表面钝化单分子蛋白质研究
2014年4月24日
我们描述了使用聚乙二醇（PEG）的钝化玻璃表面的方法。该协议涵盖了表面清洗，表面功能化和PEG涂层。我们引进用于治疗表面与PEG分子过两轮，比现有的方法而产生钝化优质的新战略。
该程序的总体目标是产生高质量的石英载玻片表面。这是通过首先用水和丙酮清洁钻孔的石英载玻片和盖玻片来实现的。然后用氢氧化钾和食人鱼溶液蚀刻载玻片，以提高表面质量。
接下来，用胺基对载玻片和盖玻片进行官能化，然后使用聚合物进行两轮表面化，使玻璃表面呈惰性。最后一步是从载玻片和盖玻片组装微流体室，使聚乙二醇涂层或聚乙二醇化表面彼此相对。最终，通过单分子荧光显微镜观察到，用 peg 分子处理表面两轮的新策略显着提高了钝化质量。
该技术或现有技术（如氧化钾蚀刻后的聚合物涂层）的主要优点是该技术保证了卓越的质量。刚接触这种方法的人会很挣扎，因为必须进行多种服务治疗。要开始钻孔，石英幻灯片如文本协议中所述。
将载玻片放入玻璃染色罐中清洁载玻片。通常可以将 5 到 15 张载玻片放在一个罐子中。然后重复冲洗 3 次后，用 UE 水冲洗玻片，用 UE 水对玻片进行超声处理 5 分钟以去除污垢，处理掉水并用 UE 水再冲洗玻片 3 次。
接下来，用丙酮替换 UE 水，并用丙酮对玻片进行超声处理 20 分钟或更长时间，弃去丙酮并用 Milli Q 水冲洗玻片以去除任何丙酮残留物。接下来，用 1 摩尔氢氧化钾代替水，并对玻片进行 20 分钟或更长时间的超声处理。过度蚀刻会提高表面质量，但会引入划痕，这可能会干扰荧光成像。
用 Milli Q 水冲洗载玻片 3 次，以去除痕量氢氧化钾以进行食人鱼蚀刻。将玻片转移到 Duran 玻片支架或定制的 Teflon 支架上，然后将它们放入位于化学罩内的 1 升烧杯中。在烧杯中加入 450 毫升硫酸。
然后加入 150 毫升过氧化氢，使硫酸和过氧化氢的比例达到 3：1。搅拌溶液以适当混合，并将烧杯保持 20 分钟不受干扰。从食人鱼溶液中取出载玻片，将它们放入装有 millieu 水的载玻片架中。
同时，将食人鱼溶液倒入指定的废液瓶中 一旦达到室温，清洁盖玻片后，用 UE 水冲洗载玻片 3 次。用甲醇替换染色皿中的 UE 水。将载玻片和盖玻片保存在甲醇中。
同时，将 100 毫升甲醇倒入烧瓶中，制备氨基岛化溶液。然后加入 5 毫升乙酸和 3 毫升三氨基丙基、三甲基，摇晃轻轻混合。用氨基硅化反应混合物替换含有载玻片和盖玻片的染色皿中的甲醇。
孵育 20 至 30 分钟，孵育期间，超声处理一次，持续 1 分钟。接下来，用甲醇代替氨基岛化反应。然后弃去甲醇，加入新鲜的甲醇溶液。
对第一轮表面化重复此过程 3 次 首先使用聚合物，使用氮气干燥载玻片和盖玻片。然后将它们放入部分装满 milli Q 水的干净移液器盒中，使必须聚乙二醇化的一侧朝上。接下来，将 64 μL 新鲜制备的反应缓冲液加入制备好的 peg 溶液中。
上下移液混合物以使其完全溶解。然后以 16 G 和 100 G 离心 1 分钟。要去除气泡，请将 70 微升聚乙二醇化混合物滴到干燥的石英载玻片上。
轻轻地将干燥的盖玻片放在溶液上，将玻片在黑暗潮湿的环境中孵育 2 小时至过夜，以储存聚乙二醇化的玻片和盖玻片。小心地拆卸载玻片和盖玻片，将盖玻片滑到一侧，用 UE 水冲洗，然后用氮气干燥。将一对载玻片和盖玻片放入 50 毫升试管中，使聚乙二醇化表面彼此背对。
部分关闭管子并吸尘，然后用氮气填充并拧紧盖子。将其储存在零下 20 摄氏度。这些步骤有助于长时间保持聚乙二醇化表面。
在使用载玻片组装微流体室之前，立即按照文本协议中的说明进行第二轮聚乙二醇化。将石英载玻片放在平坦的表面上，聚乙二醇化的一面朝上。通过在载玻片上贴上双面胶带，在聚乙二醇化表面上对角线形成一个通道。
确保孔位于通道的中心。然后轻轻地将聚乙二醇化盖玻片放在顶部以完成腔室。聚乙二醇化面朝下。
将盖玻片压在放置双面胶带的区域上，密封腔室。轻柔但彻底地进行，使腔室变得密封、防水。最后，用环氧树脂胶封闭腔室的边缘。
继续固定链霉亲和素或中性 travain 并添加生物素化生物分子进行单分子成像，如文本方案中所述，如果表面化已成功完成，则观察到的每个成像区域少于 10 个非特异性吸收蛋白质。当 1 到 10 纳摩尔荧光标记的蛋白质加入腔室中时，当任何清洁或反应步骤未正确执行时，非特异性吸收蛋白质的数量会显著增加。例如，如果跳过食人鱼蚀刻，则观察到的非特异性吸收会增加 100 倍。
双聚乙二醇化的优越性质在这里得到了突出的展示。如左图所示，当使用双聚乙二醇化时，观察到来自荧光分子和溶液的背景信号要弱得多。这表明蛋白质被双聚乙二醇层更有效地排斥。
一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在四个小时内完成。不要忘记，使用 AYA 可能是极其危险的预防措施，例如在执行此程序时应始终佩戴适当的手套、护目镜和围裙。
概述
本文描述了一种使用聚乙二醇（PEG）钝化玻璃表面的新方法。该协议包括表面清洁、功能化以及两轮PEG涂层策略，以增强钝化质量。
关键研究组成部分
科学领域
- 表面钝化
- 微流体学
- 荧光显微镜
背景
- 钝化对于减少荧光成像中的非特异性结合至关重要。
- 传统方法可能无法提供最佳表面质量。
- PEG以其惰性特性而闻名，使其适用于此应用。
- 改进的表面处理可以提高实验结果。
研究目的
- 开发一种可靠的清洁和钝化玻璃表面的方法。
- 证明两轮PEG处理的有效性。
- 为研究人员提供详细的协议以供遵循。
使用的方法
- 用水和丙酮清洁石英载玻片。
- 用氢氧化钾和piranha溶液蚀刻。
- 用胺基功能化表面。
- 应用两轮PEG以确保高质量的钝化。
主要结果
- 两轮PEG处理显著改善了表面钝化。
- 单分子荧光显微镜显示非特异性结合减少。
- 正确执行协议可获得最佳结果。
- 未能遵循步骤可能导致非特异性蛋白吸附增加。
结论
- 所描述的方法为玻璃表面钝化提供了一种优越的替代方案。
- 研究人员可以使用此协议获得更好的成像结果。
- 清洁和处理过程中的注意细节至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
Surface passivation is a critical enabler for reliable single-molecule protein studies, directly impacting data quality in target interaction assays. Inadequate surface treatment introduces confounding non-specific binding, undermining mechanistic interpretation and increasing false-positive rates in early discovery. This protocol addresses a key technical bottleneck by delivering a robust, reproducible method to generate inert surfaces, thereby improving predictive confidence in downstream screening and validation workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables specific observation of protein-protein and protein-nucleic acid interactions by minimizing surface-induced artifacts.
