聚四氟乙烯架中，并放入位于通风橱内的 1 升烧杯中。向烧杯中加入 450 毫升浓硫酸。然后加入 150 毫升过氧化氢，使硫酸与过氧化氢的体积比为 3:1。搅拌溶液以充分混合，并将烧杯静置 20 分钟。将载玻片从 piranha 溶液中取出，放入盛有 millieu 水的载玻片架中。同时，将piranha溶液弃入指定的废液瓶中。待其冷却至室温后，在盖玻片清洗后用UE水冲洗载玻片三次。将染色缸中的UE水替换为甲醇。将载玻片和盖玻片保存在甲醇中。同时，通过将100毫升甲醇倒入烧瓶中来配制氨基硅烷化溶液。然后加入5毫升冰醋酸和3毫升3-氨基丙基三甲氧基硅烷，轻轻振荡混匀。将含有载玻片和盖玻片的染色皿中的甲醇替换为氨基硅烷化反应混合液。孵育20至30分钟，在孵育过程中超声处理一次，每次1分钟。接着用甲醇替换氨基硅烷化反应液，然后弃去甲醇并加入新鲜的甲醇溶液。对第一轮表面处理重复此步骤三次。首先使用聚合物，用氮气吹干载玻片和盖玻片。然后将其放入部分装有超纯水的洁净移液管盒中，确保需要进行聚乙二醇化的面朝上。接着，向制备好的聚乙二醇溶液中加入64 µL新配制的反应缓冲液。用移液器上下吹打混合物，以确保完全溶解。然后在16,100 G条件下离心1分钟。为去除气泡，将70微升的聚乙二醇化混合物滴加到干燥的石英载片上。将干燥的盖玻片轻轻放置在溶液上，将载玻片置于黑暗且湿润的环境中孵育2小时至过夜，以保存经聚乙二醇修饰的载玻片和盖玻片。通过将盖玻片沿侧面滑动，小心拆卸载玻片和盖玻片，并用超纯水冲洗，随后用氮气干燥。将一对载玻片和盖玻片放入50毫升离心管中，使聚乙二醇修饰的表面彼此相对远离。将管子部分关闭，在充入氮气前进行抽真空，然后拧紧管盖。于零下20摄氏度保存。这些步骤有助于长期保持聚乙二醇化表面的稳定性。在使用载玻片组装微流控腔室之前，立即按照文本方案中所述进行第二轮聚乙二醇化处理。将石英载玻片放置在平坦表面上，使聚乙二醇化的一面朝上。通过在载玻片上贴上双面胶带，在聚乙二醇化表面形成一个对角线方向的通道。确保孔洞位于通道的中央。然后将聚乙二醇化盖玻片轻轻放置在上方，以完成腔室的组装，注意聚乙二醇化面朝下。通过将盖玻片按压在双面胶带所在区域来密封样品室。操作时应轻柔但彻底，确保样品室完全密封且不漏水。最后，用环氧树脂胶封闭样品室的边缘。按照文本方案中的描述，继续固定链霉亲和素或NeutrAvidin，并加入生物素标记的生物分子以进行单分子成像。如果表面处理成功，则在每个成像区域观察到的非特异性吸附蛋白少于10个。当向样品池中加入1至10纳摩尔的荧光标记蛋白时，若任何清洗或反应步骤未正确执行，非特异性吸附蛋白的数量将显著增加。例如，若跳过piranha蚀刻步骤，则观察到的非特异性吸附量会增加100倍。双聚乙二醇化的优越性在此处得到显著体现。如左图所示，采用双聚乙二醇化时，来自荧光分子和溶液的背景信号明显更弱。这表明双聚乙二醇化层对蛋白质的排斥作用更有效。一旦掌握，若操作得当，该技术可在四小时内完成。切勿忘记，接触 AYA 可能具有极高危险性，因此在进行此操作时，必须始终采取适当的预防措施，如佩戴合适的手套、护目镜和围裙。

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科研

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Chemistry

化学

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