- Operational Value: Provides a standardized surface preparation method that reduces variability across experiments and laboratories.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports assay readiness by ensuring low background (<10 non-specifically absorbed proteins per imaging area) for accurate ligand binding measurements.
- Operational Value: The two-round PEGylation strategy improves coating consistency, enhancing reproducibility in high-content screening formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by allowing precise quantification of binding kinetics and affinities in disease-relevant systems.
- Operational Value: Enables long-term storage of passivated slides at -20°C, supporting batch preparation and workflow continuity.
Pipeline & Workflow Integration
This surface passivation method fits within the early discovery continuum, specifically supporting target validation and assay development stages by providing a reliable foundation for single-molecule imaging.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing through clean visualization of specific biomolecular interactions without surface interference.
- Screening: Enables quantitative, reproducible readouts essential for comparing compound effects in primary and secondary screens.
- Analytics: Generates low-background fluorescence data that improves signal-to-noise ratio, facilitating accurate statistical analysis of binding events.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by ensuring that observed interactions reflect true biology rather than assay artifacts.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized surface preparation platform applicable across multiple projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing false positives from non-specific surface interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through a well-defined, step-by-step protocol with clear quality benchmarks.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by improving data reliability in early-stage target assessment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by providing higher-quality mechanistic data for lead selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry and fluorescence microscopy to execute multi-step treatments correctly.
- Dependent on access to piranha solution handling equipment and nitrogen gas for drying and storage.
- Necessitates standardized training to ensure consistent amine functionalization and double PEGylation across users.
- Must be adapted to different slide materials (e.g., quartz vs. standard glass) while maintaining PEG density and passivation quality.
- Limited by the hazardous nature of piranha solution, requiring strict safety protocols and waste management procedures.
